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常用於免疫熒光組織化學染色的熒光素

2013-10-16  發布者:admin 

常用於免疫熒光組織化學染色的熒光素有:異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate,TRITC)、四乙基羅丹明(tetraethyl rhodamine B200,RB200)、得克薩斯紅(Texas red)、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)、花青類(cyanine,如Cy3、Cy5)等。此外還有一些新型熒光染料,如量子點。

 
(1)異硫氰酸熒光素(FITC):FITC性質穩定,易溶於水和乙醇,能與蛋白質結合,是檢測組織細胞內蛋白質最常用的熒光探針。它還能標記抗體,可用於免疫組織化學單染或多重染色。缺點是在光照下易淬滅,易受自發熒光影響。最大激發光波長為490nm;最大發射光波長為525nm,呈現黃綠色熒光。
 
(2)四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC):該熒光素能與細胞內蛋白質結合,比FITC穩定性好,在生理條件下對pH值變化不敏感,熒光強度受自發熒光幹擾小。最大激發光波長為550nm;最大發射光波長為620nm,呈橙紅色熒光,與FITC發出的黃綠色熒光對比鮮明,常用於免疫熒光組織化學雙重染色。
 
(3)四乙基羅丹明(RB200):能與細胞內蛋白質結合,不溶於水,易溶於乙醇和丙酮,性質穩定,可長期保存,廣泛應用於雙標記示蹤染色。最大激發光波長為570nm,最大發射光波長為595-600nm,呈橙紅色熒光。
 
(4)花青類染料:常用的有Cy3、Cy5等,能與細胞內蛋白質結合。這類染料的熒光特性與傳統熒光素類似,但水溶性和對光穩定性較強,熒光量子產率較高,對pH等環境不敏感。常用於多重染色。Cy3最大激發光波長為570nm,最大發射光波長為650nm,呈綠色熒光。但是,在綠光光譜波長激發下,Cy3也可出現紅色熒光。Cy5的最大激發光波長為649nm,最大發射光波長為680nm,呈紅色熒光。由於Cy5的最大發射波長為680nm,很難用裸眼觀察,而且不能使用高壓汞燈作為理想的激發光源,因此,使用普通熒光顯微鏡時,不推薦使用Cy5。通常觀察Cy5時需使用激光掃描共聚焦顯微鏡。
 
(5)乙酸甲酯:其本身不發熒光,但透膜進入細胞質後,在酯酶的作用下轉變為具有熒光特性的乙酸甲酯。其激發光譜有pH依賴性,是使用最多的細胞內pH熒光指示劑。最大激發光波長為505nm,最大發射光波長為530nm,呈綠色熒光。
 
(6)Indo-1:是典型的雙發射熒光探針。無鈣時在485nm左右有發射峰,結合鈣後,則在405nm處有發射峰,兩者的比值與細胞內遊離鈣離子濃度成線性關係,將此比值與標準曲線相比即可得出細胞內遊離鈣濃度,因此,可利用此探針定量檢測細胞內遊離鈣離子濃度。最大激發光波長為330/346nm,最大發射光波長為405/485nm,呈紫色(405nm)或青色(485nm)熒光
 
(7)量子點(quantum dot):是近年來研製的一種新型熒光染料,又稱半導體納米晶體(semiconductor nanocrystal),是由幾百或幾千個納米級顆粒構成的半導體材料,性質穩定,溶於水,細胞本身不能合成和組裝。量子點具有熒光時間長、產生多種顏色、檢測方便和應用範圍廣等優點。當某一波長的激發光對多種大小不同的量子點進行照射時,可以同時觀察到多種顏色,因而可同時進行多個目標的觀察和檢測。量子點可與抗體、鏈黴親和素等多種分子進行耦聯,檢測靶分子的分布和功能。


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