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新聞資訊

顯微鏡技術及其功能配置應注意的問題

2013-10-16  發布者:admin 

光學顯微鏡較為廣泛應用於醫學實驗室,隨著近代光學技術的發展及微電子、計算機等技術的融合,更賦予這一傳統儀器技術以新的生命力。在掌握必要的顯微鏡及其各種鏡檢方法的理論知識基礎上,精確進行調試、校準和定期維護,對保證顯微鏡技術的有效利用及觀測質量甚為重要。

單筒顯微鏡的結構


1 安裝與維護
安裝與維護是保證顯微鏡正常使用的基礎條件。顯微鏡應安置在無塵、無振動、無化學腐蝕性暴露、無過度光投照散射、相對濕度低於60%的實驗室內。無塵是安裝使用光學檢測儀器的特定要素,尤其是進行暗場、DIC相差、熒光等鏡檢時。除要保持室內清潔外,重在對顯微鏡施實時養護。清潔顯微鏡光學器件先可用吹氣風球吹朔掉表麵的灰塵顆粒,隨之用專用擦鏡紙蘸適量擦鏡液(乙醚和乙醇7:3配製的混合液)由內向外螺旋跟進擦拭,而後用幹紙擦,再用吹風球吹幹;對≥40×物鏡前透鏡要使用質地較軟的木牙簽或類似物體磨鈍尖端包上至少兩層擦鏡紙蘸擦鏡液輕擦,不能用堅硬的竹牙簽,以免牙簽透過擦鏡紙劃傷透鏡麵。使用油鏡後要立即濕擦兩次,同時檢查相鄰的其它倍率物鏡是否在轉換鏡頭時沾染上鏡油,如有一並擦拭之。但注意不是所有光學部件都可如此擦拭,對鍍有特殊光學塗層的偏光鏡檢的起偏鏡及檢偏鏡、DIC棱鏡、熒光激發發射濾光片組件等,平時要常用吹風球吹朔,一旦沾染最好塗液態膠類物質幹後揭去粘除汙染物。不能用有機溶劑(如高濃度酒精)擦拭鏡體。
無振動體現兩個涵義。一是安裝位置遠離振動源,安裝台麵水平、穩定、無振動,必要時配置專用防震台,配套計算機最好不要與顯微鏡放在一個台麵上且兩台間要留有空隙以免聯動。二是操作過程無振動,特別是在鏡像采集的曝光時間內、顯微操作、顯微切割等精密環節。
除外熒光鏡檢,控製室內的光照度和方向非常重要,照明要均勻避免過度炫光。光照不能刺激人眼,也不能直接投照顯微鏡的光路器件,把顯微鏡臨窗安置是不甚合適的。較長時間不用的可拆卸光學部件要放入幹燥罐中保存,並定期更換吸潮劑。在濕度較高季節,室內最好安裝除濕機並及時倒掉水箱內的水。


2 調整與校正光源燈絲對中調節
主要是顯微鏡光學器件的調整、校準及其光學參數設置。


2.1 照明光源燈絲對中
對沒有預定燈絲中心的顯微鏡需要在更換燈泡或搬動顯微鏡後進行此項調節。方法是縮小視場光闌,在視場光闌處放置乳白磨砂濾光片或一塊硫酸紙,可看到燈絲像和縮為點狀的視場光闌像呈現。利用燈箱外方的三個調節螺杆進行調節操作,其中一個調整燈泡的聚焦直到燈絲像清晰可見,如點狀視場光闌像不在燈絲中央,則用其它兩個螺杆做上下、左右
調整,直到燈絲完全調至中央為止,見圖1。


2.2 聚光鏡光(合)軸調節聚光鏡光軸調節
聚光鏡光軸偏移產生的問題是視場照明不均,因而此項操作要納入顯微鏡的定期校準規程。在明場下,用10×物鏡觀察標本並完成調焦;將視場光闌盡量縮小、聚光鏡孔徑光闌開至最大,在視場內可見到視場光闌的輪廊像(視場光闌像不清晰,可稍微調節聚光鏡的升降螺旋);如後者不在視場中央,則交替旋調聚光鏡外側的兩個調中螺杆將其調至中央部分,而後逐漸地開大視場光闌,能看到光闌向視場周緣均勻展開直至視場光闌的多角輪廓像完全與視場邊緣形成內接,表明聚光鏡與顯微鏡光路達到合軸。合軸後再略微開大視場光闌,使輪廓像剛好處於視場外切或稍大一些,這樣即適於作鏡檢觀察,調節過程見圖2。注意不要忘記將聚光鏡升至原位,其透鏡距鏡台平麵0.1mm,焦點位於上方1.25mm處, 如聚光鏡低於此位將改變焦點並導致部分光斜照標本產生過多衍射光影響分辨率。倒置顯微鏡要根據聚光鏡標定的工作距離調節聚光鏡的位置,實際上當用10×物鏡觀察到清晰的視場光闌時應當是合適的距離。


2.3 視場光闌調節視場光闌調節
為獲得更好的鏡像反差,應盡量屏蔽多餘的雜散光進入觀測鏡場或成像區域,在經目鏡配合不同倍物鏡進行觀測時,可調節視場光闌像對應目鏡視場形成外切(圖3左);在顯微攝影或數字CCD成像時,可根據取景框和CCD成像區域再適當縮小視場光闌(圖3右),但不要縮過造成照片切角。使用油鏡時也可適當縮小調節。


2.4 聚光鏡數值孔徑的設置
首先,配置聚光鏡的數值孔徑 (numeric aperture, NA) 範圍應與物鏡的NA值基本相等,高倍細微鏡檢時有必要在頂端加油。孔徑聚光鏡的作用是對應物鏡數值孔徑提供有效的聚焦投射光,如果設置聚光鏡的NA大於物鏡NA則一部分光浪費,而過小於物鏡NA投射光不足且由於出射角改變使一部分光斜照射標本呈現衍射鏡像,兩者均會降低鏡像的分辨率。因此,應遵循一定的對應設置原則,經驗值是鏡檢觀察時為80~100%,攝影時為獲得較合適的反差和景深建議設置在60~80%或70~80%。這意味著每轉換一種倍率的物鏡時,都要根據其NA對聚光鏡的NA做出對應設置[2],這樣才能保證鏡檢質量,實際中還可根據標本薄厚、染色深淺進行細調。


2.5 覆蓋差校正
標準蓋玻片厚度0.17mm、載玻片1.0mm,由於采用不符合標準的蓋玻片或載玻片加之切片、封片劑薄厚不均會產生覆蓋差,影響較大NA物鏡的鏡像質量。為校正覆蓋差,在40×、60×或20×幹係物鏡上設計有覆蓋差校正環(correction collar, CC),校正範圍一般在0.11~0.23mm,長工作距離物鏡可至2.0mm。應當精細掌握CC的調節要領,不然反而會帶來麻煩,特別是當前一個實驗者做了校正而下一個實驗者的樣片覆蓋差不一致時。方法是,先選調CC將0.17數值標線對準定位刻線,觀察鏡像是否能做到調焦清晰,如不很清晰則分別向左右方向旋調CC環直至鏡像達最佳,且要堅持每當更換標本時均應完成覆蓋差校正調節才能保證鏡檢質量。


2.6 光源電壓
目前鎢鹵燈透射光照明主要有6V/20W、6V/30W和12V/100W三種(50W燈源已少見),顯微鏡通過調節電壓控製其功率。在常規鏡檢,可根據標本的薄厚、物像層次(對光的吸收情況)以及色溫來調設電壓值,如鏡像過亮刺眼可加中密度(neutral density, N或ND)濾光片。值得留意的是在顯微攝影時,需根據實際測得的色溫值調節電壓達到膠片所要求的色溫(如日光型膠片5,500~6,000K°或6,500K°,對應電壓在9~12V),一旦設定則不能隨意再改變電壓,隻能通過加ND濾光片調節而不影響色溫。


2.7 屈光度調節
此項操作很容易被忽略以致實驗者眼疲勞,實際上臨檢級顯微鏡的目鏡筒大多配置有屈光度調節機製。生產廠建議調節方法各異,但如果配置的物鏡齊焦常用操作步驟是,先調整好瞳距,用右側目鏡觀察完成對焦,而後改用左測目鏡觀察調節裝有的屈光度校正環直至調焦清晰;或先用40×物鏡完成鏡像對焦,再改用4×物鏡用左眼觀察,同時旋轉目鏡筒上的屈光度校正環,直到聚焦鏡像最佳。


2.8 常用鏡檢法的調置
重點討論以下鏡檢法操作過程中常易疏漏的調置環節。


2.8.1明場(bright field, BF)
定期進行聚光鏡中心調整,實時進行聚光鏡與物鏡NA的對應數值調設。清潔蓋玻片、載玻片,確保沒有手印、沾染物。使用油鏡時,調焦或移動視野要慢些以維持浸油形成的表麵張力保證對焦和孔鏡角穩定,兼做熒光觀察的物鏡最好統一用無熒光油




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