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新聞資訊

熒光顯微鏡技術

2013-10-16  發布者:admin 

顯微鏡光學技術對顯微結構與顯微變化是極為重要的工具.

熒光物質 ( 熒光染劑 ) 受到較短波長的光 (  FITC : Ex:488 nm ) 及足夠的能量所激發當要回到穩態的能階時會釋出較長波長的熒光 (  FITC : Em : 515 nm ), 非熒光物質則成為黑色的背景.

自體熒光 ( auto-fluorescence )又稱為主要熒光 ( primary fluorescence ), 是物質本身無熒光染劑也能自體產生的熒光現象., 一般此種熒光會影響實際要觀察的樣品或者其自體熒光會幹擾覆蓋實際要觀察的熒光讓AG亚游集团無法真正的判定熒光產生的物質及部位在那裏所以利用特定的熒光染劑來表現特定的物質與部位此種由染劑所釋出的熒光AG亚游集团一般稱之為次級熒光 ( secondary fluorescence )

 

 顯微鏡光路

 

顯微鏡的熒光影像技術取決於下列主要因素 ( 除了顯微鏡本身光學係統的優劣之外 ) :

1). 樣品處理

2). 熒光染劑 ( Fluorochrome = Fluorescent dye )

正確的選用熒光染劑必須將背景洗淨注意其熒光漂白時間也須留意其酸鹼值的變化.

新一代的染劑愈來愈多 Multi-color GFP, DsRed, nanocrystal… etc. 在使用時必須特別注意所匹配的激發光源及感測的光譜範圍.熒光感測是仰賴感測光子的多寡愈多光子 ( Photon ), 熒光影像愈佳.

3). 激發光源 ( Light sources )

一般使用於熒光顯微鏡的激發光源有高壓汞燈及高壓氘燈

激發光源
 

高壓汞燈 ( Hg 50 W – 使用交流電  Hg 100 W – 使用直流電 )

高壓汞燈Hg 50 W一般都用於綠色或藍色的光譜範圍然而, Hg 100W 能提供更為穩定的

光源所提供的強度更為均勻., 較適宜光譜定量分析應用.

高壓 Xenon ( Xenon 75 W – 使用直流電)

高壓 Xenon燈能提供穩定的電流在連續的可見光光譜範圍, Xenon燈提供較固定的光源平均強度.

所以一般都使用 Xenon燈於 UV, Violet 及其綠色或藍色的光譜範圍.

燈泡式的光源缺點之一即是 :

光源都是全光譜分布每一波長的光源其強度都不是恒定且能量較低也不均勻分布

源強度也無法調整樣品及染劑的應用上頗難達到理想的控製.

共軛焦顯微鏡所采用的光源是雷射 ( Laser )., 波長純一高能量.

4). 熒光濾鏡 ( Fluorescence Filter Cube )

熒光激發塊
 

每一組熒光濾鏡基本上都包括了三個鏡片

1). 激發光濾鏡 ( Excitation Filter )

因為特定的染劑需要使用特定波長範圍的光來當作激發光源 ( 才不致影響到其它不想要檢

視的物質被激發 ) 而一般燈泡式的光源 (  Hg 50W, Hg 100W, Xe 75 W ), 所產生的光都含

蓋全波長 ( 300 – 1200 nm ) , 所以必須使用激發光濾鏡來篩選激發熒光染劑所須的光譜範圍

可為 Long-pass, Band-pass, Short-pass ). 激發光濾鏡是以特殊的鍍膜來產生可篩選波長的

功能例如 BP 450 – 490 nm, 即是僅讓 450 – 490 nm 間的光通過用以激發 FITC 染劑.

 

2). 分光鏡 ( Dichromatic Mirror 或者 Beam Splitter )

將較短波長的激發光反射至樣品.

例如 RKP 510 nm, 即是, 510 nm 以下的光反射至樣品然而, 510 nm 以上的光可通過.

3). 釋放光濾鏡 ( Emission Filter 或者 Suppression Filter )

受檢樣品中的特定染劑及其它物質被激發後所有被激發的物質都釋放出來較長波長的螢

然而熒光僅能在釋放光濾鏡所選定的特定波長範圍內通過此通過的熒光即是AG亚游集团所要

觀察的熒光影像.

例如 : LP 510 nm, 即是熒光光譜超過 510 nm 都能通過濾鏡供觀察低於 510 nm 的螢

光則被阻擋看不到.

傳統的共軛焦顯微鏡所采用濾鏡轉盤 ( Filter wheel ), 其內可安裝感測光濾鏡.

Leica TCS NT2 於每一個 PMT 皆可安裝 1 組濾鏡飛輪每一個飛輪可安裝最多達 7 

的濾鏡.

Leica TCS SP 則是以連續式的全波長分光光譜係統來取代傳統的濾鏡因為有限的濾鏡無

法滿足染劑的應用更無法滿足新一代染劑的使用使用可全波長感測的分光光譜係統

無限製的自訂各種感測光譜有如一組無限的濾鏡真正達到多工多用途與多使用者的目的.

 

5). 光學鏡頭解析

 鏡頭

鏡頭2
鏡頭的解析, 是熒光影像質量的重要影響因素之一, 基本上, PL-Fluotar 及 PL-APO 級的油鏡能提供較好的光學穿透率., 其中, 又以較高 NA 值 ( NA 值與鏡頭開口角度 α 成正比 ) 的鏡頭為好. ( 鏡頭必須使用折射率 n= 1.518 immersion oil, 一般鏡頭解析計算, R = n˙ sinα ), 如 : PL-APO 63x/1.32 Oil, PL-APO 100x/1.40 Oil

同樣 100x 鏡頭, 如果使用次一級的 N Plan 100x/1.25 Oil, 則因其 NA 較小, 色差與像差的修正都略遜於 PL-APO 100x/1.40 Oil鏡頭, 故, 熒光影像質量較差., 在低強度的熒光影像鏡檢, 表現更是明顯.

所以, 熒光影像所使用的光學鏡頭依序考量應為 PL-APO, PL-Fluotar, N Plan, C Plan, Achromatic.

共軛焦顯微鏡建議使用專屬的鏡頭其於 R, G, B, 各作有特別的修正 ( correction ), 能提供最高的光學穿透與解析 ( Point-spread resolution ). 其有別於一般鏡頭.

例如 : PL-APO 63x/1.32 CS Oil (  CS 標示即代表 Confocal System 專屬鏡頭 )

6). 熒光傳感器

基本上一般除了利用目鏡 ( Eyepiece ) 檢視之外絕大部份都使用相機 ( Camera )  CCD 攝影機 來擷取熒光影像.

由於熒光影像一般都較弱故照相時依照熒光強度的強弱分布可能必須使用俱有點測光 ( Spot metering )  俱有長時間曝光的照相係統為考慮因素., 然而, CCD 攝影機則以大芯片 ( CCD Chip ), 冷卻式 ( Cooled ), 對極低弱的光有較靈敏感應的黑白 CCD 攝影機為考慮因素. 

使用黑白 CCD 攝影機的原因之一是其比一般彩色 CCD 攝影機感光較為靈敏顯像解析較高.

如要取得彩色熒光影像則可通過影像擷取卡 ( Frame Grabber ) 取像以數位影像方式利用軟件作 RGB 三原色套色即可 ( 一般利用 Photoshop 軟件即可處理彩色套色 ). 如要直接擷取實彩色熒光影像 ( True Color Image ), 則可加裝 RGB-濾鏡 即可.



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