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徠卡顯微鏡熒光觀察法

2013-10-16  發布者:admin 

熒光觀察法在醫學領域有著廣泛的用途,如免疫學研究的對象是抗原和抗體的反應問題,由於抗體反應的高度特異性,所以當抗原體發生反應時,隻要知道其中一個因子,也就可以知道另一個因子。
但是這個過程必須通過染色,熒光染色劑就應運而生。
由於熒光染色的色素隻需極稀的濃度便能使激發出明亮的熒光。因而,染色後不會破壞抗體(或抗原)原有的特異活性。
其光學原理示意圖如下,以藍光激發為例:

熒光激發光學原理圖

激發濾光片                                     熒光本                       截止濾光片

 

光源發出多種波長的光線,經激發濾光片後隻能通過某種單色的激發光,熒光標本在激發光作用下,激發出某種特定的顏色光(熒光)。由於被激發的熒光能量很弱,隻能在黑暗的背景才易於觀察
到,所以增加了抑製濾光片使殘餘的激發光不能通過。
早期的熒光觀察采用透射照明,它有很大的缺陷,當激發光透過標本組織時,很大部分的光線被衰減掉,到達AG亚游集团需觀察的標本上表麵時,隻能激發出微弱的熒光。
近代的熒光觀察采用落射照明,如下圖所示:

熒光落射照明圖中 :
1.光源
2. 激發濾光片
3. 物鏡
4. 標本
5. 二向性分光鏡
6. 抑製濾光片
7. 目鏡

 

 

 

 

 

 

A> 光源
根據不同的激發光需要,可以選用三種光源,鹵素燈,高壓汞燈和氙燈。下圖列出菲利浦公司高壓汞燈和氙燈的光譜特性曲線。

高壓汞燈的光譜特性曲線氙燈的光譜特性曲線

高壓汞燈的光譜特性曲線                          氙燈的光譜特性曲線

 

由圖知,高壓汞燈是線狀光譜,對於某些波長光線有很高的強度,它適用很多染色法。
氙燈在300~800nm 波長內幾乎可以看作連續光譜,雖然是某些波長的強度不如汞燈,但它適用於所有熒光染色法。
鹵素燈也是連續光譜,它在藍光,綠光處也有較高的強度(但遠低於汞燈,氙燈)因此,對於隻用藍光,綠光激發的簡易熒光顯微鏡可以選用鹵素燈。
通常采用50W汞燈,100W 汞燈75W氙燈及100W 鹵素燈作熒光光源。
圖中物鏡既起成象作用,又起聚光鏡作用。為了獲得很好的觀察效果,在熒光很微弱的場合如細菌發出的熒光。建議采用大數值孔徑物鏡,如徠卡的熒石物鏡,平場複消色差物鏡。
正因為物鏡又兼聚光鏡作用,所以物鏡中玻璃材料,透鏡間膠合劑,以及浸油必須確保在激發光下不會自發熒光。
為了使用方便,常將激發濾光片,二向性分光鏡及抑製濾光片組合成一個模塊。對於不同的熒光染色法,必須選用合適的模塊才能得到滿意的結果。所謂二向性分光鏡對激發光具有高反射率,而對激發出的熒光具有高透過率。

B> 常用熒光模塊
一般熒光模塊有如下四種:
近紫外光激發模塊――UV、 紫光激發模塊――V、 藍光激發模塊――B、 綠光激發模塊――G
這些模塊對應著不同染色法,如B 模塊常用FITC 染色法,G 模塊常用羅達明B200 染色法。
必須特別指出,激發光的波段曲線絕對不能與抑製光的波段曲線部分重迭,否則,視場中的背景
光全部是激發光的顏色,而微弱的熒光完全被掩蓋住,正如白天天空中無法看到星光一樣。

激發光的顏色激發光的顏色

1─激發光 2─抑製光

 

藍光激發如用FITC 染色法,它的激發波段為480~490nm,被激發的熒光波長為510nm。由圖知,無論激發光或抑製光在500 nm 處均截止,無相交重迭。所以,殘留的激發光無法通過截止濾光
片,視場背景是黑暗的,而熒光則可順利地透過截止濾光片,形成熒光圖像。
徠卡公司設置了許多模塊,供不同的染色法選用:

濾光片模塊代號

激發光範圍

激發濾光片

二向性分光鏡

截止濾光片

A

紫外光

BP340-380

RKP400

LP425

D

紫外光+紫光

BP355-425

RKP455

LP470

E4

藍光

BP436/7

RKP455

LP470

H3

藍光

BP420-490

RKP510

LP515

I3

藍光

BP450-490

RKP510

LP515

K3

藍光

BP470-490

RKP510

LP515

L4

藍光

BP450-490

RKP510

BP515-560

M2

藍光

BP546/14

RKP580

LP590

N2.1

綠光

BP515-560

RKP580

RKP580

TX

綠光

BP530-595

RKP600

LP615

G/R

綠光

BP490/20

RKP505

BP525/20

藍光/綠光

BP575/30

RKP600

BP635/40

B/G/R

紫外光/藍光/綠

BP400/20

RKP415

BP530/30

BP495/15

RKP510

BP640/40

BP570/30

RKP590

BP610/75

注意:
許多熒光標本無法長期保存,特別在激發光照射下,熒光很快消失。所以,在停止觀察時,應該將激發光擋。但是汞燈開啟到熄滅後,第二次再啟動時,必須待燈源冷卻後才能進行。為此,須在模塊前設置一擋板(Shutter),可隨時關閉、開啟。

熒光顯微鏡 熒光“激發 發射”模塊

                                           熒光“激發 / 發射”模塊

                                                                                                                                        

 

標本圖像

標本圖像(藍光激發)                                              標本圖像(紫外光激發)

 

標本圖像(綠光激發) 標本圖像(藍光+紫外光激發)

標本圖像(綠光激發)                                      標本圖像(藍光+紫外光激發)



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