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尼康顯微鏡:物鏡的蓋玻片校正

2013-10-16  發布者:admin 

 對於具有高數值孔徑的光學性質和厚度的介質躺在前透鏡元件和所述試樣之間的嚴重影響的必要的計算,以滿足消球差和正弦條件,以及以其他方式校正圖像畸變的顯微鏡物鏡。

correction collar figure1

如果均質物鏡被設計為使用浸油,蓋玻片,和吸液的檢體,匹配的物鏡前透鏡元件,然後計算過程是簡單的介質的折射率和分散液,因為所有的媒體可以被認為是延伸的所述前透鏡元件。

 

然而,與非物鏡,蓋玻片可以成為一個源的色像差,從而增加與蓋玻片厚度和分散。 另一光學工件,球麵像差,也是蓋玻片的厚度成正比。 在設計的物鏡,不被用於均勻浸漬,一個假定的存在下,一個標準的蓋玻片和其他特定的光學媒體之間的前透鏡元件和所述試樣。由於條件脫離這些指定的規格,球麵像差和彗差的數值孔徑的增加而物鏡。會出現這種情況,因為較長的數值孔徑的切線的入射角的正弦值(這是負責偏離需要校正這些像差的正弦條件)之間的差異變得更大。

 

使用油浸物鏡時,它可能會出現,蓋玻片厚度是有限的關注,因為它的折射率近似匹配,浸油。 這是真實的,當樣品被安裝在加拿大香脂或其他安裝介質折射率類似於蓋玻片。 然而,它不再是真實的試樣被安裝時,例如,在生理食鹽水或其它含水介質,其折射率是顯著不同的蓋玻片。 在這些條件下,即使聚焦通過一個薄的水層,隻有10微米厚的可導致明顯的像差和點擴散函數PSF的上方和下方的焦平麵,不再對稱。 這是因為油浸物鏡的設計假設,均勻地浸標本。 樣本,除非區域相鄰的蓋玻片(甚至在含水環境中),來計算的像差校正光學假設不再有效。

 

一旦這一特點的油浸物鏡的行為被確認,顯微鏡製造商開始生產修正後的水浸物鏡1994年左右)。 平常APO水浸物鏡的配備校正衣領的數值孔徑在1.2左右,(即使他們有一個較小的數值孔徑比他們的浸油)是通過水的解決方案能夠克服固有的局限性成像(見圖2)。 最新的水浸物鏡的設計現在可以集中精力通過約200微米的水介質,仍然保持出色的校正。 不幸的是,這些物鏡的價格是非常高的,和圖像對焦時,仍可以降低深內折射的組織或細胞元素。

 

correction collar figure2

 

對比度傳遞一個60x/1.2數值孔徑的水浸泡和一個60x/1.4數值孔徑的油浸物鏡(包括平常複消色差),測量帶和不帶蓋玻片和測試光柵之間的水層,在圖2中給出的值。 這些圖表表明,水浸物鏡執行即使與水層的厚為153微米的對比度傳遞的理論極限的油浸物鏡的對比度傳遞函數,而顯著降低,並減少一半的分辨率極限,當測試光柵成像,通過一個50微米厚的水層。 連續行,理論上計算出的對比度傳遞函數無像差的相應的數值孔徑的物鏡,在546納米的波長。

 

correction collar figure3

 

對於一個標準的的蓋玻片厚度和折射率/分散液(0.17毫米nD= 1.515),偏離標準厚度與設計用於的物鏡是不是太關鍵物鏡具有一個數值孔徑為0.4或更小(如列於表1)。 然而,對於高數值孔徑的的非均質油浸物鏡,這個問題變得尤其重要,這樣離境蓋玻片厚度甚至兩微米或降低的圖像與數值孔徑0.65或更大的物鏡。 這個概念在圖3中所示,呈現所計算出的最大強度的在蓋玻片厚度相對於偏差的一個點對象的圖像,從理想值0.17毫米,作為客觀的數值孔徑的函數。 為了彌補這樣的錯誤,以及校正後,高幹物鏡配備校正,可以利用調整其根據蓋玻片厚度的中間透鏡元件的間距的項圈。 以相同的方式,物鏡設計用於查看通過矽樹脂或塑料的層,或不同的浸沒介質(水,甘油,油),配備校正鋌。

 

蓋玻片厚度變化的性能下降

數字的 
光圈

0.01毫米偏差

0.02毫米偏差

0.30

沒有

沒有

0.45

沒有

沒有

0.70

2

8

0.85

19

57

0.95

55

71

1

 

蓋玻片的標準厚度為0.17毫米,它被指定為一些第一½玻璃蓋。 不幸的是,並非所有的1½蓋眼鏡製造這種緊密的公差,許多標本有媒體和它們之間的玻璃蓋。 蓋玻璃厚度的補償可以通過利用專門的校正領子的改變鏡筒內的物鏡,關鍵的透鏡元件之間的間距,通過調整機械管長度的顯微鏡,或(如前麵所討論的)。 修正環進行調整,以彌補這些細微的差別,並確保最佳的物鏡性能。 適當的應用程序的顯微鏡物鏡與校正鋌要求有經驗,有足夠的警惕,重設領,使用適當的圖像標準。 在大多數情況下,重點可能會轉移和圖像可以漫步在調整過程中的修正領。 使用下麵列出的步驟,同時觀測樣品圖像的變化,使微小增量調整物鏡的修正領。

·修正的物鏡桶上的指示標記,以便領恰逢0.17毫米刻度刻在領住房的位置。

·標本放置在載物台上,集中在一個小樣本的顯微鏡功能。

·非常輕微的旋轉校正鋌並重新聚焦的物鏡,以確定是否有所改善的圖像或退化。由於遭受玻璃蓋/媒體三明治太粗的事實,大多數樣品準備,開始旋轉實驗,試圖補償值(0.18-0.23)第一。

·重複前麵的步驟,以確定如果圖像被改善或降解作為校正衣領是在一個單一的方向上轉動。

如果圖像有下降,按照同樣的步驟,向相反的方向旋轉校正領(向較低的值)找到的位置,提供最佳的分辨率和對比度。

1示出一個具有0.85的數值孔徑的配備用於聚焦在表麵上或通過一個蓋玻片最多至1.5毫米的厚度,而不改變透鏡係統的焦距設置的校正鋌60x物鏡的一個例子。 在光學列車的中心的可調節透鏡組是膠合的三重峰,可以被重新定位,以適應在蓋玻片厚度的變化。



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