設為首頁 | 添加收藏 |sitemap |百度地圖 |
貨真價實 坦誠無欺
新聞資訊

尼康顯微鏡:活細胞成像對光學係統和CCD的要求

2013-10-16  發布者:admin 

在活細胞研究設計的光學顯微鏡係統,主要考慮檢測器的靈敏度(信號與噪聲),圖像采集所需要的速度,以及標本的可行性。相對較高的光照強度和較長的曝光時間,通常采用固定的細胞和組織(如漂白是主要的考慮因素)中記錄圖像時,必須嚴格避免與活細胞。在幾乎所有的情況下,活細胞顯微代表了一種妥協之間實現最佳的圖像質量和保持健康的細胞。不必要的過采樣的時間點,使細胞含量超標的照明,空間分辨率和時間分辨率的實驗,而不是應限製在調查的物鏡相匹配的。

imaging systems figure1

原則上,理想的活細胞圖像采集係統是不夠敏感,從弱熒光樣品,同時足夠快的速度來記錄所有動態過程,獲得高品質的圖像。此外,該係統將有足夠的分辨率捕捉最細微的標本細節能夠準確測量非常微小的差異在強度和較寬的動態範圍。不幸的是,僅完成優化這些條件中任一項在犧牲其他。因此,目前不可能設計一個通用的活細胞成像係統,這將是理想的整個範圍內的可能的調查。相反,研究人員必須妥協,確定最重要的參數進行優化,同時還試圖限製由這些變量被認為不太感興趣的犧牲。顯微鏡配置在最後,最終確定所要求的攝像模式(s)時,生活必需品保持試樣在實驗期間,標記協議的難度級,和設備的可用性的可行性。

 

示於圖1,是一個現代的倒置研究級組織培養顯微鏡配備4相機端口,每個端口耦合到一個不同的相機設計用於特定的成像模式。在大多數情況下,這種設計直接是100%的端口(一個端口在同一時間)的光顯微鏡或分裂的相機端口和目鏡的光80:20之間。對於在低光照水平的關鍵的成像,研究者應確保最敏感的相機被連接到一個端口接收由樣品發射的光100%。在圖1中,全彩色CCD相機連接到的底部端口(一)接收來自物鏡的光不反射的反射鏡或棱鏡,並在這種情況下,采用圖像乘以在明視場模式下的標記的熒光的標本(或染色標本) 。高性能電子乘以數字(EMCCD)相機(二)安裝到右側端口上使用的圖像標本顯示出非常低的水平的熒光。微分幹涉對比成像深入厚的組織與紅外照明,照相機((c)的左側端口))具有傳感器具有高的量子效率在7001000納米之間是必需的。最後,用於高分辨率單色成像通過全內反射和其他熒光技術,珀耳帖(Peltier)冷卻的攝像頭((四);前端口)相對小的像素(6微米)是理想的。的配置,如在圖1中所示的是昂貴的,但也可以是極其通用的核心成像設施。

 

使用廣泛的對比增強成像模式,在光學顯微鏡進行活細胞成像。調查的大部分涉及某種形式的熒光顯微鏡,往往聯接到一個或多個發送的光技術。熒光技術,包括傳統的寬視場落射熒光,激光掃描共聚焦,旋轉盤,橫掃領域聚焦,多光子,全內反射(TIRF),熒光相關光譜,熒光壽命成像(FLIM),光活化,和激光捕獲。作為一個子集,專門的成像方法,如多色成像,光譜成像,共定位,延時序列,漂白恢複技術(FRAPFLIP FLAP),共振能量轉移(FRET),斑點顯微鏡(FSM),膜片鉗往往是耦合到主成像模式中的一個或多個。可以輔以熒光技術傳統的明視場模式下,包括微分幹涉相差(DIC),霍夫曼調製反差(HMC),相位相反的,作為熒光探針本地化的確認。在幾乎所有情況下,每個的顯微鏡配置需要一些獨特的考慮,必須實現成功的活細胞成像。無論顯微鏡和成像活細胞和組織采用的數字照相機係統,兩個最重要的限製因素是維持細胞生存力和實現可能的最高信號電平以上的背景噪聲和自發熒光。

 

 

優化信號與噪聲在活細胞成像

成像固定和活細胞之間的基本區別之一是,前者的研究者提供了充足的緯度定義圖像采集參數,如尋找一個合適的視野,並確定曝光時間,以及調整電子增益設置,讀出率,和偏移值。其結果是,它在大多數情況下是可能的(與充分染色固定標本)獲取利用的全動態範圍的照相機係統的圖像,從而產生最佳的信號 噪聲比。不幸的是,情況是不同的成像參數所施加的嚴格要求,保持細胞活力,活細胞的限製。常常與活細胞的獲得的圖像中,試樣的強度隻有幾個灰度級高於背景。在這種情況下,最重要的攝像考慮成為暗電流和讀出噪聲水平的檢測器係統。經濟的相機通常具有更高的噪聲水平,導致經常掩蓋從檢體,作為增加的讀出速度的效果越來越嚴重的信號不太均勻的背景圖像。在幾乎所有活細胞成像,探測器的選擇是最重要的成功或失敗的實驗。

 

在數字成像的噪聲出現的四個主要來源來自檢測器,照明係統,泊鬆拍攝的噪聲(由於一個光子通量的隨機性)和雜散光。在大多數情況下,係統的噪聲減少,可以實現通過仔細選擇的檢測器和優化的照明條件。幾乎每一種類型的光子探測器到各測量記錄與設備引入某種形式的噪音。在激光掃描和多光子顯微鏡采用光電倍增管可以產生雜散的電子信號放大係統內的。同樣地,使用的電荷耦合器件(CCD)在寬視場,反卷積,內部全反射,旋轉盤,和掃頻場顯微鏡顯示出暗電流與每個像素相關聯的背景。在CCD和光電倍增管設計的改進,包括冷卻裝置,以非常低的溫度,減少了暗電流的貢獻,以非常低的水平。然而,尤其是在每個像素的CCD的情況下,閱讀和將模擬信號轉換成數字相當於貢獻了額外的噪聲分量被稱為讀出噪聲,在當前一代的冷卻的數碼相機係統的主要噪聲偽像。

imaging systems figure2

如圖2所示,在活細胞成像與讀出速度和圖像質量是相互依存的數字攝像機的靈敏度。標本是一種文化的人宮頸癌細胞(HeLa細胞線)表達的融合熒光蛋白基因和人α -微管蛋白的寬視場成像中的熒光照明與TRITC濾光鏡組合和灰度攝像係統工作在讀取速度,單體Kusabira橙色(人民聖戰者組織101.25兆赫。當相機CCD關門(接收沒有光),背景噪聲是顯著降低時,采用的讀出速度慢,在圖2a)和2b)在分別為101.25兆赫的速度,所描繪。這種差異不嚴重影響相機的性能時,曝光時間可以調整到利用的整個動態範圍,如在圖2c)和圖2d)中提出的圖像類似的質量證明。然而,在低光照條件下,讀取速度較慢(圖2f))提供優異的圖像質量。在圖2e)和2條(f)的圖像捕獲約低10倍比那些在圖2c)和圖2d)的光強度。減少的照度水平另一個5倍的產生的效果表現得更為明顯,如示於圖2g)和2h)中的讀出速度較慢提供了勉強可以接受的圖像(圖2(小時)),而快速讀出模式(圖2g))沒有。

 

一個成功的數字成像實驗需要的空間照明模式的標本是恒定的整個視野之間連續的影像。根據照明源,橫跨試樣字段的光學性質通常是相當恒定的(稱為空間不變性)顯微鏡使用鎢鹵素燈。然而,在激光掃描顯微鏡,傳送到一個特定的像素的照射劑量可以為每個掃描變化。此外,汞等離子弧放電燈源通常采用在寬視場熒光顯微鏡不提供均勻的強度,在整個頻譜,但在特定的波長,而不是產生離散的高強度的峰。氙氣燈,與此相反,顯示出更為均勻分布的強度分布圖的可見光譜範圍內,但在紫外區域(通常避免在活細胞成像的照明範圍)有缺陷。

 

組合弧放電燈(例如,金屬鹵化物燈),具有的屬性之間的中間的汞和氙的混合物,顯示出這兩個物種也許是最好的特性,除了提供一個連續的光譜,從紫外到紅外強大的汞線。不管的光源,照明場可呈現幾乎均勻的通過燈箱和顯微鏡光學火車照明輸入端口之間放置一個光學纖維(或液體光導)。任何剩餘的照明梯度整個視野可以通過計算校正使用平場的算法。重要的是要注意,在燈的輸出功率的時間的變化,它可以改變從平均10%,不校正由光學纖維和需要的應用程序的一個穩定的電源。

 

光子通量的測量本質上是一個統計過程中,與信號檢測的不確定性因素。稱為泊鬆拍攝噪聲(如上麵所述)的淨效果是,對於N光子的測量,不確定性等於N,這也是的信號-噪聲比的平方根。最大化的信號的光子數 N )直接導致在信號與噪聲和圖像對比度的改進。提高信號的最簡單的方法是收集更多的光子,通常是通過采取更長時間的曝光,或通過增加勵磁照明水平,但這些措施也可以增加光毒性和妥協細胞存活率。第二,也許更有益的選擇,是為了提高探測器的靈敏度。

 

為了克服低光水平與活細胞成像,現代數字CCD相機可以配置提供一個實施的過程被稱為分級(詳見圖3和圖8),顯著提高了靈敏度。在正常讀出時,在CCD的像素的量的水平像素的行轉移到讀取寄存器中,然後將其按順序分析。在一個離散化的圖像,在圖像傳感器上的基團中,相鄰像素中鄰接的(例如,一個2×24×4塊)的信號(光電子)被合並,並分配到一個單一的象素值中讀出的數組。這是由多個平行的行的像素轉移到串行讀寄存器(例如,為2×2 binning44×4像素合並兩行),然後讀取組的23,或多個像素一起實現。在2×2像素合並的情況下,有兩倍的分辨率損失,信號增加了四倍,和2倍的改善信號對噪聲。顯然,改善信號的有限的應用中可以顯著,雖然在空間分辨率的成本。

imaging systems figure3

3示出的效果相結合的相鄰像素上的空間分辨率和數字拍攝的圖像的最終尺寸,使用水平的不斷提高像素合並。標本赤麂鹿皮膚成纖維細胞表達mCherrypseudocolored紅色熒光蛋白)和人類的β -肌動蛋白,它定位在應力纖維組成的絲狀細胞骨架網絡的融合是一種文化。作為與熒光蛋白標簽,通常觀察到的細胞,顯示優越的本地化往往是那些表達的融合產物,在非常低的水平,顯著降低了可用的信號。隨著沒有像素合並啟用(圖3a)),該信號是太低,在曝光時間產生可忽略不計的光毒性和光漂白區分。像素合並2×24×4的逐漸增大的信號電平,但在成本的空間分辨率(圖3b)和圖3c))。最亮的圖像是由分級的8×8個像素(圖3d)),但存在激烈的分辨率損失。很重要的一點需要注意的是,圖像尺寸按比例減少在分級過程相結合的像素數增加。例如,在圖3中未像素合並(1×1)的圖像本來是1360×1024像素,而(2×2),(4×4),和(8×8)離散化圖像是680×512340所述256,和170×128像素,分別。這些圖像已被縮小尺寸時,在圖中為了說明的目的。同樣地,數碼相機,具有512×512的顯示尺寸,會產生256×256128×128,和64×64像素的圖像,當以類似的方式裝倉。

 

分級概念的一個關鍵點是,除了發生後的分選過程中,因此,即使幾個像素相結合,隻有一個讀事件每股合並像素的讀出噪聲。相反,如果一個2×2的方塊的像素被計算數據收集後的平均值,其結果將是不如像素合並,因為由四個像素中的每一個的單獨的讀出的噪聲貢獻。因此,即使分級犧牲空間分辨率,它會導致到的信號噪聲比,一個特別有用的優勢顯著增加時要求低光水平和較短的曝光時間上的光敏細胞進行實驗。在活細胞成像的關鍵參數通常能夠檢測到微弱的熒光信號,而不是解決這些問題的空間,以便提供圖像采集的力度和速度的增加抵消了損失分辨率的分級多。作為一種替代方法,以分級,許多高性能相機使研究者通過閱讀隻有一個子數組或利息完整的CCD陣列,空間分辨率的同時,減少量的一個有用的機製來保存選定區域,以減少圖像采集時間時間細胞暴露於有害的照明。

 

為了克服傳統的高性能CCD相機的應用需求快速幀速率拍攝在非常低光水平的缺點,廠商都推出了一種創新的方法,以上的CCD讀出噪聲地板的微弱的信號放大。通過裝有一個片上的乘法增益寄存器,電子倍增的設備(EMCCDs)實現單光子的檢測靈敏度,典型的強化或電子轟擊CCD的低得多的成本和不損害傳統CCD結構的量子效率和分辨率特性。EMCCDs的顯著特點是將一個專門的擴展串行寄存器在傳感器芯片上,生成乘法增益矽子結構(參見圖4)內通過的過程中,碰撞電離。高於的光子產生的電荷被讀出的噪聲,即使在高的幀速率,並且是適用於任何當前的CCD傳感器配置,包括背照式設備。

imaging Systems figure4

EMCCD相機係統的顯著優點是,它們是相當便宜製造比加劇的CCD,由於CCD的結構被直接並入到信號放大級。對於關鍵的活細胞與低強度的信號,如單分子成像中所遇到的,總的內部反射,旋轉盤和掃頻場共聚焦顯微鏡,鈣或其它離子的通量測定,和時間​​分辨三維顯微鏡調查EMCCD提供其他傳感器,專為低信號電平的顯著優勢。此外,與傳統的熒光成像技術的較高的信號電平的時,的EMCCD係統允許的極端敏感性較低的熒光基團的濃度和/或較低的功率電平,從激勵源的應用程序,由此減小了光毒性和光漂白的熒光探針。

 

顯微鏡的光學係統

顯微鏡針對活細胞成像的應用都必須配備一個高品質的框架構造堅固的複合材料或鋁和應穩定牢固地安裝在無振動的平台。光學表麵的外觀以及組件箱(冷凝器,燈箱,物鏡轉盤等)應保持幹淨的狀態和周圍環境的顯微鏡時,應無粉塵和低相對濕度。其中連續是必要的活細胞成像的常規程序是確保顯微鏡光學通路和隔膜對齊使用科勒照明的原則。實驗室房間的殼體顯微鏡的好處,以減少雜散光進入通過目鏡的顯微鏡或所述試樣腔室的水平的能力,以減少所有開銷照明。

 

電子數碼相機係統通常安裝到顯微鏡主體通過使用專門的適配器的一個或多個攝像頭端口。研究級顯微鏡通常配備多個端口,能夠同時連接多台攝像機(見圖1)。顯微鏡,采用多種成像模式,使相機的優化配置,為每個對比度增強技術,可以快速訪問在必要時,此功能特別有用。在顯微鏡主體內,反射鏡,分光鏡,和棱鏡的級聯策略性定位,以反映圖像形成光波的相機的各種端口和目鏡。重要的是要注意,任何圖像采集期間發送到目鏡光這樣做在發送到照相機的光的犧牲,從而減少了信號 噪聲電平。因此,在顯微鏡配備的,口方向控製應調整到100%的光發送到相機端口,用於收購有限光子熒光圖像。

 

收集從檢體的最大的信號,並將其傳送到顯微鏡光學列車的物鏡的選擇是至關重要的。的光路中,作為反射鏡,分束器,投影透鏡,濾光鏡,和棱鏡等的元素數量過多會嚴重的降低信號被捕獲圖像中的噪聲電平必須保持在絕對最小值。在熒光成像,需要具有非常高的數值孔徑的物鏡是從檢體收集到的光的量最大化。數值孔徑,它定義了多少可以收集從一個單一的點光源的光的鏡頭,可以說是最重要的考慮因素,在選擇活細胞成像的物鏡。從低倍率(10倍)幹物鏡油浸版本(通過10040倍)水和1.45 1.20 0.25,此值上刻的客觀桶和範圍。在數學術語中,數值孔徑被表示為:

數值孔徑(NA=折射率(η×鏡頭受光角(罪(θ))

 

因此,由前透鏡之間的介質和能夠有助於最大衍射光線的角度(θ)的正弦乘以試樣的折射率(η)確定的光收集能力的客觀圖像形成。此外,生成的圖像的分辨率,由物鏡的數值孔徑是一個函數。根據瑞利判據(一個保守的估計),分辨率是等於一個常數(0.61)的照明的波長乘以除以由物鏡的數值孔徑。另外,數值孔徑定義的強度(亮度)的圖像,這是與數值孔徑的四次冪成正比,但隻成反比的,與放大倍數的第二功率。因此,小的數值孔徑的增加可以產生顯著的改善信號。出於這個原因,活細胞的熒光成像通常需要最高的數值孔徑耦合到高折射率浸沒介質(油或水)的物鏡

 

如上所討論的,所述信號的亮度的物鏡放大倍率的平方成反比,所以,低倍率物鏡時,往往是有益的暗淡的樣品成像。例如,如果信號 噪聲比成為改變到類似的數值孔徑的60倍或40倍的物鏡將提供顯著的改善的亮度的數值孔徑1.4,用100倍的物鏡成像的標本中的限製因素。事實上,一個特定的熒光特性幾乎應該出現三次更明亮時,相對於100倍的物鏡(包括具有的數值孔徑為1.4)的具有60x的成像。所觀察到的強度也是一個函數變化的物鏡的傳輸質量,它始終是值得考慮的放大率和binning在一起,以便評估一個特定的實驗中所需的最終倍率。

 

對於成像乘法標記的固定細胞(和在某些情況下,活細胞),在整個可見光光譜(範圍從400700納米;稱為複消色差)良好地校正色差,具有平坦的成像平麵(稱為平場物鏡平光)被認為是理想的。不幸的是,複消色差和平場複消色差的物鏡,以及那些,用來捕捉更廣闊的視野,不可避免地含有多個光學元件(透鏡)的比不太精確的物鏡消色差透鏡熒光)。高度的校正使這些物鏡,用於透射光的技術,包括以最小的工件的相對比度和DIC。的結果,但是,光吞吐量犧牲,以獲得最佳的光學矯正,因此,有固定細胞成像的影響不大,但往往是反效果的活細胞成像。不足之處是最好的證明的平場複消色差物鏡40倍的物鏡有一個高數值孔徑為1.4,理論上應該約6倍的亮度比一個類似的100倍的物鏡,是在實踐中隻有約4倍,明亮的。無論如何,40x60x物鏡仍然提供了明亮的圖像可以實現光學分辨率的限製。

imaging systems figure5

 

5中示出的數值孔徑的分辨率和圖像的亮度方麵的重要性的一個例子的原理。的標本是文化附著的非洲綠猴腎上皮細胞(CV-1線)的質粒載體轉染增強型綠色熒光融合蛋白的線粒體定位的核苷酸序列,細胞色素C氧化酶亞基第八。的質粒轉染的哺乳動物宿主的轉錄和翻譯後,線粒體定位信號是負責運輸和分配的熒光蛋白嵌合體整個蜂窩線粒體網絡。管狀線粒體,隨後可應用熒光顯微鏡。

 

在圖5中,相同視野,使用具有相同的光學校正(平場熒光)和數值孔徑(1.3)的物鏡成像,但放大倍率從40倍到100倍不等。雖然利用在圖5中收集的圖像的像素和檢測器的條件的數目是相同的,線粒體最亮時,通過40倍的物鏡(圖5a;請注意,圖像已被調整到一個共同的的大小)成像。與此相反,更高的放大倍率60​​100倍的物鏡(圖5b)和圖5c)中,分別)產生逐漸變暗的圖像,用100倍的圖像被幾乎不可見。這一物鏡仍然可以用作圖像試樣,但檢測器的增益,必須顯著增加,導致的信號 噪聲比和通常次於圖像的劣化。請注意,由於在相同的數值孔徑值的物鏡的分辨能力(圖5d)至圖5f))是可比。

 

從圖5中的數據,將收集到的主要概念之一是為了避免過度放大時,選擇物鏡為活細胞成像熒光蛋白(和其它熒光基團,對這一問題)。簡單地增加了數字放大(變焦),在激光共聚焦顯微鏡圖像采集,圖像大小相當於100倍鏡頭(圖5D)和5e))使用40x60x的客觀結果。這兩個物鏡的分辨率是一樣的,因為他們有相同的數值孔徑。不應該采取的觀點相對次要的放大表明,使用60倍或100倍的物鏡是不利於。事實上,選擇的高倍率的物鏡通常是必要的成像時非常小的物體,如過氧化物酶體或分泌顆粒,使用廣角鏡。由於相對於檢測器的尺寸的圖像尺寸起著重要的作用,在確定空間采樣頻率,最佳倍率確定的參數的數字照相機係統(CCD像素尺寸和中間倍率)。因此,最好的選擇的物鏡通常依賴於檢測儀器的光學配置,除了特定的實驗的具體要求。

 

在的情況下的信號 噪聲比的分辨率更為關鍵,它常常是一種更好的選擇,利用物鏡下校正(更少的光學元件),具有顯著較高的光吞吐量。時,應注意也可用於通過包含顯著降低光透射的光學元件,如在相襯物鏡的振幅減小板的物鏡成像。此級別的光減少很少是傳輸模式中的一個問題,但可以大幅降低的信號電平(由15%至20%),在熒光成像。出於這個原因,相物鏡不應該被用於活細胞成像的低豐度的探頭除非實驗協議要求的相襯和熒光圖像的疊加。類似地,當組合使用熒光​​DIC的圖像正在收集,偏振光分析儀(其中約30%,降低了信號)通常是在共用的光路定位物鏡下方的立即和獲取熒光圖像之前,應除去。

 

顯微鏡光學火車存在的任何缺陷將影響在最終圖像中的信號噪聲比。在活細胞成像與高數值孔徑物鏡,球麵像差是最常見的神器,必須加以克服。此像差產生從洗澡的細胞(通常的折射率為1.33的水溶液)和客觀浸沒介質的折射率的介質之間的不匹配。球麵像差通常本身表現為不均勻散布在焦點沿著光軸的圖像的一個點,使得顯著伸長和扭曲。由於該信號被分布在一個更大的體積,其像差的存在下,信號 噪聲比減少。此問題是更為嚴重的成像時比它是與蓋玻片上的貼壁細胞(通常隻有幾微米厚),並可以通過使用水的浸沒透鏡是更密切地相匹配的折射率,在很大程度上消除了深成厚組織培養基中。作為一種替代方法,浸沒介質的折射率或蓋玻片的厚度可以調整。重要的是要注意,折射率隨溫度的變化,因此,液浸介質的最優組合,和蓋玻片厚度會有所不同攝氏室溫和37度之間。較新的浸漬用校正鋌物鏡可以用來對抗由溫度引起的折射率的波動。

imaging systems figure6

 

6給出的顯微鏡的光學係統(麵板(*))和檢測器(數碼相機,圖(b)),在執行活細胞調查的是顯著的局限性。的檢體是由一個單一的間期細胞核的粘合大鼠袋鼠腎上皮細胞(PTK2線)表達增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的稠合的的蛋白H2B序列(其定位在細胞核中),並與外延懷德菲爾德熒光成像照明。下部的右側角麵板(一)中的光學係統,並在較低的左上角的圖(b)的數字照相機係統的最高分辨率的圖像。在活細胞的顯微鏡,光學係統確定供對比度生成,以及規定的物理分辨率的限製,它是由物鏡的數值孔徑和波長的照明設置的光的數量。作為照明強度的增加(運行在麵板(*)從頂部到底部),光子計數噪聲變得不那麽明顯,圖像質量顯著提高。同樣,作為增加的光學分辨率(左麵板(*)中的右邊),更小的細節的細胞核變得更加顯而易見。

 

數字照相機係統捕獲從顯微鏡和數據根據離散的光水平和空間分辨率的元素(圖(b),圖6)的樣品的光信息。像素尺寸的增加(左右圖(b)),眾多功能的小細節變得模糊和圖像獲取一個塊狀的,幾乎不可見的外觀(右下角的角落裏圖(b))。降低利用捕獲和顯示的圖像(在圖(b)中的頂部的底部)的灰度級的數目減少的陰影,隻留下的功能具有非常高的對比度(在圖(b)中的頂行)。請注意,這兩個因素共同作用提供信息。再次,在活細胞成像實驗,收集的信息應該是成正比的要求的調查。

 

各種濾光鏡和反射鏡設計的活細胞成像的顯微鏡直接和微調照明和發光波長的檔案,因為它從光源通過顯微鏡(標本),然後到檢測器。與對比度增強的光學係統在傳輸模式中,改性光組件或偏振片和棱鏡(DIC)或冷凝器環空中和相位環(相襯和Hoffman調製對比度)。由於光在顯微鏡光學火車明場,DIC,和相襯的整體吞吐量遠遠高於用熒光,通常是必要的,以增加信號噪聲很小的修改,當在這些模式中的成像。主要考慮的是過濾的鎢鹵素燈照明,以消除光毒性紫外線和紅外線的波長,才損壞試樣。阻止紅外光,是必要的,以避免熱損傷的細胞,以減少複雜的信號 噪聲與紅外線敏感的相機係統的背景水平。紫外線是更少的用透射光燈的關注,但使用的綠色或紅色的幹涉濾光器,可以容易地控製試樣的波長達到。兩個紅外線和可見光濾光鏡將顯著減少光的水平,並可能需要增加曝光和增益設置的檢測器係統上,以保持信號 噪聲。

 

在熒光成像,幹涉濾光片和二色性反射鏡的組合來選擇合適的波長頻帶的光,用於激勵和收集從熒光團標記試樣排放。在熒光顯微鏡中,相對低光照水平相比,傳輸模式時,呈現為實現足夠的信號 噪聲水平的關鍵的選擇的濾光鏡。在大多數情況下,尤其是在信號泄放通過關注的問題是由於重疊的熒光團發射的檔案,帶通激發和發射(阻擋層)濾光鏡的應用是必需的。通常情況下,在這些濾光鏡中的固有的窄的光譜窗口進一步限製通過的光量通過顯微鏡觀察,挑戰研究者用於獲得良好的圖像,來選擇最佳帶寬。

 

各種各樣的具體的帶通濾光鏡和二色鏡組合的顯微鏡製造商和濾光鏡售後光學公司。對於最佳的信號與噪聲的,選擇的濾光鏡的組合為活細胞成像應密切匹配的實驗中所用的熒光光譜檔案。例如,使用一個標準的熒光素(FITC濾光鏡集的多色標記的應用程序中的圖像細胞表達本身會不必要地犧牲一些YFP的熒光黃色熒光蛋白(YFP),否則將改善的信號-噪聲(設計參見圖7a))。在這種情況下,匹配濾光鏡與適當寬的帶通激發YFP的吸收和發射公司產生顯著更高的信號耦合到一個長通發射濾光片。

imaging systems figure7

 

優化熒光濾光器的組合,以獲得盡可能高的信號電平的一個例子,提出了在圖7中的兩個常用的熒光蛋白衍生物。頂部麵板(圖7a)和圖7b))示出的吸收和發射光譜金星,位點定向誘變產物YFP,疊加超過FITC標記的濾光鏡組(圖7的(a)),以及一個專門的寬帶組合旨在最大限度地采集的信號,在一般情況下,從黃色熒光蛋白(圖7b))。雖然發射濾光鏡與問候到檢測器發送的信號的電平相媲美,金星的吸收光譜,和異硫氰酸熒光素的激發濾光片帶通區域是顯著小於寬帶YFP集觀察之間重疊,導致低效的激勵和減少信號。同樣,TRITC濾光器組合(圖圖7c))不激發mCherry熒光蛋白的效率作為得克薩斯紅集(圖圖7d))。此外,在得克薩斯紅組合的發射濾光鏡的更寬的帶寬通過更​​多的信號的檢測器。關於選定的濾光鏡組合應仔細檢查每個活細胞成像實驗中使用的熒光激發和發射,以確保最高的效率。

 

除了設計單個熒光圖像的標準濾光鏡的組合,多頻帶集現在隨時提供給能夠同時與兩個或更多的熒光探針標記的試樣的照明和探測。其他因素時,必須考慮微調顯微鏡的光學列車是中性密度濾鏡的戰略定位,激發照度水平(活細胞熒光成像的關鍵),以及紫外線和紅外線濾光鏡,以減少抵消或消除樣品光毒性。這些濾光鏡通常置於之間的電弧放電(或激光)的照明源和顯微鏡的輸入光端口,並且可以很容易地互換,以優化光的吞吐量。通過顯微鏡的光通過的強度和數值孔徑也可以通過仔細調整的冷凝器或落射照明光圈和視場光闌調節。

 

光學分辨率探測器的幾何形狀相匹配

隻要有足夠的采樣由檢測器係統的光學圖象,在顯微鏡下拍攝到的圖像的空間分辨率通常被定義的光學係統的分辨率。由於從每個都具有一個固定的大小的光電二極管的陣列構成的CCD探測器,幾何形狀的各個像素可以限製最終的分辨率的圖像。為了實現大的分辨能力的顯微鏡,檢測器的尺寸應符合每個艾裏斑單元為2.53像素的奈奎斯特采樣準則。作為一個例子,250納米的光學分辨率極限,在最終圖像中的像素的大小應是約80100納米。在活細胞成像,信號噪聲比光學分辨率往往是更重要的,最有用的限製收集圖像沒有明顯的退化是每艾裏斑的2個像素。減少每艾裏單元的像素的數量增加的亮度的圖像,並使得能夠使用較大的CCD光電二極管,可以積累更多的光電子。

 

8所示的(a)是通常用在投影到CCD像素陣列的表麵的活細胞成像的高數值孔徑的物鏡的艾裏磁盤從圖像。陣列中的每個像素的尺寸為6微米。的100倍的物鏡,用1.4的數值孔徑,將圖像投影到CCD表麵直徑是20微米(見表1),從而容易地實現奈奎斯特采樣大小(3.3像素每個艾裏單元)。在本次抽查頻率,留有足夠的餘量,幾乎滿足奈奎斯特準則,甚至用2×2像素組合。相比之下,60x物鏡(也1.4數值孔徑)的投影圖像是12微米的直徑,僅低於奈奎斯特限製的下邊界。另外,即使減小數值孔徑為1.3,在40倍的物鏡產生一個8.4微米的圖像,將需要一個放大鏡照相機適配器符合奈奎斯特分辨率標準。光電二極管陣列具有更大或更小的像素尺寸相匹配的光學分辨率,沒有中間放大的顯微鏡,或用專門的CCD適配器,其中包含合適的鏡頭係統,可以輕鬆地修改。

 

甲的2×2像素binning示意圖在圖8b)為一個包含16個像素的陣列。的光電子在曝光期間積累後,相機讀出電路執行兩個連續的4個象素,每個象素的平行移動。隨後,兩個串行寄存器位移的1個像素的地方收集的4個像素(2×2像素合並)到它們的電壓的輸出節點,其中讀出放大器的光電子。在類似的方式中,4×4像素合並(圖中未示出)將在整個16個像素陣列中的內容轉移到輸出節點,在讀出之前,顯著增加了,同時減少了讀出噪聲的信號。正如前麵所討論的,像素binning是一個極好的方法來檢索弱信號時,檢查在低表達水平降低毒性工件所需標記的熒光蛋白的活體標本。

 

在實踐中,理想的像素大小在最終圖像中具有的數值孔徑為1.4的一個物鏡是在100納米和120納米之間。這個數字翻譯成相應的物理尺寸的CCD光電二極管,需要考慮的放大倍數為物鏡。例如,為了實現為60x物鏡1.4數值孔徑)的完整的光學分辨率的檢測器必須具有一個光電二極管6微米或更小的大小的(確定的倍率和分辨率的乘積)。然而,對於相同的數值孔徑的100倍的物鏡,最佳的光電二極管的大小被增加至10微米。因此,顯而易見的是,僅一個特定的CCD攝像機的數字分辨率匹配的顯微鏡的光學分辨率,當相機被適當地聯接到適當的物鏡。交配的CCD照相機,具有10微米的光電二極管,以100倍的物鏡,將導致在一個最終的像素大小的圖像(100納米)。相同的相機時,會產生167納米的像素用一個60倍的物鏡,這限製了在一定程度上記錄的圖像分辨率。與此相反,與6微米的光電二極管的CCD將被完全匹配到60x物鏡,但會產生過采樣的圖像時,顯微鏡物鏡轉換器是旋轉插入的100倍的物鏡。過采樣在這種方式中,將顯著地降低圖像的亮度的同時,不能提高分辨率。

 

從前麵的討論,它似乎唯一相匹配的檢測器的像素分辨率的顯微鏡的光學係統的理想的解決方案是使用針對每個物鏡的不同的攝像機。在實踐中,很明顯,這種策略是不現實的,必須找到一個妥協的單相機係統優化工具。在某些情況下,通過安裝的客觀時間倍率的顯微鏡和照相機之間的耦合器的分辨率的問題,可以規避。例如,一個0.6倍的耦合適配器將降低投影圖像的倍率從100倍的物鏡是相同的一個60x物鏡。各種各樣的耦合器提供的售後分銷商增加或減少的CCD光電二極管陣列平麵的投影放大。轉乘半信半疑上述建議的數字CCD攝像機方麵,重要的是要注意,雖然這些器件可以相對容易地從顯微鏡,除去它是優選離開將相機安裝在顯微鏡的端口,以防止灰塵和碎屑進入身體的顯微鏡和從附著在攝像機圖像的傳感器窗口(靜電促進的工件)。清潔傳感器麵板窗口是一個異常困難的任務,特別是當物鏡是完全刪除的每一個粒子的灰塵。

像素大小的要求比對顯微鏡的光學分辨率

目的
(數值孔徑)

分辨率限製
(微米)

投影尺寸
(微米)

所需的像素大小
(微米)

1X0.04

6.9

6.9

3.5

2X0.06

4.6

9.2

4.6

2X0.10

2.8

5.6

2.8

4X0.10

2.8

11.2

5.6

4X0.12

2.3

9.2

4.6

4X0.20

1.4

5.6

2.8

10X0.25

1.1

11.0

5.5

10X0.30

0.92

9.2

4.6

10X0.45

0.61

6.1

3.0

20X0.40

0.69

13.8

6.9

20X0.50

0.55

11.0

5.5

20X0.75

0.37

7.4

3.7

40X0.65

0.42

16.8

8.4

40X0.75

0.37

14.8

7.4

40X0.95

0.29

11.6

5.8

40X1.00

0.28

11.2

5.6

40X1.30

0.21

8.4

4.2

60X0.80

0.34

20.4

10.2

60X0.85

0.32

19.2

9.6

60X0.95

0.29

17.4

8.7

60X1.40

0.20

12.0

6

100X0.90

0.31

31.0

15.5

100X1.25

0.22

22.0

11.0

100X1.30

0.21

21.0

10.5

100X1.40

0.20

20.0

10.0

1

 

目前的高性能數碼相機係統設計的熒光顯微鏡光電二極管尺寸從516微米,具有片上分級。如上所討論的,像素合並功能使從幾個相鄰的光電二極管的電荷被合並成一個較大的單位,有效地增加了的像素的大小。在68微米的光電二極管的尺寸範圍的攝像機,充分顯微鏡光學分辨率通常可以被匹配使用60x物鏡沒有像素合並,而與100倍的物鏡,以提高圖像的亮度可以利用像素合並成一個2×2陣列的光電二極管。除了利用匹配的光學係統分辨率的CCD,使用更高的傳輸60x物鏡,這種方法允許更明亮的圖像時,使用100倍的物鏡結合分級(2×2像素組合提高了靈敏度4倍)。其結果是,用100倍的物鏡記錄圖像,在紙槽2是大約兩倍與60x物鏡沒有像素合並作為記錄的圖像的亮(及同等或更好的分辨率)。在額外的靈敏度的情況下,需要或必要時,可以60倍的物鏡分級2×2的亮度增加了四倍並發損失通常是可以接受的決議,對於大多數活細胞成像調查。

 

在一些應用中,如那些需要一個大的細胞種群的同時監測,捕獲的較大部分的視野是更重要的空間分辨率。該矩形的CCD圖像傳感器,在數碼相機中,沒有中間倍率不捕獲整個視場的通過顯微鏡目鏡作為可視化的,而是它被限製為30%和80%之間的範圍內,取決於芯片尺寸。是必需的,如果一個較大的視野耦合適配器(如上所述),可以采用時間倍率。在許多情況下,一個0.6倍的中繼透鏡將投影的圖像的大小,其值接近在目鏡看到的視圖,但在一定的成本在分辨率。或者,為了保持分辨率,相鄰的字段的多個圖像可以聚集在高放大倍率使用x - Ŷ機動掃描階段和隨後縫合在一起成一個較大的圖像使用采集後處理軟件。

 

在光學顯微鏡的最大的分辨能力,實現與近紫外光,最短的有效成像波長。其次是藍色,綠色,最後變為紅色光的能力,以解決樣本的詳細近紫外光。在大多數情況下,顯微鏡使用廣譜白色的光所產生的鎢鹵燈泡照亮標本,但在活細胞成像的照明的頻譜通常僅限於通過窄帶幹涉濾光片的應用。在可見光光譜的中心在約550納米,主波長為綠色光(人眼最敏感的綠色光)。它是這樣的波長,被用來計算分辨率值示於表1,所以這些值將不同當利用較高或較低的波長的光時,。的數值孔徑值也是重要的,更高的數值孔徑也將產生更高的分辨率,可以觀察到的物鏡表中的類似的倍率。

 

結論

也許最關鍵的活細胞成像方麵實現最佳平衡信號強度低倍率的青睞,分辨率(放大倍率越高,所青睞),和細胞活力的放大倍率,同時在試驗過程中。調查員必須密切注意,以配合最終的像素大小的探測器,利用盡可能少的鏡片的光學放大倍率。光學耦合器,具有各種各樣的中間放大係數是市售匹配兩個光限製和高分辨率的應用程序的特定的客觀要求(倍率和數值孔徑)。Nyquist分辨率標準時,應嚴格選擇的物鏡放大倍率。每個像素應該對應於不超過一半所需的分辨率的限製,由於在顯微鏡的衍射極限,此距離應不小於50納米的大多數應用程序。

 

幹部的活細胞成像顯微鏡的物鏡通常采用的標準是10倍和40倍(幹),以及40X60X100X的油或水浸泡版本。經濟型幹式低倍率的鏡頭主要用於標本的初步掃描,以找到感興趣的領域和不需要的高光校正因素。然而,浸沒透鏡應設有高的數值孔徑(1.31.45的油和水為1.2)和高的光透射效率。由於圖像通常聚集的中心附近的視野,高度校正的物鏡,這些物鏡通常產生一個平麵場提供沒有可檢測到的好處是明顯更昂貴的和更少的光效率比少許校正物鏡。用於熒光成像物鏡應檢查的點擴散函數使用熒光微球的質量。

 

冷卻單色CCD相機是最好的選擇,對於大多數成像應用領域涉及文化的活細胞,無論是否落射熒光還是透射光對比度增強(DIC和相襯)是主要的收購模式。在選擇相機時,考慮的重要參數,包括量子效率,噪音水平(暗電流和讀出),像素大小(以及相關的全井產能),並掃描頻率。為了盡量減少水平的激發光,照射在試樣上,相機應該盡可能敏感,這通常意味著量子效率高,噪聲低,大的像素尺寸,和慢的掃描速率。靈敏度因此,必須對所要求的分辨率(青睞大量的更小的像素)和物鏡成像率(由較高掃描頻率的青睞)平衡。

 

慢掃描CCD相機一般都在他們的幀速率的限製,此外,樣本,除非有非常明亮的熒光,信號 噪聲比是差時的曝光時間短。這限製了使用這些攝像機係統的高速成像應用程序(高達每秒30幀),和挫敗嚐試聚焦樣本。應努力以避免漂白和光毒性,可能會損害細胞的活力和亮度的工件,當找到一個合適的標本和對焦的攝像頭。在這方麵,應選擇相機功能無快門,幀傳輸或隔行掃描CCD傳感器,這是能夠提供除了慢掃描數字信號的圖像在視頻速率的連續流。極端低光照條件下,熒光探針顯示有限的豐度或低的量子產率,再加上捕捉高速運動的要求,有必要強化或電子倍增CCD相機係統使用。



滬公網安備 31011202003519號