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奧林巴斯顯微鏡:熒光的基本概念

2013-10-16  發布者:admin 

熒光是敏感,其中創建的物理(例如,光的吸收),機械(摩擦),或化學機製從電子激發態的分子發光的無處不在的發光過程家族的成員。通過由紫外線或可見光的光子的分子的激發發光發電的是這樣一種現象稱為光致發光,正式分為兩大類,熒光磷光,這取決於激發態的電子組態和排放路徑。熒光是一些原子和分子的屬性,在一個特定的波長吸收光,並隨後經過短暫的時間間隔更長的波長的光發射被稱為熒光壽命。發生的方法的磷光熒光的方式類似,但是具有更長的激發態壽命。

fluorescenceintro figure1

熒光的過程是由三個重要的活動,所有這些由幾個數量級的(見表1),分離的時間尺度上發生。激發的易感分子由一個傳入的光子發生在飛秒(10E-15秒),而最低能量級別的激發態電子振動弛豫是慢得多,並且可以測量在皮秒(10E-12秒)。最終的過程中,發射的較長波長的光子,並返回到基態的分子,納秒(10E-9秒),在相對長的時間內發生。雖然整個分子的熒光壽命,激發排放,僅在十億分之一秒,這種現象是一個驚人的表現,光與物質之間的相互作用形成的基礎,廣闊的領域的穩態和時間分辨熒光光譜儀和顯微鏡。由於極大地敏感排放概況,空間分辨率和高特異性的熒光調查,該技術正迅速成為遺傳學和細胞生物學的重要工具。

一些調查報告在十七和十八世紀的發光現象,但它是英國科學家喬治爵士G.斯托克斯熒光誰首先介紹於1852年,是負責鑄造項榮譽的藍白色熒光的礦物熒光(氟石)。斯托克斯還發現發射光譜的波長漂移到更大的值,他的名字命名。在二十世紀早期的一部分,由幾個著名的科學家,其中包括8月克勒和卡爾·賴克特,最初報道的熒光是一個討厭鬼,在紫外線顯微鏡的光學顯微鏡熒光第一次遇到。第一熒光顯微鏡由德國物理學家奧托·Heimstädt和海因裏希·萊曼在1911年和1913年之間,作為一個分拆上市的紫外線儀器。這些顯微鏡觀察到細菌,動物和植物組織的自體熒光。此後不久,斯坦尼斯拉夫·馮·Provazek推出了一個新的時代,當他用熒光顯微鏡來研究固定的組織和活細胞中的染料結合。然而,直到20世紀40年代初,阿爾貝浣熊開發出一種技術,用熒光染料標記抗體,從而造就了免疫領域的。到二十一世紀之交的,本場熒光顯微鏡在細胞生物學中的一場革命,負責特定的多個標簽的單個細胞器和大分子複合物合成和基因編碼的熒光探針耦合的力量,活細胞成像。

熒光過程的時間尺度範圍內

過渡

過程

速率常數

時間刻度(秒)

S(0)=> S(1)或S(n)

吸收(激發)

瞬間

10 -15

S(n)=> S(1)

內部轉換

K(IC)

10 -14到10 -10

S(1)= S(1)

振動弛豫

K(VR)

10 -12到10 -10

S(1)= S(0)

熒光

K(F)或Γ

10 -9至10 -7

S(1)=> T(1)

係統間的隧道

K(PT)

10 -10至10 -8

S(1)= S(0)

非輻射
弛豫猝滅的

K(NR),K(Q)

10 -7至10 -5

T(1)= S(0)

磷光

K(P)

10 -3至100

T(1)= S(0)

非輻射
弛豫猝滅的

K(NR),K(QT)

10 -3至100

表1

熒光一般是與高度共軛的多環芳香族存在在幾個能量水平在地麵狀態下,每一個與一個特定的安排的電子的分子軌道中任一項的分子研究。一個分子的負電荷的分布和整體分子的幾何形狀確定的電子狀態。對於任何特定的分子中,存在幾個不同的電子態(在圖1中示出為S(O) S(1) S(2) ),根據總的電子能量和各種電子自旋態的對稱性。的每一個電子的狀態被進一步細分成若幹與原子核和成鍵軌道的振動和轉動能級。對於大多數有機分子的基態電子單中的所有電子的自旋配對(有相反的旋轉)。在室溫下,極少數分子存在於任何其他國家比基態的最低振動能級,從而有足夠的內部能量,激發過程通常來自這個能量水平。

類分子能夠發生電子躍遷,最終結果是已知的作為熒光探針熒光染料,或僅僅染料熒光。熒光染料的共軛到一個更大的大分子(如核酸,脂質,酶,或蛋白質),通過吸附或共價鍵被稱為熒光團。在一般情況下,熒光團被分成兩大類,稱為內在的外在的。內在的熒光基團,如芳族氨基酸,神經傳遞素,卟啉,和綠色熒光蛋白,是那些自然發生。外源性熒光基團是人工合成的染料或修改的生化物質被添加到一個樣本具有特定的光譜特性產生熒光。

吸收,激勵和排放

發生在不同的分子軌道激發態之間的間隔緊密的振動和轉動能級的熒光染料吸收的能量。有古典的雅布隆斯基能量圖(見圖1),命名榮譽的波蘭物理學教授亞曆山大·雅布隆斯基的各種能量水平參與的吸收和發射光的熒光。一個典型的雅布隆斯基圖示出的單峰接地(S(0) )的狀態,以及第一(S(1) )和第二(S(2) )的激發單重態的水平線作 ​​為堆棧。在圖1中,較厚的線表示電子的能量水平,而較薄的線表示的各種振動的能量狀態(旋轉能量狀態將被忽略)。作為直鏈或波浪形箭頭所示狀態之間的轉換,取決於是否吸收或發射的光子(直箭頭)或查詢結果,從分子的內部轉換或非輻射弛豫過程(波狀箭頭)與過渡。垂直向上箭頭用來表示的瞬時性激發過程,同時保留更長的時間尺度上發生的這些事件的波浪形箭頭。

吸收的光的發生非常迅速(約飛秒,所必需的時間為旅行單一波長的光子)在離散量稱為量子和對應於從基態躍遷至激發態的熒光激發。同樣地,通過熒光或磷光發射的光子在量子方麵也被測量。量子中的能量(普朗克法)由以下方程表示:

E =hν =HC /λ

其中 ,E 是能量,h是普朗克常數,νλ是入射光子的頻率和波長的,  c 是光的速度。普朗克定律決定的吸收的光子的輻射能量成正比的頻率和波長成反比,即入射的波長較短具有更大的量子能量。的吸收一個光子的能量,它的發生是由於振蕩與分子中的電荷(電子)的光波的電場矢量的相互作用,由熒光團是一個全或無的現象,並且可以隻發生與入射光特定波長的吸收帶。如果被吸收的光子包含更多的能量比為一個簡單的電子躍遷是必要的,多餘的能量通常被轉換成振動和轉動能量。然而,如果之間碰撞發生的分子和一個光子具有足夠的能量,以促進過渡,不發生吸收。譜寬的吸收帶產生緊密間隔的振動能量水平加上熱運動,使一個範圍的光子能量,以符合特定的過渡。由於激發的分子通過吸收通常發生在電子自旋配對而不改變,激發態也是一個單峰。在一般情況下,熒光調查工作是在輻射具有波長範圍從紫外到的電磁波譜的可見光區域(250〜700納米)。

使用紫外線或可見光,常見的熒光團通常是興奮較高振動能級(S(1) )的第一或第二(S(2) )的單峰的能量狀態。之一的吸收(或激勵)的轉換示於圖1(左手綠色箭頭)的發生,從最低的基態的振動能級更高的振動水平的第二激發態(過渡記為S(O) = 0〜S(2) = 3)。第二激勵過渡描繪從第二級的振動的基態的第一激發態的最高的振動水平(表示為S(0) = 1 S(1)= 5)。在一個典型的熒光基團,具有寬的光譜的波長的照射會產生允許的躍遷,填充的各種振動的激發態的能級的整個範圍。一些這些過渡將具有高得多的程度的概率比其他人,並相結合時,將構成該分子的吸收光譜。請注意,對於大多數熒光,吸收光譜和激發光譜是不同的,但往往重疊,有時可能會變得難以區分。在其他情況下(例如熒光素,)的吸收光譜和激發光譜清楚地隔開。

fluorescenceintro figure2

緊隨吸收一個光子,幾個進程將發生的不同的概率,但最有可能將是最低的振動能量的第一激發態(S(1)= 0,圖1)的水平的放寬。這個過程被稱為作為內部轉換振動弛豫(光發射的情況下的能量損失),一般發生在一皮秒或更少。因為蒸發過程中激發態的壽命顯著的振動周期,分子幾乎總是進行完整的振動弛豫在他們興奮的壽命。過量的振動能量被轉換成熱量,該熱量被吸收由相鄰的溶劑分子碰撞的激發態的熒光團時。

期間納秒(時間最長的時期,在熒光過程由幾個數量級)的順序,最後才放寬到基態的激發態分子中存在的最低激發單重態(S(1) )。如果從這個長期存在的狀態是伴隨著放鬆發射一個光子,這個過程是正式稱為熒光。緊密排列的振動能級的基態,再加上正常的熱運動時,在發射的光子能量,產生廣泛。其結果,通常觀察到熒光發光強度以上的頻帶的波長,而不是一個清晰的線。大多數熒光基團可以成千上萬次重複的激發和發射周期數以百計的高反應性的激發態的分子是光致漂白之前,導致銷毀熒光。例如,充分研究的探針的熒光素異硫氰酸酯(FITC)可以為約30,000個周期前的分子不再響應入射照明光進行激發和放鬆。

其他幾個弛豫途徑有不同程度的概率與熒光發射過程競爭。非輻射激發態能量可以消散熱量(由青色波狀圖1中箭頭所示),激發熒光團可以與另一分子碰撞,來傳遞能量的非輻射過程中的第二類型(例如,猝滅,如所指示的紫色波浪箭頭在圖1中),或者被稱為係統間跨越的最低激發三重態能發生(在圖1中的藍色的波浪形箭頭)的現象。後一種情況是比較少見的,但最終的結果無論是在發射的光子通過磷光或產生延遲熒光的激發單重態的過渡。禁止來自三重激發狀態的轉換到單線基態,這會導致在三重態發光的幾個數量級低於用於熒光的速率常數。

三重態躍遷圖解雅布隆斯基能量輪廓上的右手側在圖1中示出。間竄越低概率發生的事實,分子必須先經過旋轉轉換未成對電子,不利的過程。三重態的基本重要性是所表現出分子在該狀態下,其結果往往是在漂白和生產造成的損害的自由基的化學反應性的高度。在生物樣本中,溶解的氧是一種非常有效的在三重態的熒光的猝滅劑。這通常是一個三重的基態氧分子,可以激發單重態反應,導致的反應,漂白劑,熒光或具有活細胞光毒性影響。三重態的熒光基團中也可以直接與其它生物分子的反應,通常在這兩個物種的失活所導致。分子中含有重原子,如鹵素和許多過渡金屬,通常方便係間竄越經常磷光。

從基態(S(0) )發生的激發單重態(S(1) )的過渡的概率取決於一個電子時,駐留在與那些的接地狀態對之間的相似程度的振動和轉動的能量狀態目前處於興奮狀態,圖2中列出的。圖2中示出的Franck-Condon能量圖呈現的振動能量的概率分布之間的各級在地麵(S(0) )和第一激發 S (1) )指出針對一種假設的分子。激發從地麵到激發態的躍遷(紅色線)發生在這樣一個短的時間內(飛秒)的核間的距離與成鍵軌道不具有足夠的時間來改變,從而轉換被表示為垂直線。這個概念被稱為“ 弗蘭克-康登原理。的最大吸收波長(紅色線在中心)表示的最可能的核間距在基態到允許的振動能級處於興奮狀態。

fluorescenceintro figure3

在室溫下,是不足夠的熱能,顯著填充興奮的能量狀態和最有可能的電子狀態是基態(S(O) ),其中包含了一些不同的振動能量狀態,每個不同的能量水平。最被看好的過渡將是那些最大限度的轉動和振動的電子密度概率重疊的基態和激發態(見圖2)。然而,不同波長(與量子)的入射的光子可以具有足夠的能量,以被吸收,並常常產生來自其他核間的分離距離和振動能級轉換。這種效應引起到包含多個峰(圖3)的吸收光譜。廣泛的光子能量與吸收轉換熒光基團,使產生的光譜顯示為寬波段,而不是離散線。

假設的在圖3中示出的吸收光譜(藍波段)的查詢結果從幾個偏愛的電子從基態躍遷至激發的最低能量狀態(標記為S(O) S(1) ,分別)。的吸收光譜是疊加在垂直線(黃色)代表從在基態的最低振動能級轉換到較高的振動能級處於興奮狀態。需要注意的是過渡到最高的振動激發水平是那些發生在較高的光子能量(低級波長或更高的波數)。沿著上圖3的橫軸表示在電子伏特(eV)與轉換相關的近似能量。還包括與態和激發態的振動能級沿右側縱坐標。

通過熒光團的吸收光譜的掃描,同時記錄在一個單一的波長(通常為最大發射光強度的波長)的發光強度,將產生的激發光譜。同樣,令人興奮的在單一波長(再次,優選的最大吸收波長)的熒光團,而通過掃描的發射波長將揭示的發光光譜的更新。可被視為概率分布函數給定的量子能量的光子將被吸收,並最終使熒光團發射的熒光輻射的形式的第二光子激發和發射光譜。

Stokes位移和鏡像規則

如果仔細審核的熒光團的熒光發射光譜,幾個重要的特點變得顯而易見。作為快速的內部轉換的結果,從較高的初始的S(1)激發態的最低振動能級的激發態的激發能量(波長)的發光光譜是獨立的。對於許多常見的熒光基團的振動能級間距是相似的基態和激發態,從而導致的熒光光譜的吸收光譜,外觀極像的鏡像。這是由於這樣的事實,相同的轉換是最有利的吸收和發射。最後,在溶液中(如熒光團一般研究)的詳細的振動結構一般是丟失,顯示為一個寬峰的發射光譜。

如前所述,光子吸收後,激發熒光團將迅速進行鬆弛到最低的振動能量的激發態。這種快速的內部轉換的一個重要後果是,所有後續的繼續從最低級的振動激發態(S(1) )的的放鬆途徑(熒光,無輻射弛豫,間竄躍等)。具有吸收,激發態的電子在將返回一個特定的振動的能量水平在地麵狀態的概率是正比於在各自的狀態(圖2)之間的能量水平的重疊。返回到基態(S(O) ),通常會出現更高的振動水平(參見圖3),其後達到熱平衡(振動弛豫)的過渡。因為發射一個光子經常離開更高的振動的基態中的熒光基團,發射光譜是典型的吸收光譜得到的從地麵到第一激發態的過渡的鏡像圖像。效果,返回到一個特定的在地麵狀態的振動能級的電子的概率是類似的,電子的激發前的狀態中的地麵位置的概率。被稱為鏡像規則,則說明這個概念,在圖3的排放轉換(藍線)從最低振動能級的激發態回到基態的各種振動水平。將得到的發射光譜(紅色條帶)是顯示由假想的生色團的吸收光譜的鏡像圖像。

fluorescenceintro figure4

在許多情況下,由高能量光子激發導致較高的電子和振動水平(S(2) S(3) ,等),從而迅速失去多餘的能量,作為熒光團放鬆的最低振動能級的人口第一激發態(見圖1)。由於這種快速弛豫過程,發射光譜通常是獨立的激發波長(一些熒光團發射從更高的能量狀態,但這種活性是罕見的)。出於這個原因,發射是最低激發態躍遷的接地狀態,但是不是整個的吸收光譜,其中可能包括轉換到較高的能量水平的鏡像。鏡像規則的一個極好的測試是檢查中的線性圖的波數(波長或在每厘米的波的數目的倒數),這是直接正比於頻率和量子能量的吸收和發射光譜。當以這種方式(參見圖3),消光係數和涉及相互轉換時作為一個功能的能量產量鏡像光譜的激發和發射光譜的強度之間的對稱。

圖4中的奎寧的吸收和發射光譜,自然發生的抗瘧疾劑(第一個已知的熒光團)最初於1845年由約翰·弗雷德裏克·威廉·郝薛爾的熒光性質。的奎寧不堅持鏡像規則,這是顯而易見通過檢查單峰的發射光譜(460納米),這並不反映在兩峰在雙峰吸收光譜在310和350納米的特色,。更短的波長的紫外線吸收峰(310納米),是由於激發過渡到第二激發態(從S(0) S(2) ),迅速鬆弛到最低激發態(S(1) )。其結果是,會發生熒光發射專門從最低激發單重態(S(1) ),從而在一個頻譜鏡像地麵,奎寧第一激發態的過渡(350納米的峰值),而不是整個的吸收光譜。

由於與熒光發射轉換(參見圖1-4)相關聯的能量通常是小於吸收,得到的發射的光子具有較少的能量,並移動到更長的波長。這種現象通常被稱為斯托克斯位移,並普遍采用的解決方案的調查,幾乎所有的熒光基團發生。的斯托克斯位移(Stokes shift)的主要來源是激發電子的S(1)激發態的最低振動能級的快速衰變。此外,熒光發射通常是伴隨著由轉換到更高的振動能量水平的地麵狀態,導致在熱平衡的多餘的振動能量的激發能量的進一步損失。其他事件,如溶劑的取向效應,激發態的反應,形成複合物,和共振能量轉移,也可有助於較長的發射波長。

斯托克斯位移(Stokes shift)在實踐中,被測量為在一個特定的熒光染料或熒光團的激發和發射光譜的最大波長之間的差異。的移位的大小不同的分子結構,但可以從幾納米到幾百納米的範圍內。例如,對於熒光素的斯托克斯位移(Stokes shift)是約20納米,而移位奎寧是110納米(參見圖4),卟啉是超過200納米。斯托克斯位移的存在是非常高的靈敏度的熒光成像測量的關鍵。紅色發射移位精度帶寬的光學過濾器的使用,使到達檢測器,以有效地阻止激發光從相對微弱的熒光信號(具有低發射的光子數),所以可以觀察到對一個低噪聲的背景。

消光係數,量子產率和熒光壽命,

在描述和比較熒光常用的三個基本參數的消光係數(ε),量子產率(Φ),和熒光壽命(τ)。摩爾消光係數被廣泛采用光譜,顯微鏡和熒光的字段中,以轉換成的各種化學物質的摩爾濃度的單位的單位的吸光度。的消光係數確定為1摩爾濃度 M )(1摩爾每升)的目標化學品具有一厘米的路徑長度中的比色皿,通過測量在參照波長(吸收分子的特征)的吸光度。參照波長通常是紫外線或可見光光譜中的最大吸收波長。消光係數是熒光團,以吸收光的能力的直接量度,和那些具有高消光係數的生色團也具有高的熒光發射的概率。此外,因為熒光團特性壽命(在下麵討論)是成反比的消光係數,表現出高的消光係數的分子激發態和一個短的固有生命期。

量子產率(有時會錯誤地稱為量子效率)是一個計量表來測量的效率的熒光發射相對放鬆的所有可能的途徑,一般表示為發射到吸收的光子數的光子的比(無量綱)。換句話說,量子產率代表一個給定的激發的熒光染料將產生的發射光子(熒光)的概率。的量子產率通常範圍之間的一個零值,並且通常使用的熒光分子作為探針在顯微鏡有範圍從非常低(0.05或更小),以幾乎統一(最亮的熒光基團)的量子產率。高量子產率在一般情況下,在大多數成像應用中是可取的。一個給定的熒光團的量子產率變化,有時大極端,與環境因素,如pH值,濃度,和溶劑極性。

fluorescenceintro figure5

的熒光壽命為特征的分子仍然處於激發態返回到基態的時間是一個指標提供的信息,將收集到的排放概況。在激發態的壽命,熒光發生構象變化以及與其它分子和漫過當地的環境進行互動。用短暫的光脈衝激發的分子在一個統一的人口的作為時間的函數的熒光強度的衰減是由一個指數函數描述:

I(t) = Io • e(-t/τ)

其中I(t)的是在時間的測得的熒光強度,I(o)激發後立即觀察到的初始強度,τ是熒光壽命。正式地說,是指在一定時間的熒光壽命,其中的初始熒光強度的熒光衰變的初始強度的1/e(約37%)(參見圖5的(a))。這個量是從激發態到基態的熒光衰減的速率常數的倒數。

由於水平的熒光分子的激發單重態的數目成正比,壽命測量可以通過測量經過短暫脈衝激發的熒光衰減進行。在均勻的溶劑,熒光衰減通常是一個單指數函數,如示出的熒光強度的圖,圖5(a)和圖5(b)中作為時間的函數的。更複雜的係統,如活組織和活細胞,包含一套混合的環境中,往往產生多指數的值(圖5(c))時,熒光衰減測量。此外,還有一些其他進程競爭與熒光發射返回到基態,激發態電子,包括內部轉換,磷光(間竄躍)和淬火。除了熒光和磷光,非輻射過程的主要機製是放鬆的激發態電子。

所有非熒光進程的爭奪的激發態電子的失活,可以方便地組合成一個單一的速率常數,稱為非輻射速率常數和變量k(nr)所表示。非輻射速率常數通常會忽略任何從振動弛豫的貢獻,因為這些轉換是快速的速度(皮秒)的幾個數量級的速度比慢失活(納秒級)轉換。因此,現在可以被表達的量子產率,速率常數是:

Φ=光子發射/吸收光子= kf/(kf + knf) = τf/τo

其中K(F)是用於熒光衰變(符號Γ也用於指定該速率常數)的速率常數。的衰變速率常數的倒數等於內在的生命周期T(O) ),它被定義為激發態的壽命在所有進程的情況下,競爭激發態失活。在實踐中,由非輻射過程的熒光的激發態壽命縮短,導致測得的壽命(T(f)),這是一個組合的內在壽命和競爭的非熒光弛豫機製。由於測得的壽命總是不到的內在一生,量子產率從來沒有超過價值的統一。

光學顯微鏡中使用的共同的探針有許多以納秒為單位測得的熒光壽命,但這些可以在寬範圍內變化,這取決於分子結構,溶劑,和環境條件。定量熒光壽命測量,使研究者具有相似的光譜特征,但不同的生命周期的熒光團之間的區別,並且還可以對當地環境的線索。具體而言,在探頭附近的pH值和濃度的離子可確定不知道的本地化的熒光基團的濃度,這是使用時,與活細胞和組織的探針濃度可能不是均勻的顯著好處。此外,壽命測量是不敏感的漂白文物比強度測量。

淬火和漂白

淬火和光漂白的後果是有效地減少排放量,並在設計和執行熒光調查,應該是首要考慮的。這兩種現象往往是不同的淬火而漂白是不可逆的。猝滅來自各種競爭的進程,誘導到基態時,這可能是在本質上是分子內或分子間的非輻射弛豫(沒有光子發射)的激發態電子。由於非輻射躍遷途徑競爭與熒光弛豫,他們通常顯著降低或者,在某些情況下,完全消除發射。大多數的淬火工藝的作用,以減少激發態的壽命和受影響的熒光量子產率。

一個常見的例子觀察淬火與激發態的熒光團和另一個(非熒光)在溶液中,產生的熒光團的失活,並返回到基態的分子的碰撞。在大多數情況下,既不的分子的化學變化中的碰撞猝滅過程。各種各樣的簡單的元素和化合物的行為作為碰撞猝滅劑,包括氧,鹵素,胺,和許多缺電子的有機分子。碰撞淬火可以揭示存在局部淬滅劑分子或基團,通過擴散或構象的變化,可能發生碰撞的熒光在激發態的壽命。碰撞淬滅的機製,包括電子轉移,自旋-軌道耦合和係統間交叉的激發三重態。經常使用的其他術語交替與碰撞淬火內部轉換和動態猝滅。

fluorescenceintro figure6

第二種類型的猝滅機製,被稱為靜態複雜的淬火,來自非熒光配合物之間形成的,用來限製通過減少人口的活性,可激發的分子吸收的淬滅基團和熒光基團。產生這種情況的熒光物種時,形成了一個可逆的絡合物與猝滅劑分子在基態,並且不依賴於擴散或分子碰撞。在靜態猝滅,熒光發射的減少而改變激發態的壽命。熒光基團處於興奮狀態,也可以偶極共振能量轉移機製終止時,在鄰近的受體分子激發態能量可轉移到非輻射。在某些情況下,可以通過非分子機製,如衰減的入射光的吸收的物種(包括發色團本身)發生淬火。

以淬火相反,光漂白(也稱為衰落)熒光團時,會發生永久地失去熒光由於光子誘導化學損傷和共價修飾的能力。從激發單重態到三重態的過渡後,熒光基團可以與另一個分子相互作用,以產生不可逆的共價修飾。相對長壽命三重態相對於單重態,從而使激發態分子發生化學反應,在環境中的組件的一個更長的時間範圍。的激發和發射周期所發生的一個特定的熒光漂白前的平均數量取決於分子結構和當地的環境。一些熒光基團快速漂白後隻發射一個光子,而更健壯的人,可以進行漂白前的數千或數百萬個周期。

圖6給出的是光漂白(褪色)中觀察到的一係列的數字拍攝的圖像,在不同的時間點為乘法染色培養牛肺動脈上皮細胞的一個典型例子。用4,6 -二脒基-2 -苯基吲哚(DAPI,藍色熒光)的細胞核進行染色,而染色的線粒體和肌動蛋白細胞骨架與MitoTracker紅(紅色熒光)和鬼筆環肽衍生物(綠色熒光),分別。時間點取在兩分鍾的時間間隔,使用熒光過濾器的組合與調整,以激發熒光基團,同時也記錄合並發射信號的帶寬。請注意,所有這三個熒光具有相對高的強度,在圖6(a),但DAPI(藍色)的強度開始迅速下降,在兩分鍾,以六分鍾,並幾乎完全消失了。線粒體和肌動蛋白的汙漬更耐漂白,但強度都下降的過程(10分鍾)的時間序列。

光漂白事件的一類重要的是光動力,這意味著它們涉及的熒光團的相互作用與光線和氧氣的組合。永久性的破壞熒光熒光基團和分子氧之間的反應產生自由基單線態氧的化學物種,可以修改其他分子在活細胞。光致漂白的量由於光動力事件是分子氧的濃度和熒光基團,氧分子,和其他細胞成分的近端之間的距離的函數。光漂白,可以減少通過限製熒光照明的曝光時間,或通過降低能量的激發。然而,這些技術也減少了可測量的熒光信號。在許多情況下,溶液的熒光團或細胞懸浮液可以脫氧,但活細胞和組織,這是不可行的。也許是最好的保護,防止光漂白是限製暴露的熒光激烈照明(使用中性密度過濾器),耦合與明智地使用市售的抗淬滅,可以被添加到安裝溶液或細胞培養基中的試劑。

在某些情況下,也可以被利用的光漂白效果來獲得特定的信息,否則不會提供。例如,在後熒光恢複光漂白(FRAP)的實驗中,一個目標區域內的熒光團是有意照射過量的漂白。隨著新的熒光基團的分子擴散到漂白區域的檢體(恢複),熒光發射強度進行監測,以確定目標熒光團的橫向擴散率。在這種方式中,平移的熒光標記的分子的流動性,可以是一個單細胞或生物體組織部分(2至5微米)的一個非常小的區域內確定。

 

溶劑效應的熒光發射

各種環境因素的影響的熒光發射,包括熒光團之間的相互作用和周圍的溶劑分子(取決於溶劑極性),其它溶解的無機和有機化合物,溫度,pH值,和本地化的熒光物種濃度。這些參數的效果有很大的不同從一個到另一個熒光團,但大量的吸收和發射光譜,以及量子產率,可以由環境變量的影響。事實上,高靈敏度的熒光度,主要是由於在本地環境中的相互作用,發生在激發態的壽命。熒光基團可以被認為是一個完全不同的分子激發態(比基態),因此將顯示另外一組性能方麵相對於基態的激發態與環境的相互作用。

在溶液中,也有周圍的溶劑分子的基態熒光團,可以與熒光團,得到的有序分布的周圍的熒光基團的溶劑分子的偶極矩的偶極矩。中的熒光團的基態和激發態的能級之間的差異產生的分子的偶極矩的變化,最終誘導周圍的溶劑分子的重排。然而,在Franck-Condon原理決定,激發熒光團時,分子被激發到一個更高的電子能級在遠遠短的時間內,它需要比內的溶劑 - 溶質的熒光團和溶劑分子的重新定位自己互動環境。作為結果,存在一個時間延遲之間的激發事件和溶劑分子周圍的溶劑化的熒光團(如在圖7中示出),它一般具有大得多的比處於基態的激發態中偶極矩的重新排序。

fluorescenceintro figure7

後的熒光團被激發到較高的振動水平的第一單重激發態(S(1) ),過量的振動能量被迅速失去周圍溶劑 ​​分子作為熒光團慢慢鬆弛到最低的振動能量(發生在皮秒時間規模)。溶劑分子協助穩定並進一步降低周圍的激發熒光團在一個較慢的過程,需要在10和100之間皮秒重新定向(稱為溶劑鬆弛)的激發態的能量水平。這樣做的效果減少態和激發態,這將導致在一個紅色的移位(向長波長)的熒光發射之間的能量分離。增加溶劑的極性,產生激發態的能量水平的相應較大的減少,降低溶劑極性的同時,降低了激發態的能量水平的溶劑效應。的熒光基團的極性也決定激發態的靈敏度的溶劑效應。極性和電的熒光基團表現出更強的效果比非極性的熒光基團。

熒光的溶劑放鬆的效果,可能會導致顯著的影響Stokes位移的大小。例如,該雜環的氨基酸色氨酸的吲哚部分通常駐留在其中周圍介質的相對極性低的蛋白質的疏水性內部。用熱或化學劑的一個典型的宿主蛋白的變性後,色氨酸殘基被改變的環境從非極性高極性,在吲哚環地出現在周圍的水溶液。熒光發射波長約330納米至365納米,35納米的轉變,由於溶劑效應增加。因此,可以采用發射光譜的內在和外在的熒光探針探測溶劑極性的影響,分子協會,並具有極性和非極性的小分子和大分子的複合物的形成。

熒光定量調查應不斷監測,以掃描潛在的排放概況的變化,甚至當他們不打算,也沒有預期。在簡單的係統,可以建立一個均勻的濃度,漸進式發射強度增加,應遵守的函數的熒光濃度增加,反之亦然。然而,在複雜的生物係統中,可能會發生變化的熒光探針的濃度本地在很寬的範圍內,並且強度波動或光譜的移位往往因pH值的變化,鈣離子的濃度,能量轉移或猝滅劑的存在下,而不是熒光團化學計量學。意想不到的溶劑或其它環境的影響的可能性,應始終被視為在評價的結果的實驗程序。

熒光各向異性

熒光發射從各種各樣的試樣成為偏振光內在或外在的熒光團時,被激發的平麵偏振光。偏振光發射的電平中所述的各向異性方麵,顯示一定程度的各向異性的標本,也表現出可檢測水平的偏振光發射。熒光各向異性的觀察與測量的基礎上的光選擇性激發的熒光基團由於瞬態取向與取向的電場矢量(偏振光)的照明的光子的吸收偶極矩。當熒光團吸收的入射的光子,激發事件從入射的輻射的振蕩電場成分和創建的熒光團的分子軌道的電子狀態的躍遷偶極矩之間的相互作用產生。熒光團優先吸收那些光子具有的電場矢量平行排列的熒光團的吸收躍遷偶極矩。

fluorescenceintro figure8

熒光發射,也會發生在一個平麵上的發射躍遷偶極矩的方向所定義的。每個熒光團已固定在其分子框架內的吸收和發射躍遷偶極矩(圖8),其中已經定義了相對於中的染料分子的分子軸的方向,並彼此分開的角度(θ)。呈現在圖8是一個假設的三核的芳族雜環基的熒光團(布置類似吖啶環係統)用箭頭表示的空間關係的吸收(黃色箭頭)和發射(紅色箭頭)躍遷偶極矩矢量重疊。在激發態的壽命(τ)中,熒光團的旋轉將其排放到激勵矢量相對於去極化,導致在測量環境中含有的熒光團的剛性的一種機製。

含有隨機取向的熒光團與平麵偏振光的各向同性溶液的照明將優先激發隻有那些分子的吸收躍遷偶極矩平行對齊的(或接近)的偏振向量電平麵。吸收的概率實際上是偶極子和入射光的電場矢量(吸收為最大時的角度為零度和達到最小的角度接近90度)之間的角度的餘弦平方成正比。其結果將是一個人口激發熒光基團從原來的合奏一個的特定photoselection過程中,產生激發態熒光基團麵向一個特定的軸平行。從該亞群的熒光發射也將是部分偏振。測量的激發和發射躍遷偶極矩之間的相對角的偏振(p)或各向異性(ŕ)確定的程度,如由等式給出:

p = (I|| - I)/(I|| + I) and r = (I|| - I)/(I|| + 2I) 

其中,I(| |)激發的平麵平行的平麵中測量的熒光發射,I(⊥)激發的平麵垂直的平麵中測量的熒光發射。在實踐中,偏振光的量計算通過測量發射激勵光路徑中放置的偏振器和分析器對取向平行或垂直於激發偏振器(參見圖9)中的發射光的路徑下收集。各向異性和偏振都表達同樣的現象和值可以很容易地相互轉化。的各向異性的表達是優選的,因為在大多數情況下,相關聯的數學方程是簡單表示時,在此參數方麵。

因為發射躍遷偶極矩是從激發躍遷矩位移由於空間定向(參見圖8),將發生某種程度的去極化,即使熒光團被固定在適當位置。因此,吸收過程本身是熒光去極化的第一源極。旋轉運動的熒光,它總是發生在激發態的壽命,更多的人流離失所的發射躍遷偶極方向從原來的結果,將進一步降低觀測到的排放各向異性。的旋轉速率是依賴熒光基團(或它的約束的大分子)的大小和其本地化環境的粘度。可以與由佩蘭方程的熒光團的旋轉流動性的​​溶液的熒光各向異性:

r0/r = 1 + (RTτ)/(ηV)

其中,R(0)是限製各向異性(中觀察到的情況下的任何熒光旋轉的各向異性),r是測得的異向性,η是粘度的環境 V 是在旋轉的分子的體積 R 是通用氣體常數 T 是該溶液的溫度的絕對溫標上,和τ的熒光的激發態的壽命。在實踐中,佩蘭方程簡化表達的時間依賴性的衰減的各向異性方麵的旋轉相關時間Φ)的熒光團:

r0/r = 1 + τ/Φ where Φ = (ηV)/(RT)

其中的現象,導致(低級),測得的熒光各向異性值脫離的最大的理論極限是天然的分子旋轉擴散的過程中發生的激發態的壽命。在溶液中,分子量小的熒光團(最多到幾千道爾頓)的旋轉相關時間範圍在50和100之間皮秒,這是顯著的速度比的發射和位移率,或隨機分布,發射躍遷偶極矩。因為一個典型的熒光基團的平均激發態壽命是在納秒範圍,分子是能夠旋轉無數次之前排放。其結果是,偏振光發射是隨機的,因此淨各向異性為零。第二個(但更罕見)機製通常所觀察到的各向異性下降是熒光基團之間的激發能轉移。

協會的熒光團與一個更大的大分子的查詢結果中的旋轉相關時間的顯著增加。在大多數情況下,一個大的蛋白質在溶液中的相關時間範圍從10到50毫微秒,其中等於或超過一個典型的熒光基團的平均激發態壽命。熒光團的結合減慢的熒光探針的旋轉運動,使主機蛋白的旋轉相關時間的調查。較小的蛋白質通常顯示比較大的蛋白質,或蛋白質涉及複雜的生物組件的相關性時間要短得多,並且可以預計將產生較低的各向異性。

fluorescenceintro figure9

用光學顯微鏡測量熒光偏振的工具的方法,提出在圖9中。平麵偏振光的激發光產生的通過電弧放電照明燈的光通過一個線性偏振器。熒光在試樣(在顯微鏡載玻片上)偶極矩的吸收的激發光的平麵平行取向的平麵偏振光的激發光被吸收最大。這將導致在一個特定的子群的熒光基團被激發(熒光基團的各向異性集合)。在理論上,所有的激發的熒光基團具有相同的方向,吸收和發射偶極矩。在相對於激勵照明的偏振平麵平行和垂直的方向測量,其隨後發射的熒光團的熒光。由於熒光團的旋轉在其激發態壽命期間,觀察到的發射水平平行的平麵的激發會不斷減少,而排放量的記錄垂直於平麵的激發將同時增加。

正如上麵所討論的,熒光各向異性測量可以提供上的旋轉流動性的​​蛋白質,其分子量和形狀可以推斷出的信息。此外,分子間的關聯可以被監測,以及構象變化和蛋白質變性。該技術也被審查內部蛋白質的靈活性和數量的生物膜的物理性能,包括粘度,相變,化學組合物,和對這些性能的膜擾動的影響。可以穩態係統采用連續照明時間分辨實驗中利用脈衝激發事件的熒光各向異性的測量。

共振能量轉移

甲在激發態的熒光基團如上麵所討論的,可以失去激發能量通過將其轉換成光(熒光),通過熱平衡(振動弛豫),或轉移到另一分子通過碰撞或複合物的形成(非輻射耗散和淬火)。以形成複合物或與溶劑分子碰撞,由耦合之間的熒光團和第二個分子的電子軌道的能量被轉移。也有另一種過程,稱為共振能量轉移(RET),其中在激發態的熒光基團(稱為供體)可以其激發能轉移到相鄰的發色團(受體)的非輻射通過遠距離偶極-偶極在納米測量距離的交互。假設共振能量轉移的供體熒光團的基本理論,可以被視為一個振蕩的偶極子,可以將能量轉移到類似的偶極子在一個特定的共振頻率中的類似的方式耦合振子的行為,如對音叉振動在相同的頻率。

共振能量轉移是潛在可能時,供體熒光團的吸收光譜的受體,這本身不一定是熒光重疊的發射光譜。了解這種機製的能量轉移的一個重要概念是,加工過程中不涉及捐助隨後的受體發出的光子的吸收光的發射。換句話說,不存在中間的共振能量轉移的機製參與光子。表現的能量轉移的供體熒光發射在受體的存在下和提高(敏化)的排放,受體熒光猝滅雙方。

fluorescenceintro figure10

呈現在圖10的分光公司從耦合發生共振能量轉移的供體和受體分子的發光強度的變化。的過程中發生重疊(灰色區域)之間的供體發射(中央灰色曲線)和受體吸收光譜的(中心黃色曲線)是必需的。當這種重疊是存在的,供體和受體的分離小於10納米,供體的激發能可轉讓的非輻射的受體。淨結果是淬火的供體熒光發射(紅色曲線)和受體(致敏發射的發光強度增加,紅色虛線曲線)。個人光譜的供體和受體在圖10中可以使用傳說中的上左上角的數字標識。

共振能量轉移的效率隨光譜重疊的程度,但最重要的是,作為第六功率的距離(半徑)的逆的供體和受體生色團分離。受體的能量轉移到需要的生色團之間的距離比較接近,為1至10納米的邊界內的限製。激勵標記的試樣的照明的波長相對應的供體和受體的峰值發射波長區域中檢測熒光發射的吸收(激發)最多可以檢測到的現象。或者可以測量的受體的存在和缺乏,供體的熒光壽命。能量傳遞效率上的供體和受體之間的分離距離的依賴,提供細胞生物學的研究中的實用程序的共振能量轉移的基礎。此方麵的共振能量轉移,使可以使用的技術來作為分光標尺研究和量化細胞成分之間的相互作用,以及在單個大分子的構象變化,在分子水平上。

必須建立一組特定條件發生共振能量轉移。供體生色團必須是能夠耦合到一個足夠長的壽命與合理的量子產率的熒光,施主和受主分子之間的距離必須是相對較短(在大多數情況下,隻有幾納米)。此外,如上麵所討論的,設計的共振能量轉移調查不涉及受體所考慮的實際的光的重吸收。率(K(T) )的能量轉移和能量轉移效率(E(T) )都有關的供體中的受體的存在或不存在的壽命。能量轉移的速率常數,表示為:

KT = (1/τD• (R0/r)6

其中,R(0)福斯特距離至關重要的,這是其中的能量轉移的概率等於捐助激發率(衰減)的受體在沒有的施主-受主分離半徑。因此,福斯特距離,通常大多數共振能量轉移測量範圍2和7納米之間,是能量轉移的效率是50%的發色團之間的距離。另外,在方程中,τ(D)是使用的變量來表示在沒有受體的供體的壽命,  r 是分離的施主和受主分子的距離。通過檢查等式中,很明顯的共振能量轉移率是等於受體沒有捐助衰減率(倒數的壽命)時,發色團之間的半徑是等於福斯特距離。此時,轉移效率為50%的供體發射將減少到二分之一的受體的情況下的正常強度。由於能量轉移率的分離距離的6次方成反比,供體和受體之間的接近程度是清楚的主要術語。臨界福斯特距離,以納米表示,按照以下方程來計算:

R0 = 2.11 × 10-2 • [η-4Q0κ2J(λ)]1/6

福斯特距離方程引入κ2κ平方),這是一個描述在三維空間中的供體和受體的吸收和發射偶極子之間的空間關係的取向係數的概念。如果偶極取向之間的兩個發色團(由於快速旋轉的施主和受主分子)是隨機的,取向因子取統計平均等於(三分之二或0.67的值)對於大多數計算R(0)。發生能量轉移的介質的折射率被表示為變量η,和Q(0)是在沒有受體的供體的量子產率。重疊積分,J(λ)中,定義的供體發射和受體的吸收光譜(圖10中所示的灰色陰影區域)之間的重疊區域。能量傳遞效率(E(T) )相關的距離分離的供體和受體 R ),由以下方程:

r = R0[(1/ET) - 1]1/6 where ET = 1 - (τDA/τD)

因此,通過測量在受體(τ(DA) )的存在下和無受體(τ(D) )的供體的熒光壽命,可以分離兩個生色團的能量傳遞效率和距離確定。由於共振能量轉移的效率在很大程度上受供體和受體的擴散供體的生命周期,時間分辨測量是最適合的空間波動係統的分析。轉印效率,也可以測定由穩態的技術,使用的供體中的受體的存在和不存在的相對熒光發射強度。然而,這些計算是有限的供體和受體的情況下,由一個固定的距離分離,如當兩個發色團被綁定到相同的大分子。這是不綁定到不同的蛋白質或蛋白質和核酸的酸,其中的時間分辨的信息通常是必要的情況下,供體和受體。同樣地,對於在溶液中的發色團的混合物,或隨機分散在膜中,更複雜的計算,考慮空間分布的分子的平均傳輸率是必要的。

共振能量轉移調查提供獨特的信息相比來自替代實驗涉及熒光各向異性,溶劑鬆弛,淬火,或最激發態反應。熒光定量測量的大多數依賴於短距離在附近,包括周圍的溶劑分子的熒光團和其他分子之間的相互作用。與此相反,溶劑的影響,甚至大的大分子(如蛋白質或核酸)的存在下有供體和受體之間的能量轉移的效率上的影響不大。測量共振能量轉移的主要考慮因素,與其他技術不同的是,實際的供體和受體分子之間的物理距離。

結論

即使出現的熒光現象,幾乎是瞬時的,與當前儀器吸收光子並和由熒光團的第二個光子的發射之間的相對長的時間內打開的門,有相當數量的調查使用此顯著的方法。調色板中的熒光技術的吸收和發射光譜,量子產率的明顯變化,生存,淬火,漂白,各向異性,能量轉移,溶劑效應,擴散,形成複合物,以及一係列的環境變量。所有這些因素都可以很容易地評估通過穩定狀態或內在的和外在的熒光基團的光譜特性,時間分辨的解釋。

當耦合到光學顯微鏡,熒光,研究人員在細胞生物學研究一個廣泛的現象。最重要的是亞細胞的組件,如細胞核,細胞膜,細胞骨架的長絲,線粒體,高爾基體和內質網中的特定的大分子的細胞內分布的分析。除了穩態細胞解剖觀察,熒光探測細胞內的動態和各種大分子之間的相互作用,包括擴散,結合常數,酶促反應速率,以及各種不同的反應機理,也是有用的,在時間分辨測量。其他重要的進程也調查的高度特異性和空間分辨率可與熒光顯微鏡使用的目標。例如,熒光探針已被用來監測細胞內的pH值和本地化重要的離子濃度,細胞存活率和凋亡率的影響因素的研究和。同樣的,重要的細胞功能,如內吞作用,胞吐,信號轉導和跨膜電位的產生,熒光顯微鏡下研究。在審查大量的應用程序受益於熒光分析,熒光顯微鏡的顯著效用是明顯的,為什麽推動了這項技術的最前沿生物醫學研究。



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