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尼康顯微鏡:活細胞成像的培養室

2013-10-16  發布者:admin 

標本室是一個不可或缺的關鍵分支,在活細胞成像的曆史和廣泛的設計描述係統,提供卓越的光學性能,同時允許不同時間量要保持標本多年來已經發布。從密封蓋玻片載玻片上,使幾乎所有的環境變量的嚴格控製到複雜的灌注室編寫的簡單的複雜程度不等,培養室被設計為,允許活標本觀察微創高分辨率。

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不管他們的設計,活細胞成像室必須滿足各種要求,才能被成功地應用在實驗中。應易於消毒室,實驗室環境完全隔離觀察期間盡量減少暴露在汙染源有蓋或密封。另一方麵,培養室還提供細胞的不複雜的進入,如果調查涉及顯微注射,加入的試劑(如藥物或代謝物),細胞的物理處理,或向培養基中的變化。如果隨後通過克隆或合成熒光或免疫熒光成像結束後,固定和染色的培養的活細胞的實驗中,腔室必須被配置為允許去除蓋玻片。

 

培養室的尺寸,其中包括整體的大小,比表麵積大的細胞培養,衝洗細胞介質(或緩衝液)的體積,是重要的考慮因素。除了容易地被容納的顯微鏡載物台,培養室必須足夠大,在其橫向尺寸來作詳細的采樣人口中包含了足夠的細胞。周圍介質的深度應最小化,以確保最高的可能性光學透射光的質量和輔助細胞,但它也必須足夠深,以提供一個健康的環境。塑料蓋玻片應避免由於其固有的自體熒光和應變雙折射,幹擾某些成像模式。隻有最高質量的蓋玻片應,應具有較強的酸或堿清洗和徹底清洗。商業培養室的可靠性,通用性和成本變化。,以確定是否需要一個複雜的(通常是昂貴的)的腔室,或者如果更大數量的簡單的培養皿就足夠了設計實驗時,應考慮這些因素。在最後的分析中,應該認識到,沒有完美的培養室的所有宗旨和許多妥協往往是必要的,以實現活細胞成像的成功。

 

兩個高性能的商業孵化和灌注商會為活細胞成像,如圖1所示。在圖1a)的開放室係統被設計為用於與具有稠合到基座的蓋玻片的35毫米的培養皿中,並設有為-550攝氏度的工作溫度控製在一個範圍內的珀耳帖熱泵。多個的灌注係統選項啟用連續灌注在一個恒定的溫度,連續灌注,靜態孵化培養基(無灌注),通過灌注溫度急劇變化或引進。腔室的流體的高度調整用螺杆機構連接的吸入口,消除了交換介質的過程中,流體撲。腔室還配備了一個單一的通道補丁夾緊耦合到塗有聚四氟乙烯的以及具有氯化銀電極,以形成鹽橋,在要求低噪音的電生理學實驗。氣體流過腔頂部提供了改進的溫度均勻性和pH值控製。在圖1b)的封閉小室係統包含一個獨特的雙重角色灌注係統,在該係統中,是由介質的控製數據流在一個通道的載玻片(稱為微渡槽)也塗有導電層流透明的銦錫氧化物薄膜進行溫度控製。該係統可以工作流率從靜態通過快速的介質交流與細胞表麵的低剪切跨越一個溫度從環境溫度到50攝氏度。碳酸氫鹽和有機緩衝液是兼容的腔室,這是連接到一個獨立的控製器單元。

 

曆史視角

第一個活細胞成像室設計和建造後不久,哺乳動物細胞培養技術開發二十世紀初。這些早期的室利用燃燒芯,來控製流動的介質通過的玻璃窗的玻璃容器或軟木外殼。最終,一些灌注式生長室構造的意圖被用於使用光學顯微鏡的時期內可獲得長期的成像。到了20世紀50年代和60年代,更複雜的活細胞成像室被設計用於高分辨率的調查,納入相位和微分幹涉對比顯微鏡(DIC)的新興技術。負擔得起的技術和耦合器交配電影膠片相機與顯微鏡的完善,在20世紀60年代末和70年代初,研究人員能夠係統地調查時間推移實驗中的活細胞高時空分辨率,使用越來越複雜的成像室。

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成像室,在20世紀70年代和80年代開發的,基於標準的設計涉及兩個蓋玻片,橡膠O型圈或類似墊片由一對分開,成架製成的兩個金屬板夾層。這種常見的動機,遭受一些陷阱,包括無法交換培養基或添加測得的藥物或代謝物的等分試樣,盛行了很多年。更先進的灌注腔最終構建通過修改這個基本的設計,以使連續加入新鮮的培養基和其它試劑的間歇添加。然而,許多這些早期的腔室的設計,主要的缺點是缺乏注意層流,化學梯度的形成最小化的一種方法,其中通過作為介質的平穩過渡將被替換。層流,確保兩個解決方案不成為湍流混合在更換過程中,以避免生成的化學梯度。既簡單又複雜的成像商會在過去幾年的持續發展,導致優秀的設計,適合大多數成像方案的要求。

 

幾個活細胞成像室最初被設計在20世紀後期,如圖2所示。這些腔室的變化是可商購的,衍生的配置已在許多實驗室中構建。在圖2a)所示腔室羅伯特·天艾倫和Andrew鮑耶爾從原設計的是一個第二代的版本,並在灌注實驗中使用的一個直立顯微鏡的目的。大直徑排氣口的機會減少開裂的蓋玻片,並可以輕鬆地修改以適應一個倒置的組織培養儀室。雖然價格相對低廉的建立,這間密室不會產生理想的層流特性。德沃夏克Stotler室風格呈現在圖2b),設有圓形蓋玻片和墊圈,定期市售的幾個廠家,但也比較容易構建。在每小時1毫升灌注率,在德沃夏克Stotler室產生一個幹淨的蓋玻片表麵流過,清掃模式。圖2c)代表了一個複雜的設計在20世紀50年代初,最初是從研磨拋光有機玻璃灌注室的透視圖。啟用的標本,在高分辨率下連續灌注的能力,這種設計的缺點是缺乏令人滿意的層流特性。圖2給出了該商會代表在文獻中出現的許多設計在過去的50年,隻有少數幾個。

 

如今,活細胞成像室廣泛商業化,從簡單的設計,安裝在顯微鏡玻片上,複雜的係統,能夠控製幾乎所有方麵的環境。雖然許多研究者(特別是那些獲得的機修車間)繼續他們的實驗,以滿足特定的要求專門製作室,現在商會廣泛的支配單位,擁有先進的層流,聚合物建設,以及高清晰度的能力以合理的成本可購買的。強調的是,任何培養室的設計的最重要的方麵是要能夠保證和驗證,細胞培養是健康的,處於正常的時間刻度上的增長,以及提供足夠的顯微鏡的光學窗口,以確保培養成像可以在足夠高的數值孔徑的實驗,以滿足分辨率的要求進行。

 

簡單的顯微鏡載玻片和培養皿成像

短期成像實驗中(2030分鍾或更小),可以簡單地進行附加到載玻片含有貼壁細胞的蓋玻片,使用隔離物,以保持細胞的損壞(物理應激可誘導某些細胞係中的自發熒光)。能夠確保蓋玻片與一些密封劑,包括熔化的瓊脂糖,橡皮泥,真空潤滑脂,或一個有用的製劑稱為VALAP(凡士林,羊毛脂,石蠟的1:1:1的混合物)的任何一個,以提供水密密封和消除培養基中(圖3a)中示出)的蒸發。由矽橡膠(市售)或碎片的蓋玻片的切薄的墊片,可以用作隔離物,以保持細胞的直接接觸的顯微鏡載片上(圖3b))。組裝時這些腔,使蓋玻片表麵含有細胞正麵朝下放置在隔板上,並填寫蓋玻片和載玻片之間的空隙用生理緩衝液(如磷酸鹽緩衝液PBS)或營養組織培養基。密封蓋玻片的邊緣周圍使用的試劑的選擇,並在舞台上觀察放置在顯微鏡載片上。細胞在生長培養基中,溫度控製的情況下,將正常的隻有幾分鍾,但是這往往是足夠的時間來獲得必要的圖。於短期存儲,而不會嚴重影響細胞生存力,滑動被放置在二氧化碳培養箱或旁邊的顯微鏡圖像采集會話之間的一個小加熱塊。此外,為了避免在儲存過程中損失的緩衝區或培養基中實驗之間,滑動可以放置在一個小的加熱濕度室。

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合成的O形環(圖3c))或類似形狀的圓形墊片(如三孔活頁夾用於加固片)提供了一個方便的替代平麵矽膠墊片(圖3b)),並且可以很容易地密封與上麵所討論的任何安裝的混合物。在許多情況下,圓形墊片足夠厚,以增加量的介質或緩衝區可用洗澡的細胞,細胞損傷的風險是少安裝時。含有貼壁細胞,薄的組織切片,胚胎,或小的完整的生物體的蓋玻片往往可以更容易地成像代較厚的單井凹的載玻片是標準的載玻片(圖第3d))。這些載玻片3毫米厚(1毫米的傳統玻璃載玻片),使他們能夠適應有比較深的腔(2毫米)。的以及擁有更大體積的緩衝液或者培養基中相比,可以夾著平坦的滑動和蓋玻片和類似的O型圈,將不太可能在安裝過程中對細胞造成損害,抑鬱症。在下行路上,厚厚的設計和弧形牆壁是不兼容傳輸高分辨率成像對比增強(相襯,DIC,霍夫曼調製對比HMC)模式。但是,熒光成像,這依賴於落射照明的蓋玻片,是不會受到井。

 

在前麵的段落所描述的簡單的顯微鏡載玻片配置使用正置顯微鏡主要用於通過較厚的玻片的蓋玻片,而不是使細胞可以成像。在某些情況下,尤其是當使用固體粘合劑,所安裝的滑動可以打開,倒置顯微鏡上觀察到無有害影響。另外,如果包含的校正衣領一個高分辨率的幹物鏡,試樣通常可以被成像的物鏡像差校正因子是通過底部的載玻片,如果能夠以補償額外的厚度(1毫米)。一個更靈活的配置,這是適用於直立和倒置顯微鏡,可通過在玻璃或塑料顯微鏡載片上鑽一個1厘米的孔,安裝蓋玻片的一側使用指甲油,矽酮密封膠,或其中一個的新的先進的粘合劑,可在硬件分銷商(在圖3e))。腔以及可與培養基或緩衝液填充和裝配在上側與第二蓋玻片含有貼壁細胞,瞬時與VALAP安裝。如果蓋玻片小心地放置在一個完整的,很好地避免截留的氣泡,光學透明的路徑建立兩者之間的蓋玻片。否則,將被創建的彎月形的氣泡,可以在透射照明模式下拍攝的圖像失真。此配置優化使用正置顯微鏡。一種替代的加載技術,更適合於倒置顯微鏡,包括永久連接的蓋玻片覆蓋中所描述的細胞和生長培養基的第二蓋玻片上生長的細胞。

 

各種各樣的商業顯微鏡玻片培養室設計可滿足許多短期的活細胞研究的要求。在這些範圍內的複雜性,從簡單的塑料培養瓶和稠合到玻璃顯微鏡載物片上的多井外殼複雜的集成係統,使灌注的操作,流的研究,多個相互隔離的文化的快速檢測,3為圖第3f)所示,通過(I)。所謂的實驗室上的一個滑動裝置係統是描繪在圖3f)的多室設計,提供多種格式的,範圍從一個單一的大腔室數(最多18)較小的腔室在一個單一的玻璃載片(圖3f)的腔室中有4個矩形孔)。這些多才多藝,自足室都配有一個鬆散的塑料蓋,使氣體交換,但可以成為一個問題,由於半月板和雙折射塑料成像時,傳輸模式。另外,通過腔室的設計限製啟動,氣體交換的量的時間,可以在外麵的二氧化碳培養箱細胞不進行pH值升高的情況下,除非在滑蓋內的環境控製腔成像。可以得到類似的腔室,是融合,以1毫米的玻璃顯微鏡載物片或170微米的蓋玻片,這兩者都用於可視化倒置顯微鏡下生長的細胞。的活細胞觀察時段結束時,將細胞固定,染色,直接在生長室中,然後將其安裝滑動或蓋玻片除去。

 

3g)中示出的商用成像室結合細胞培養物的便利性,在培養皿中的光學質量的玻璃顯微鏡載片上,使用各種各樣的對比度模式的高分辨率成像。觀察信道連接的兩個介質儲層體積為100微升,5毫米寬,使一個大的細胞群的觀察。流通過該信道可以被啟動填充水庫之一。由圖3H)室岔通道精選可以購買專門的塗料塗層或處理模擬血管內皮細胞增長。在通道末端的魯爾式適配器允許適應灌注係統精確調節流速和剪切應力。這種類型的培養室是針對特定研究賽場的定製設計的一個很好的例子。類似的腔室,圖3中的(一)所示,設計為容納非常小體積(10微升)中的幹細胞分化的檢測性能,分子識別與結合的研究,以及在基於熒光結合常數的測定成像。5個平行通道均配備一個單獨的介質水庫,以提高吞吐量。各種各樣的專門室設計市售許多針對經濟的材料和在具體調查的執行效率。

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培養皿中的各種配置專為高分辨率活細胞成像市售(見圖4)。最簡單的,也許是最多才多藝的設計包括一個標準的3550毫米的一次性培養皿中設有一個圓形開口(1014,或20毫米)切成附著表麵的中心,高品質的硼矽蓋玻片覆蓋使觀察的活細胞,在高分辨率(圖4a))。腔室可無塗層或塗有薄薄的一層粘合促進劑如聚-D-賴氨酸或膠原。被稱為玻璃底菜,這些成像室可在61224孔版本(圖4C)),多培養實驗。類似的設計(圖4b)條)設有一個自定義的培養皿中,包含了大量的圓形蓋玻片覆蓋了整個修改後的菜基地。這些菜也可以在各種尺寸,可以購買有緊密裝有蓋子,以確保氣氛,不像傳統的培養皿中有氣體交換的寬鬆蓋。雖然標準聚苯乙烯培養皿中,可以采用常規的低分辨率觀測(直接穿過塑料)具有較長的工作距離的物鏡,具有校正鋌,使用高數值孔徑(1.21.4)耦合到油或水浸泡的物鏡需要修改後的玻璃底的版本。

 

陪替氏培養皿培養室,在大多數情況下,比在圖3中所示的顯微鏡滑動可以容納較大體積的生長培養基中或成像緩衝器基本上充滿了。介質量增加的危險降到最低溫度或pH值的突然變化和長期培養,提供了優越的生長環境。這些腔室的另一個好處是,融合的陪替氏培養皿的底部,使蓋玻片培養細胞後直接從孵化器中轉移,而不是潛在的創傷誘導加載種子蓋玻片或分離的細胞轉變成一個專門的成像室高分辨率成像。在實踐中,含有轉染的哺乳動物細胞(表達熒光蛋白)的培養物可以被反複來回傳輸之間的加濕二氧化碳培養箱和顯微鏡載物台定期觀察或記錄很少或根本沒有損壞細胞的圖像。此外,越來越多的商業售後加熱載物台和封閉顯微鏡孵化器旨在保持35毫米的玻璃培養皿底部長期時間推移成像序列。

 

3和圖4(效果,顯微鏡載玻片和培養皿)中所示的簡單的活細胞成像室可以經常洗滌,消毒,並在多個場合重複使用。第一步是要徹底清潔室用清潔劑,然後通過窮舉用蒸餾水或去離子水漂洗,在無塵的容器中,在室溫下幹燥數天。更困難的情況下,特別是對那些已暴露於藥物,幹燥介質,或細胞粘附試劑的腔室和載玻片,單位可以預先用乙醇浸泡清洗或稀釋的酸溶液,但這種治療應避免與腔室,使用膠水或其它溶劑為基礎的粘合劑,以確保一個脆弱的蓋玻片,玻璃,金屬,或塑料。清洗和幹燥後,通過高壓滅菌(不推薦)或治療用紫外線燈在黑暗的機櫃15分鍾滅菌室。作為一種經濟而快速的替代方案,許多簡單的孵化室可消毒用乙醇洗滌,並在無菌的層流罩幹燥。

 

可以觀察到,雖然安裝在載玻片上的細胞培養,或在玻璃底培養皿中生長瞬時顯微鏡舞台上幾分鍾,在室溫下,各種商業設備已製造可以采用更長的時間,使這些簡單的成像室期間的時間。被稱為載物台載物台孵化器,所有這些單位提供本地化的溫度調節(見圖5),而更先進的設計,也使有限的氣氛控製和遏製能力灌注。為標準尺寸的顯微鏡載物片(1×3英寸,請參閱圖5a)和圖5b))的保溫板適合用於保持圖3中所示的腔室的溫度控製,並容易地適應大多數顯微鏡,通常用剪輯的原始載物台。圖5中所示的滑動套(一)功能,完全包含在一個加熱室之內的顯微鏡載片上的金屬頂板。不幸的是,在打開的光圈,這是不加熱的板蓋玻片下觀察試樣區域所在。傳熱問題的玻片標本又因采用大光圈較小的觀賞區,雖然經常會造成額外的問題阻礙體積較大的高數值孔徑物鏡的運動。在圖5b)所示的加熱的滑動保持器被設計為適應標準的倒置顯微鏡,並設有一個較小的光圈,以犧牲可用的觀察區域提供更均勻的試樣的溫度控製。

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在最先進的顯微鏡載片上保暖多井室載玻片的孵化器在圖5c)所示,其目的是提供一種高度可控的環境(圖5f)中示出了一個類似的載玻片),調節pH值,溫度,灌注的本地化的氣氛。孵化器利用珀爾帖的技術,通過550攝氏度的溫度範圍內進行加熱或冷卻的試樣,最多可容納4個溫度調節灌注線以及氣體灌流。這個孵化器係統在眾多獨特的功能,是一個磁性底座,便於在顯微鏡配置和一個特別設計的抽吸去除灌流幹擾最小液位。所描述的滑動套和孵化器在圖5a)至5c)是連接到一個單獨的控製單元,保持溫度和其他必要的變量(如灌注和大氣調節)的每個設備。

 

培養皿孵化器(見圖5D5條(f))在設計和執行簡單的顯微鏡載玻片載物台相似。最初級的版本,在圖5d)所示,包括一個加熱平台是容易地適應任何倒置顯微鏡載物台,可容納高達10厘米直徑的陪替氏培養皿。貼壁或懸浮細胞觀察變暖板通過一個中心孔。即使不直接在上麵居住光圈細胞加熱板在較長的觀察,可能會遇到的可行性問題,這道菜可以很容易地觀看到光圈旋轉移動相鄰地區的文化。或者,較小的陪替氏培養皿(直徑為3560毫米)可以更均勻地加熱,並觀察到使用這種溫暖的。更先進的培養皿溫暖的對角線位置的縫隙,而不是設計一個圓形的光圈是描繪在圖5E)。這個孵化器可以不等,麵積從60100毫米的培養皿中,一個較小的版本是35毫米的菜肴。的對角線狹縫跨越陪替氏培養皿的中心的周邊區域,可以用來檢查通過緩慢轉動盤在觀察期間,幾乎整個培養。狹縫相鄰的細胞維持在適當的溫度,雖然與直接定位在開口部由於熱梯度的波動。

 

6孔板載物台孵化器在圖5中所示的(六)被設計為插入到倒置顯微鏡,並提供了充分控製的環境,使長期成像的一些文化。溫度調節到10攝氏度的(這是連續監測,通過比較參考),通過循環水係統連接外部恒溫控製洗澡室。一個單獨的控製單元的混合物與空氣中的二氧化碳,然後將其連續地輸送到孵化器腔,而在腔室提供了一個蓄水池,以提供恒定的相對濕度。得到眾多的配件,以容納兩個35毫米的培養皿中,多室玻片(圖3f)),以及可更換的適配器裝入1296多井板和單蓋玻片室的腔室。這種先進的係統是非常有用的各種應用,從藥品檢測範圍在廣角和共聚焦顯微鏡觀察熒光。

 

孤立的,未封閉的陪替氏培養皿和顯微鏡載物片,也可以保持在或接近生理溫度下,用類似操作的方式類似的吹風機(如圖6所示)或孵化加熱器的熱空氣的設備。雖然溫度的調節是有限的,以一個度的幾十分之一,即使與比例控製器的應用程序和遠程熱傳感器監控器,送風機的空氣流直接到培養室和周邊顯微鏡份(第一載物台物鏡聚焦和聚光鏡),提供快速響應的溫度漂移。此外,施用藥物和介質的變化是暢通的標本。不利的一麵,開放的文化生長在培養皿中,並用熱風機加熱緩慢釋放二氧化碳和水的pH值和滲透壓逐漸漂移室。這一事實限製了使用鼓風機開放商會短期觀測,可以在幾個小時內進行。與此相反,封閉腔室係統(下麵討論),可以保持更長的時間內,利用鼓風機。空氣吹風機的另一個缺點是,試樣的溫度不斷變動(即使在一個窄的溫度範圍內進行),開啟或關閉時,空氣流,這可能會導致焦點漂移。培養條件可以增加整體的穩定性和漂移水平的降低環境櫃周圍顯微鏡耦合強製的熱空氣吹風機。紅外燈也采用溫暖的文化,但是它們也有從與鼓風機所遇到的類似問題。

 

如圖5所示的加熱裝置大部分都限製領域觀察活細胞(通常隻有幾毫米),需要特別注意,以確保有足夠的淨空物鏡翻譯舒適的光圈範圍內。現代高數值孔徑的油和水浸泡物鏡是相當大的,有很短的工作距離,可能是這樣笨重的碰撞與保溫器,具有過厚的堿或太多上麵的顯微鏡載物台安裝。此外,翻譯的跨培養室的玻璃表麵上油物鏡的能力可能會受到嚴重限製上存在許多暖載物台的小孔徑。當選擇一個載物台為活細胞成像溫暖,研究者應光圈和物鏡尺寸進行比較,以確保一個足夠大的麵積,可以觀察到的培養室

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幾個載玻片和陪替氏培養皿的保暖或孵化室上麵所討論的(圖5)可任選配備有絕緣墊隔離加熱平台從舞台,這一措施阻礙顯微鏡幀,通過熱傳導的金屬部分的熱損失。作為替代方案,這些加熱板,塑料或複合材料製成的,以減少熱損失的絕緣片上的薄的層(12毫米),可被安裝。需要注意的是在顯微鏡載物台和幀是良好的熱導體,並能迅速克服了典型的控製器,用來控製加熱板的加熱能力有限。通常的結果是一個漸進的溫度下降(尤其是附近的光圈),這將影響細胞的活力和呈現的實驗結果懷疑。另外重要的一點是必須考慮的,涉及到這些設備的實際性能。雖然在培養皿和載玻片暖通常具有優良的溫度調節(十分之一的攝氏度),由於其比例控製器的準確性,根據觀察試樣區域的實際溫度往往偏離設定溫度,由於梯度創建跨光圈。出於這個原因,簡單的載物台保暖耦合額外的加熱裝置,如物鏡的加熱器或封閉的環境的腔室,可能是必要的,以確保細胞生存力,在延長的成像會議。

 

幾乎所有在本節討論的簡單成像室是不是在與環境的平衡,應僅限於非常短期的調查,通常範圍從幾分鍾到一個小時最多。雖然專門的玻璃底培養皿中是有用的一些實驗中,腔室從聚合物(實際上製造,標準的陪替氏培養皿和聚苯乙烯組織培養瓶)遭受不均勻的光學表麵,表現出應變缺陷,禁止使用先進的成像技術,例如偏振光和微分幹涉相襯。此外,厚室(塑料和玻璃),防止使用高數值孔徑浸泡物鏡。在采用簡單的腔室的應用中也許是最不利的因素,但是,除了從低效的載物台式升溫裝置和成像室之間的熱傳遞發生的是,伴隨著緩慢蒸發介質的pH值和同滲容摩的逐步增加。總的來說,簡單的培養室的許多缺點妨礙其有效申請嚴重的成像實驗和研究人員應考慮下麵的討論更先進的替代品之一。

 

灌注

各種各樣的培養室的設計,是市售的或可容易地在內部構造一般分為兩個基本的功能的類別。第一,最基本的類,開放室係統,類似培養皿定製載玻片如上所述,在使用過程中慢慢接近平衡與周圍的氣氛。更複雜的封閉的腔室是密封的保護細胞從培養基中的蒸發,以確保環境變量,如pH值,二氧化碳濃度和滲透壓,保持原狀。一個開放的腔室的細胞培養係統中生長的細胞將允許容易訪問,從而容易地使顯微注射,膜片鉗,除了藥物及其代謝產物的培養基中,細胞和其他必需的操作變化。與此相反,封閉的腔室提供來自外部環境的絕緣性能優越,但呈現訪問困難得多的細胞。最封閉的室內設計包括端口允許添加新鮮培養基和藥物在實驗過程中不中斷的成像序列。在這些係統中,是受一個蠕動泵,一個馬達驅動的注射器,或通過重力控製歧管灌注。新的解決方案加入到一個封閉的腔室係統,應先平衡成像室相同的溫度和大氣條件。此外,許多細胞係中,對剪切敏感的,因此必須要在非常低的流速灌流連接到蓋玻片的貼壁細胞。下麵描述的更高級的封閉腔係統設計,提供嚴密的控製剪切力。

使用開放或閉合的培養小室係統之間的選擇通常取決於由特性的調查,包括必要的時間和空間分辨率,以及持續時間。高分辨率明場成像技術依賴於DICHMC,或相襯需要聚光鏡的數值孔徑等於或大於物鏡。因此,要實現全分辨率1.4數值孔徑與60倍的物鏡,必須等於數值孔徑匹配的聚光鏡。一個高分辨率聚光鏡科勒照明下運行的最大工作距離,因為隻有幾個毫米(這取決於聚光鏡的工作距離),這個因素限製在觀察室的物理尺寸。小於封閉小室係統能夠隻包含有限的體積的培養基中(通常大約幾百微升),這可能會成為一個問題。長期培養,如果未采用灌注係統。

 

與此相反,不需要伴隨高分辨率的熒光調查傳輸光技術往往與開放的腔室來完成,緩和改變介質或進行其他操作(如電生理測量)向培養的任務。封閉的腔室也需要特別注意的培養基中的緩衝能力,pH值不能被控製的典型的碳酸氫鈉/二氧化碳係統。作為替代方案,可以利用或氣體沒有被緩衝的介質,應考慮合成緩衝液補充品(如HEPES)。在任何灌注室中,灌流液,蓋玻片視窗,液浸介質的折射率之間的差異可以引入顯著誤差信號的衰減深度測量結果。許多這些工件可以減輕與水浸泡物鏡,但圖像質量仍然是優異的情況下,將細胞附著到蓋玻片。

 

如圖7所示的幾個商業灌注室設計活細胞成像實驗,在不同的光學分辨率。在圖7a)所示的結構是一個自包含的環境室,裏麵的皮氏培養皿隨著灌注,溫度和濕度控製,以及大氣中的氣體組合物的調節能力。圖7b)示出了鑽石形的灌注室(下麵將討論),在加熱載物台的適配器,而圖7c)示出了類似的設計,但是有一個圓形的腔室。各種流室載物台插入圖7中的適配器(b)和7c)使調查微調的細節成像實驗生理學和細胞生物學。能夠被固定在一個機架,盧丁式的灌注室(d)為圖7所示的用於成像的多個樣品與灌注在一次實驗中有用。雖然沒有被加熱腔室本身,它可以被安置在加熱的台板,或連同一個物鏡的加熱器或全封閉環境室中使用。在圖7(五)的Petri式的灌注腔模製包含灌注流體的引進和排氣端口,但不包含溫度控製元件。同樣,在圖7的腔室(六)包含多個端口,和被設計為插入到標準的6孔培養板,包含塑料生長表麵上的貼壁細胞。在圖7中(克)加熱灌注室被設計為可安裝在顯微鏡載物台上,用一個圓孔徑,並圍繞中心井的周邊設置有多個端口。需要注意的是數以百計的活細胞灌注室市售,所以鼓勵研究者掃描商會針對特定應用的可用性之前提交到一個單一的設計。

 

灌注室設計的重要考慮因素是機械連接(如有必要)和穩定的檢體,流體機械的流動特性和交換腔室的時間,以及光的工作距離和折射率浸油,文化的解決方案,通過觀察將發生的玻璃板。活細胞成像封閉或開放室的標本可以被固定的自然堅持蓋玻片,附著力促進劑(例如,聚-L-賴氨酸和膠原),或在薄薄的瓊脂覆蓋第一嵌入。調查的要求,決定必須在灌注室可供觀察的玻璃表麵麵積的大小。隨機的細胞群往往可以使用相對較小的蓋玻片,但更大的區域非常大的細胞或網絡可能是必要的,在特定的事件(例如,有絲分裂)的情況下,必須篩選許多細胞。

 

無論在蓋玻片表麵積,形成檢體腔(理想的情況下,厚度170微米)的薄玻璃板應該是無應變,光學平麵,並在一個平行的方向定位。需要注意的是更大的可視區域更容易泄漏和物理損壞,但提供顯著更多的機會獲得高數值孔徑物鏡,往往萬桶不等,直徑從3厘米至5厘米(更笨重安裝加熱器)。分庭應利用組件是沒有毒性的活細胞。現代市售的培養室中的構造由玻璃,不鏽鋼,高強度合成聚合物,聚四氟乙烯,和矽樹脂,通常使用粘合劑,在最終組裝。這些材料可能含有有毒重金屬或有機溶劑,應刪除之前進行徹底清洗消毒和使用的痕跡。

 

灌注腔室通常是必要的,以確保細胞培養物的可行性調查時,需要冗長的成像序列,或者如果串行此外,代謝物,示蹤物,和/或藥物不幹擾視場的情況下,必須完成。此外,灌注腔室使研究者周期性地采樣蜂窩產品的生產培養基中,並進行相關的研究,在該標本中的生存狀態監視在一段時間內,其次是在觀察過程中突然固定重建結構或細胞學事件相關過程中的利益。灌注的主要優點是有能力保持在長期實驗中的介質的pH和離子濃度,以及不破壞細胞的情況下,得到一種機製來引入各種試劑(注入腔室)。例如,灌注使研究者不中斷圖像采集過程中的時間推移序列引入到培養的藥物。

 

灌注室之間的最重要的特征是,整體的設計必須采用的層流特性,這樣的解決方案,通過以相對較少的混合,可以迅速和有效地交換。對於一些調查,層流可能不是至關重要的,但更嚴謹的研究往往要求高度控製的介質交流,尤其是當其他代理商正在增加。灌注室的流體機械的性能密切相關的幾何形狀(如圖8所示)。層流時,會發生該室的橫截麵是非常相似的,甚至是相同的,該入口管。最不利的流動模式時,會出現比較大的入口管室。圖8比較在幾個流行灌注室的流動模式。圖8a)中示出的圓形的腔室,有交流特性較差,由於介質的突然擴張,從進液管的開口,這會導致在二次流和非均勻簡化。逐步擴展,所描述的圖8b)和圖8c),結果更加均勻簡化和快速交換。在圖8中所示的錐形區的入口和出口管的腔室的設計(二)改善流動剖麵,而更均勻的流動通過容器中的鑽石形的幾何形狀的腔室(三)在圖8中的結果。圖圖8d)中提出的微渡槽室具有優越的層流特性由於蝕刻的通道,引導整個試樣輕輕介質

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正如上麵所討論的,它往往是必要開發一種可靠的方法直接灌注細胞成像室不妨礙實驗收購電力,化工,光學數據。灌注室中的流體流過發生了新的流體傳遞到進氣口,而這又迫使使用了通過的排氣口上的流體的交換。因為大多數活細胞成像室包含相對微量的組織培養基中,在灌注過程中的剪應力的敏感性,細胞,以及孔處(通常被稱為為膜片的效果),必須創建蓋玻片的振動的潛力選擇時要考慮抽水係統。在許多情況下,這個選擇的過程中,與大多數其他因素在活細胞成像,涉及一個或更多的妥協。理想的灌注泵將提供一個嚴密控製的,純模擬的流介質無限期的,但這種類型的係統還有待開發。

 

灌注流體通過交付的標準技術是重力流,自動或手動注入用注射器(參見圖9b)),與機械泵。重力流是安裝簡單,價格相對低廉,但通常所必需的顯微鏡上麵的流速難以控製。在最基本的配置中,重力自流進料係統需要一個大的介質儲層的位置放置在高處與連接到成像室的無菌管的截麵的顯微鏡。的流量調整由針形閥控製的排氣管連接到腔室的相對側,成收集盆下水道。另外,匯率灌注在重力係統可以控製通過改變兩個水庫之間的垂直距離或一旋塞的控製流從上水庫。重力進料係統的層流特性往往是不足的,但就足夠的情況下的主要要求是能夠快速交換培養基中。

 

對於依賴於精確的藥物或其他化學品,以及優於純粹的力控製在蓋玻片的表麵上(如細胞附著)另外的實驗中,一個更複雜的灌注裝置是必要的。流體交換率,它可以是非常關鍵的專門的實驗中,增加了改進腔室的幾何形狀。在灌注室半的時間少於50毫秒的流體交換已經實現而不擾亂試樣臥位或軸向焦平麵。甲步驟的濃度變化可在少於100毫秒的時間來實現,用相對低的線性流速,其中兩個灌注液的交界處的位置靠近的腔室,腔室,設置有一個小的內部體積,並保持層流配置文件。許多市售滿足這些條件的先進灌注室。

 

定期加入生長因子,抑製劑,藥物,和其他代謝物在灌注過程中,可以很容易地通過使用手動注射器。機械泵,蠕動(圖9a)和圖9b))或電動注射器(圖9E))的設計,是最可靠的設備提供的灌流液。長期實驗的音量和送貨上微升流尺度的變化(由於臨時粘在柱塞)的注射器泵是有限的。采用步進電機的泵可以被控製,以很慢的流速,但在液力脈衝可以製作蓋玻片彎曲或撞出細胞的瞬時的轉子運動的結果。先進的灌注泵配有調節耦合到一個降壓的傳輸驅動配備的輥子主軸速度控製的直流電動機。其結果是,是免費的,便宜的蠕動泵的典型的突然脈動的流動剖麵。在選擇灌注送貨係統,研究者應當考慮所需的流速,流過不同時間尺度的均勻性,以及傳遞的總體積,以及質量流量。

 

此外,以確保合適的灌注腔室的流體的流動特性,進紙器的解決方案可能還需要注意的溫度和氣體組成。如果二氧化碳和碳酸氫鹽緩衝係統,所有的灌注液應保持平衡的適當的二氧化碳分壓(碳酸氫鹽的濃度依賴於),並保持在相同的溫度下培養室。因此,灌注液必須毒氣,它們引入灌注室之前調整它們的溫度。請注意,減少二氧化碳的溶解度隨著溫度的增加,因此必須加以調整,上麵的腔室的溫度設定值或氣體混合物的溫度差,必須將毒氣的解決方案。各種商業設備提供用於保持灌注液的溫度和氣體組成。另外,合適的設備可以很容易地在內部構造使用常見的實驗室組件。介質瓶,管,和一個魚缸空氣石(圖9c)條),同時可以製作簡單的濕度試驗箱的溫度可以控製循環水洗澡或桌麵孵化。更複雜的單元(圖9d)圖中所示)的設計,同時調節pH和濕度。介質的靜態的解決方案,因為有一種傾向,冷卻和失去二氧化碳(其後產生的pH值增加)時,所有的解決方案應該被連接到使用不透氣的管材通過加熱的水浴或培養箱灌注室。

 

活細胞灌流實驗管接頭的選擇應隻限於那些產品(最好是帶有一個USP VI級認證),表現出最大程度的生物相容性,從而保證了成像會議期間油管源性毒性缺乏。目前,有三個品種,以滿足這一要求:PHARMED(可通過眾多分銷商),聚乙烯2275C-Flex的商業油管。即使它是非常適合用於細胞培養,PHARMED管的主要缺點是低的不透明度,從而降低了通過油管旅客灌流液的可見性。其結果是,可能形成的氣泡作為灌流液通過油管很難檢測到。相比之下,C-Flex和聚乙烯管幾乎是透明的,不容易進灌流浸出增塑劑。後者的產品是大多數灌流實驗的理想場所。

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灌注腔室中使用的一個潛在問題是,試樣往往反彈的重點蓋玻片彎曲迫使流體通過腔室的過程中,則初始化或終止時,在有限的程度,如前麵所討論的(隔膜效應)。此神器室灌注係統控製​​不佳是顯而易見的。蓋玻片撓曲可能不存在顯著的問題,在灌注會話之間的圖像捕獲序列的情況下,可以是交錯的,但它可能會嚴重影響這些研究的需要相對高時間分辨率(2秒或更少)。蓋玻片彎曲的嚴重程度可以最小化通過減少輸入端口(和油管成色劑)的直徑的排氣口的靜水壓力,使流體的流動過程中不累積。此外,代以重力流係統的蠕動泵,可以減少或消除振動板的效果。

 

在所有灌注室使用的一個主要問題是形成氣泡(由於泄漏,表麵張力,脫氣),這可能會幹擾與層流的培養基中,以及在成像過程中降低對比度和銳度。一個正確配置的灌注室應形成一個封閉的係統,應消除後的試片被安裝在顯微鏡上的和隱藏的空氣在腔室或管路口的或潛在的泄漏,但在啟動之前的實驗。在重力係統,最簡單的方法來清除氣泡是填補了水庫和室,停止流過係統,然後再慢慢清除活塞,同時檢查所有組件。用泵係統通常更難以糾正,並應特別注意支付的微小氣泡,可能隱藏在腔體外殼之間的蓋玻片和灌注口。在所有的情況下,整個係統應完全封閉的,並裝有流體到第一灌注前,以盡量減少的蓋玻片彎曲灌注啟動和終止。確保排氣管沉浸在catch盆地悄悄溜回到室,以避免氣泡。

 

對於許多調查,灌注腔室的輸入口和排氣口的定位必須不幹擾的變化的顯微鏡物鏡。大多數夾心式腔室的設計,使端口被定位在相同或相對的腔的邊緣,通常可以將其用於與直立和倒置顯微鏡。然而,腔室,具有安裝在殼體的上部分上的端口可能會阻礙正置顯微鏡的物鏡轉盤上的運動。許多現代商業灌注腔(見圖1和圖7),旨在使顯微鏡炮塔旋轉而不阻塞,但這一因素應該先進行測試,然後決定在一個特定的腔。此外,塑料灌注和嵌入在大型金屬舞台上的適配器倒置顯微鏡成像室,可能無法提供足夠的間隙物鏡旋轉不首先降低的物鏡離室。

 

雖然絕大多數的活細胞成像的調查,需要維持在高於環境溫度升高的文化,一些研究涉及的生物體觀測,必須在非常低的溫度下生長的,而另一些研究在試樣上的突然冷卻的影響。對於長期的實驗,最好設在顯微鏡在寒冷的房間,以避免在室溫下的冷表麵上形成冷凝水的問題。在寒冷的房間的情況下,用於冷卻的應用程序設計的灌注腔室是市售的。這些設備往往依賴於前螺旋線或油管,以減少溫度的冷凍乙醇溶液的流動。專門的物鏡聚光鏡冷卻器可能是必要的,以避免這些顯微鏡元素的試樣加熱,可以防止由外部塗層的玻璃表麵,用化學相似的圖像流(柯達)結霜。無論調查對溫度的要求,然而,應注意的是,保持一個確切的溫度​​值,通常是一樣保持穩定的實現和穩定地保持一個恒定的溫度並不重要,重要。

 

高級封閉與開放係統成像

在一般情況下,倒置顯微鏡(組織培養)是最常見的活細胞成像儀器,但正置顯微鏡也適合用於此目的,有幾個重要的讓步。研究者必須謹慎設計實驗(無論在顯微鏡幀配置)確定必要的倍率範圍,工作距離的限製,和最佳的數值孔徑,所有這些都涉及到景深。流體耦合的物鏡(油和水浸泡)在大多數情況下,將可使用的溫度控製時,利用與哺乳動物細胞培養。在透射光中的應用程序需要高數值孔徑的聚光鏡中,腔室必須能夠容納的工作距離,物理尺寸,靠近聚光鏡的前透鏡元件,特別是在油的上部腔室玻璃。顯微鏡載物台的幾何形狀也應與培養室的尺寸相匹配,以確保有足夠的間隙。一般來說,倒置顯微鏡是由於較長的工作距離聚光鏡和使用這些工具的能力高數值孔徑物鏡光學表麵上直接支持細胞活細胞調查優越。

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采用先進的開放室培養係統時,應考慮一些變量。特別是,體積,孔徑尺寸,建材,蓋玻片厚度,腔室的幾何形狀和生物相容性問題必須解決。其他因素可能會影響實驗的成功,包括蒸發(冷凝),環境光線,視角,和實驗室的環境條件。對於更複雜的封閉係統室,許多同樣的考慮也適用,但是,額外的特性也很重要。其中有固定的或可變的腔室容積的要求,光學表麵,流體交換率,層流,剪切應力,灌注流量梯度,流道的幾何形狀之間的間隔距離。此外,溫度控製和均勻性和熱效應的油或水的浸入物鏡是兩個係統設計的重要因素。

 

封閉係統的活細胞成像室需要的情況下,那裏的文化,必須從外部環境完全隔離,或應用程序中使用先進的對比度增強技術,傳輸光學顯微鏡(如高分辨率DIC)。在這些情況下,細胞被放置在一個溫度控製,灌注的光學諧振腔,或直接生長在蓋玻片形成室下部光窗口。各種各樣的傳統和先進的設計,配置,售後為封閉係統成像室市售。絕大多數的這些設計利用兩個光學表麵分離的密封墊片,被鉗位在一個金屬的或聚合的殼體一起形成夾心灌注環提供的相似的特征。其中發現許多密閉的腔係統的缺點是過度光學表麵之間的分離,固定光學腔容積,冗長的流體匯率,動蕩的灌注,在裝載困難,和泄漏。一些更先進的開放和封閉係統成像室設計,以解決共同的問題,並提供出色的成像特性如下所述。

 

Bioptechs三角洲T開放係統

三角洲T Bioptechs 培養室係統提供了一些創新的設計圖案,可以利用一個令人驚訝的優勢,廣泛的靜態和灌注活細胞成像實驗。仿照傳統的開放室培養皿後,三角洲T培養室由一個35毫米的菜融合到一個170微米的蓋玻片跨越整個底部采用了表麵的熱轉印技術,以保持溫度控製(如圖10所示)。熱控製策略是基於後,銦-錫氧化物(ITO),施加到蓋玻片的下表麵的透明導電層的薄膜塗層。相反的蓋玻片邊緣沉積導電接觸,搞了一係列電極菜是正確就位時,在專業舞台適配器。溫度的調節,通過熱敏電阻器的反饋回路(容納在一個外部控製器單元),它適用於塗覆底麵蓋玻片電流,從而整個烹調加熱到所需的溫度。使用這種技術的熱響應是每秒約0.1攝氏度。

德爾塔T係統的快速響應時間,使控製器切換電流的流動,在幾秒鍾內打開和關閉,從而有可能以補償溫度變化,發生由於表麵蒸發,熵,或灌注中的菜。耦合到快速的響應時間是一個高速的安全電路設計控製器錯誤事件中保護細胞。該係統提供了高分辨率的成像能力通過無應變均勻的玻璃表麵,並可以用護罩玻璃的各種厚度,包括數字1.5的高數值孔徑的應用程序設計的蓋玻片。這道菜環境兼容流行的對比增強模式,明,暗場,偏光,相襯,DICHMC,熒光,多光子共聚焦顯微鏡。

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1993年引入,使用蓋玻片上的薄膜塗層的第一表麵的熱傳遞技術提供了廣泛的修改和變化的基本原理的基礎。例如,德爾塔T和類似的係統是有用的,在調查過程中溫度的控製,可以從物鏡在適當的焦距的光學參考平麵懸浮在組織切片標本。此外,適配器可以很容易地安裝,長時間保持低容積灌注。緊密配合蓋也可利用高數值孔徑實驗標本介質或成像緩衝區完全充滿以上定義一個光學表麵的溫差計算菜肴。此裝置消除空氣和介質的表麵之間的界麵,從而防止圖像對比度的變化,結果在介質上的物鏡卷,從微小的波動。此外,可用於低倍率的傳輸或高倍率熒光實驗的電加熱的,光學透明蓋玻璃蓋。蓋罩玻璃的熱控製,可以防止冷凝的下表麵上形成。此外,另外的氣體端口可以被用於保持在培養氣氛中的二氧化碳的濃度在長時間的加熱蓋。可以通過潛入菜盤管循環的製冷劑液體冷卻標本三角洲T係統。

 

Bioptechs FCS-2閉環係統

介紹一個的獨特的微渡槽控製灌注技術,Bioptechs關閉係統FCS-2培養室,是一種先進的解決方案,許多的困難,經常遇到的剪切應力和在灌注室中的流動幾何。在這個係統中,微渡槽觀察室製作成一個定義的表麵的光學諧振腔(參見圖圖1b),圖8d),圖11b)),將灌注槽。這種設計消除共同的許多其他腔室通過創建隻有一個單一的分離灌注從蓋玻片滑動墊片的光學腔灌注環。的物理配置的微渡槽槽產生優秀的層流區域的光學諧振腔中,而的單密封墊設計使研究者定義的尺寸,體積,厚度,及形狀的腔室。此外,微渡槽灌注室提供大光圈流,輸入和輸出,從而減少體積交換率的問題。為了進一步提高性能的FCS-2室係統的第一表麵的熱傳遞技術(如上所述)施加的玻璃微渡槽,熱均勻性,從而增加腔室,即使在沒有流動的期間。因此,細胞培養物保持在一個溫度控製的光學光學顯微鏡的所有模式兼容的環境安全。

 

東海希多孵化載物台

行銷下的各種商號及配置,東海希多載物台頂部孵化器(型號INU)是由幾個主要的顯微鏡製造商,無論是作為一個的灌注設備或作為靜態室的組合係統,可以利用模擬條件在濕潤的二氧化碳培養箱中(圖11a)中示出)。高濕度均維持通過一個圓形,恒溫水槽配備二氧化碳注射器喂食由遠程氣體混合單元。聚光鏡光圈護罩玻璃加熱由第一表麵上的塗層,以防止結露的形成,同時使透射光微分幹涉對比和偏振光成像技術在低數值孔徑的應用。在蓋玻璃上的接入端口允許圖像采集會話過程中的代謝物和藥物注射。腔室的設計與的灌注配件和一種抗漂移板的上方插入到隔離培養皿中,從加熱元件的加熱載物台,從而最大限度地減少焦點偏移。一個可選的物鏡加熱器可用於與浸沒物鏡維持樣品溫度。室的設計和多種氣體混合是最流行的商業顯微鏡。

 

最全麵的商業包裝成像室是由華納儀器,專家,電生理和細胞生物學研究工具。該公司提供了驚人的陣列成像和錄音室,載物台適配器(參見圖7c)),溫度控製器,灌注係統,物鏡暖,漏油傳感器,專為廣泛的應用在灌注加熱器。此外,由於活細胞成像技術在細胞生物學實驗室成為一種比較流行的,越來越多的創新培養室結構,打算灌注和靜態文化,將不斷推出由廠家售後。活細胞成像的特定商業培養室係統之前,研究者應仔細細讀豐富的上線和發表的科學文獻。



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