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奧林巴斯顯微鏡:熒光激發和發射基本麵概述

2013-10-16  發布者:admin 

由於其新穎的電子配置,熒光染料有獨特的特征吸收光譜(通常是類似的激發)和發射。這些吸收光譜和發射光譜表明相對強度的熒光,與經典的相對強度與波長在橫軸上繪製在垂直軸。對於一個給定的熒光染料,製造商指示的照明激發光強度和熒光的發光強度的峰值波長為峰值波長。重要的是要了解顯示對於一個給定的熒光染料的激發和發射光譜的圖表和曲線的原點。

excitation emission figure1

為了確定一個特定的熒光染料的最大吸收波長(通常是相同的激發最大值)的發射光譜來確定,並在該波長下被激發的熒光。一個典型的熒光染料的吸收光譜示出在圖1(a)如吸收的相對強度對測得的波長作圖。甲單色儀(一種裝置,允許通過的窄頻帶的光的波長),然後用於掃描的熒光發射強度,發射波長在整個係列。熒光的相對強度的測量是在不同波長繪製的發射光譜,圖1(b)中示出。以相似的方式確定一個給定的熒光染料的激發光譜的最大強度的波長,而通過一組連續的波長激發熒光團的熒光發射通過監測。其最大發射選擇,唯一的排放物在該波長的光傳遞給探測器。激發誘導(通常是通過單色儀),在不同的激發波長所發射的熒光的強度作為波長的函數的測量。其結果是一個圖形或曲線(圖1(a)中示出),示出在光譜的激發波長的激發所產生的相對熒光強度。

以下幾點結論:可以從一個典型的曲線或光譜的激發波長和發射集。通常有較高的波長的激發光譜和結束的下的發射光譜的波長端之間的重疊。必須消除這種重疊激發和發射強度和波長(圖1(c)中示出),在熒光顯微鏡中,激發光濾光片,二色光束分離器(在反射光中的熒光)的適當選擇,通過阻擋或發射過濾。否則,激發光更亮淹沒弱熒光發射光,並大大減少了標本的對比。

當電子從激發態到基態(見下麵一節題為“ 分子解釋),有一個振動能量損失。其結果是,被移動到更長的波長比激發光譜(波長成反比的輻射能量)的發射光譜。這種現象被稱為斯托克斯“斯托克斯位移。斯托克斯位移(Stokes shift)越大,越容易分開激勵光從發射光。的發光強度的峰值通常是低於激發峰,發射曲線的往往是激發曲線的鏡像圖像,但轉移到更長的波長。為了實現最大熒光強度,熒光染料通常是在該波長激發激發曲線的峰值,選擇在發射曲線的峰值波長(或觀察者所選擇的其它波長的光)的發光檢測。的激發波長和發射波長的選擇控製的適當的過濾器。在確定的光學係統的光譜響應,技術修改需要考慮到對於不同波長的玻璃傳輸和檢測器的靈敏度變量等因素。

excitation emission figure2

在圖2中示出一個典型的熒光染料吸收的發光光譜圖。請注意,這個典型的熒光吸收(通常是相似的純化合物的激發曲線)和發射熒光強度的曲線形狀有幾分相似。一直被稱為十九世紀中期以來,(Stokes定律)之間的激發和發射波長移位。另外請注意,激發和發射曲線的上端處的激發和發射曲線的較低的波長有所重疊。

激發和發射波長的分離是通過選擇適當的過濾器,如在圖3中以阻止或通過特定波長的光譜。熒光照明器的設計是基於容易地更換過濾器插入到光路的方式向試樣的激發光和發射光的控製,然後由試樣放出。中的發光強度低,這是很重要的,選擇的激發光源是足夠的亮度,因此,可以最大化的發光相對較弱的,令人滿意的吸收和生物產量,熒光染料的選擇。

excitation emission figure3

被稱為消光係數的熒光染料吸收的激發光的效率的。消光係數越大,在一個給定的波長區域(隨後的熒光發射的一個先決條件)的光吸收的可能性就越大。發射的光的產率被稱為量子數之比(“數據包”的能量)的量子產率,發射量子吸收(通常產率是0.1和0.9之間)的數量相比。低於1的量子產率是能量的損失通過非輻射途徑(如熱或光化學反應),而不是重新輻射通路的熒光的結果。在表1下麵列出的一組選定的熒光染料的熒光量子產率。請注意,一些量子產率似乎微不足道(苯),而別人是非常有效的(熒光素和羅丹明-B)。

熒光的熒光量子產率

複合

溶劑

激發
波長
(納米)

發射
波長
(納米)

量子產率

吖啶橙

乙醇

493

535

0.46

乙醇

248

300-350

0.04

葉綠素a

乙醇

440

685

0.23

曙紅

521

544

0.16

熒光

437

515

0.92

羅丹明-B

乙醇

555

627

0.97

表1

消光係數,量子產率,平均的光源的發光強度,熒光壽命的熒光發射的強度和實用程序的所有重要因素。此外,局部地區的環境周圍的熒光染料中起著極其重要的作用,在確定的熒光發射的特征。溶劑的粘度,離子濃度,pH值,和疏水性環境中的變量,如可以有深遠的影響的熒光強度和激發態的壽命。

熒光分子解釋

圖解方式示於圖4(a)(稱為雅布隆斯基能量圖),有時被描述熒光活性。激發之前,被描述為在基態的分子的電子組態。吸收的激發光的光子,通常短的波長時,電子可以被提高到一個更高的能量和振動激發態,一個過程,可能隻需要一千萬億分之一的第二期間(時間段通常被稱為飛秒,10E 15秒)。

excitation emission figure4

熒光,期間間隔約一萬億第二(一皮秒或10E-12秒),被激發的電子可能會失去一些振動能量對周圍環境和返回到了什麽叫做最低激發單重態。從最低激發單重態的電子是“放鬆”返回到基態時,如在圖4中示出與同時發射的熒光光(一)。所發射的光總是比波長較長的激發光(斯托克斯定律)和繼續,隻要激發照明沐浴熒光試樣。如果被中止,令人興奮的輻射熒光停止。

有時候被激發的電子,而不是的放鬆的最低單重態,可通過振動相互作用,使一個禁戒躍遷到退出的三重態,然後到基態的過程中,輻射的發射可能大大延遲幾秒鍾,或以上。這種現象是磷光特性,圖4(b)所示。在某些情況下,被激發的電子可以從三重態的最低激發單重態,然後返回到基態,隨後發出熒光。這個動作需要較長的時間比平常熒光(約一兩微秒),被稱為延遲熒光(圖4(c))。在其他情況下(例如,光漂白或鹽,重金屬或其他化學品的存在下),發出的光可能會被顯著減少或完全停止,如下文所述。

衰退或漂白

有一些特定的條件下可能影響再輻射的光激發熒光,從而降低熒光強度。這種減少的發光強度通常被稱為衰退漂白。一些學者進一步細分變為淬滅和漂白。漂白的熒光分子,因為在分子氧存在下的光強度是不可逆的分解。淬滅也導致熒光強度的減少和經常作為氧化劑或重金屬或鹵素化合物的鹽的存在下的結果帶來的。

通常情況下,淬滅結果的能量轉移到其他受體分子物理激發熒光基團,這種現象被稱為共振能量轉移。這種特殊的現象已成為一個較新的技術,測量距離遠低於在光學顯微鏡的橫向分辨率的基礎。

漂白的發生,導致FRAP,恢複或熒光漂白後,被稱為一種技術。FRAP是基於激光短脈衝串和隨後的恢複引起的擴散到漂白區域的熒光基團的熒光觀察漂白。

熱門抗淬滅試劑的屬性

抗淬滅試劑

評論

對-亞苯基
二胺

最有效的試劑FITC。羅丹明也有效。應調整到0.1%甘油/ PBS中使用對苯二胺。試劑變黑受到光線照射時,它應該被保存在一個黑暗的地方。皮膚接觸是極其危險的。

DABCO
(1,4 - diazabi- 
環-2,2,2 - 
辛烷)

高效FITC。雖然其效果是稍低於對 - 苯二胺,它更耐強光,並具有更高的安全水平。

正丙酯

最有效的試劑,羅丹明,FITC標記也是有效的。應調整到1%甘油/ PBS中使用子酸丙酯(PG)。

2 -巰基
乙胺

用來遵守染色體和DNA標本染色用碘化丙啶,吖啶橙,或Chromomysin A3。應調整,以0.1mM的2 - mercaptotheylamine在Tris-EDTA

表2

為了減少在某些試樣的衰退程度,它可能是在光路中,最好使用中性密度過濾器之前的照明達到激發光濾光片,從而減少激發光的強度。在其他情況下,可能會降低衰落的影響,通過改變安裝介質的pH值,或通過使用抗漂白劑(表2中列出了一些比較重要的代理)。對於數字成像,顯微攝影,或簡單地目視觀察,迅速變化的視場也可避免衰退效果。



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