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尼康顯微鏡:水浸物鏡的結構

2013-10-16  發布者:admin 

薄切固定的組織切片和活細胞附著到玻璃基板上的微觀調查,定期製作精湛的高清晰度圖像時,用人的計劃複消色差透鏡或螢石物鏡的具有高數值孔徑。然而,目前的生物研究的顯著量的涉及到生物體組織內,其中重要的事件可能會發生內的檢體的深部,遠離玻璃蓋的細胞動力學調查。嚐試細胞的細節圖像,並與傳統的油浸技術從標本玻璃蓋千分尺距離活動經常遭受的文物,包括嚴重的光學像差(球形)。作為液浸介質中,使用水代替油,是一種有效的方法來克服的像差問題,涉及活細胞和組織的應用,高度校正後的水浸物鏡已經由幾家製造商引入。

water immersion figure1

最近的技術進步,加上新的熒光探針的發展,儀器儀表和軟件係統相結合,顯著推進在活細胞和組織研究的前沿知識。的主要光學和定量的成像技術,利用這些調查包括共聚焦和多光子顯微鏡,微分幹涉相差(DIC),和傳統的寬視場落射熒光方法。在活細胞研究的一個基本問題是需要的細胞被包圍在一個適當的營養生理溶液的腔室或容器,以及區域或感興趣的事件通常位於50200微米以上,遠離玻璃蓋,妥善保養。一些研究者已經討論了采用高數值孔徑的油浸物鏡成像焦平麵,還不能立即相鄰的玻璃蓋的局限性。確定的最嚴重的缺陷是降低分辨率和圖像強度,並,這些工件成為顯著的距離超過約15微米的玻璃蓋。折射率的光路中的不匹配所造成的球麵像差的圖像質量惡化的首要原因,這個像差的增加成正比的成像深度。

 

利用浸沒流體的主要理性實現的物鏡的最大數值孔徑,提供改進的衍射限製的空間分辨率。然而,比較實用的優點是,不太可能發生的球麵像差。由於典型的顯微鏡物鏡的光學玻璃的折射率,最高目前由油浸物鏡最終光學性能。在理想的成像條件下,最佳的光學性能是通過使用浸油物鏡前透鏡元件和玻璃蓋的折射率完全匹配。換人水或其它液浸介質具有較高或較低的折射率,這會降低性能。然而,在情況下,是不理想的,其中球麵像差成為圖像質量的限製因素,較低折射率的浸沒液體的使用常常是有利的。介紹含水介質中的成油狀物浸沒係統的光路的增加的球麵像差,以及實現采用水浸物鏡的結果,簡單地從當時的成像條件下的最重要的和限製的像差減少的好處。

 

光思考理論

在活細胞和組織的研究應用最廣泛的方法之一,是傳統的寬視場熒光顯微鏡,在高數值孔徑的油浸物鏡緊鄰玻璃蓋的相對平坦的試樣用於觀察。固定的組織切片或細胞被嵌入在水性介質中具有不同的(低級)的折射率比玻璃蓋。折射後出射的光的客觀穿過浸油和蓋玻璃(由設計具有相同的折射率),並遇到接口與包埋劑,具有不同的折射率。上麵的折射率界麵的光偏差的淨效應取決於觀察麵的深度。在焦平麵附近的玻璃蓋,在物鏡光學設計要求被滿足時,係統的性能相當不錯。

如共聚焦和多光子顯微鏡技術的引進和開發,改變了成像的要求從傳統的情況下,通過使研究更厚的標本,大標本量的三維可視化,往往涉及某種形式的圖像卷積或重建。的圖像的光學部分在遠離玻璃蓋接觸,試樣,大深度的能力,在該係統的光學特性的改變的光穿過的培養基中這是不希望的設計。光學矯正是優化的光分布在均勻介質中相鄰的玻璃蓋,盡管在實踐中,觀察量可能相差一定距離,和由折射率差的焦點的距離的光的分布顯著影響從玻璃平麵。所產生的偏差造成損失的分辨率和信號強度,以及重點轉移。指出在20世紀80年代中期,在分辨率和圖像亮度降低,發生在許多情況下,當飛機從觀察到更深的區域在試樣試樣玻璃界麵,由Stefan W.地獄和其他,並成為主題大量的研究,旨在在共聚焦熒光圖像的解釋。

water immersion figure2

如圖2中所示的油浸物鏡功能的理想情況下(圖2a)),比較光的情況下的折射率之間的不匹配的浸油和水性介質嚴重的圖像畸變的結果(圖2))。成像由含水介質中的區域是分開的玻璃蓋的試樣平麵代表為準厚的生物試樣研究的光學條件,所遇到的圖像劣化是一個主要的水浸物鏡的就業激勵。

 

複消色差透鏡的俯視油浸物鏡的就業情況建立了理想的光學當試樣是在直接接觸玻璃蓋,以確保均勻的折射率(名義上為1.515),在試樣表麵的整個光路從焦點通過蓋玻璃,進入浸油,並繼續到前麵的物鏡元素。在此配置中(圖圖2a)),無折射光波發生的物鏡的數值孔徑,是利用。此外,鏡頭畸變控製,所產生的圖像表現出最大的分辨率和對比度。

 

由於焦平麵調整向更深的區域內的細胞或組織的部分,或者如果位於下方的層的生理介質中,光路穿過折射率接口或梯度之間的試樣組(n = 1.35),生理食鹽水溶液試樣溶液組(n = 1.33),和蓋玻璃浸油物鏡的組合組(n = 1.515)。於各折射率界麵,其結果發生的折射光線的物鏡的數值孔徑,沒有意識到,作為物鏡偏離其設計準則,介紹了光學像差。向著光軸折射引起的光線彎曲,因為他們通過從含水介質中的折射率高的玻璃,有效地限製了的物鏡的最大數值孔徑(參見圖2b)條)。水引入的光路中的浸油係統,利用一個1.4數值孔徑的物鏡,例如,降低的有效數值孔徑為1.33到最大值。通過一層水或生理介質中觀察試樣時,油浸物鏡不能滿足其設計性能,並導致嚴重的不利影響,在圖像中引入的球麵像差。這些效果在試樣的深度成比例增加的焦點的距離變得更遠的玻璃蓋的下表麵上。

 

在涉及的攝像的活細胞,利用浸油的研究中,球麵像差變成圖像質量的一個限製因素。按比例增加的細胞物質或周圍的細胞的含水介質中的像差成像深度表現為減弱的強度和對比度,防止較小的試件的詳細信息的分辨率。實驗已經表明,這種失真的影響足以引起誤解的檢體的結構,如海洋生物中的纖毛。反褶積方法中的應用數學補償的失真的這種性質是一個可能的解決方案,雖然精確的測量的點擴散函數(PSF)是必要的,並且實現這一點成為問題的點擴展函數時,被扭曲的軸向和橫向。

 

在所有三維顯微鏡,它被越來越多地應用於活細胞和其他非嵌入的生物標本,在點擴散函數的像差的調查方法,是顯著的,因為相對低折射率的標本。點擴散函數的扭曲誘導的球麵像差,在共聚焦顯微鏡中的特別重要的意義,因為可以有損害的能力,共聚焦顯微鏡的主要優點:消除外的焦點信息,以提高對比度和有效的xy平麵中的分辨率,以及創建高分辨率XYZ光學部分。折射率不匹配的圖像畸變的原因是在一定程度上,水浸的就業物鏡應該大大增強高分辨率深度依賴低折射率成像的標本。

water immersion figure3

在一個三維的試樣的顯微鏡,圖像數據可被認為包含畸變的試樣的表示形式,或已經模糊了,由三維點擴散函數。如果反褶積方法將被利用來重建對象的異常的圖像數據,點擴散函數的精確量是必需的。無論是直接測量和計算方法來描述點擴散函數,每種技術都有優點和缺點。當實驗對比油狀物浸沒係統和水浸獲得的數據,通過測量或計算的三維點擴散函數,焦平麵依賴球麵像差顯著地降低在水中浸沒係統。

 

和浸入物鏡試樣(油和水)之間發生的成像光線追跡的比較在圖3中,隨著幾何模型的熒光珠在含水介質中的接口100微米以下的xz圖像的預測。在圖3a)圖中,在左邊的球體表示的熒光珠的實際形狀,而在右側的細長形狀是提供的油浸物鏡成像的印象。光線追跡到油浸物鏡前麵的鏡頭(圖3b))和水浸的目的(圖3c))珠(圖3中的黃色箭頭)的折射率不匹配如何掩蓋實際試樣透露細節的幾何形狀。在水介質中,在胎圈到一個明顯的細長橢圓形失真油浸物鏡成像時,如在圖3b)中示出,但仍使用水浸物鏡(圖3c))時,球形。一個藍色的球體表示的實際試樣的表觀圖像被表示為一個紅色的橢圓形或紅球。

 

在用於三維圖像數據的順序是一個可靠的真實樣品的代表性的點擴展函數卷積,它必須是已知的,不隨軸向或橫向的焦點位移的點擴展函數。在實踐中,這可能不是設計的物鏡是,如果條件沒有得到滿足的情況下。的物鏡的設計標準試樣中,浸沒介質,和玻璃蓋的厚度和折射率的折射率的函數。當試樣液浸介質匹配的折射率,像差被最小化的任何試樣的厚度,因為聚焦在試樣中的更深的平麵介質結合在該介質中的光路長度增加補償減少的​​液浸介質中的路徑長度。兩個階段位移的影響可互相抵消,從而使透鏡係統的目的和圖像共軛的表麵重合,如所需的圖像形成無像差。油浸物鏡,因此,利用圖像包埋標本,但表現出顯著的點擴散函數的圖像低指數生物標本時沿光軸偏差達到了設計要求。在一個係統中,其中沿軸向變化的點擴展函數,點擴散函數將計算為每個圖像平麵中的三維堆疊,需要一個複雜的模型,用於計算的方差,以及一個圖像處理算法的強大的比卷積。這些因素提供了強有力的理由調查三維生物標本,利用水浸物鏡在努力,以盡量減少軸向點擴散函數的方差,以及由此產生的圖像畸變。

 

水浸入式光學設計和性能

任何浸泡的目的,需要前鏡頭元件和試樣之間的空氣以外的流體的基本功能之一是為了增加係統的數值孔徑。在利用油浸物鏡,它最初出現。將玻璃蓋的厚度並不重要,因為它的折射率大致匹配的浸沒流體。這實質上是真實的,隻要試樣安裝在加拿大香脂或其他類似的折射率的介質的玻璃蓋。當試樣安裝在水性介質中,如生理鹽水中,具有顯著不同的玻璃和浸油的折射率,光學性能的變化相當大。因此,聚焦通過什至10微米厚的水層可以引入嚴重的圖像畸變,由於非對稱,相對於焦平麵的點擴展函數(參見圖2和圖3)。樣本,除非在觀察區域中直接接觸玻璃蓋,利用修正油浸物鏡的透鏡像差的光學假設是無效的。

 

由於油浸物鏡的這種行為變得更加明顯調查,被確認和三維成像研究活細胞和組織上的新興技術的限製,一些顯微鏡製造商開始引入校正高數值孔徑的水浸20世紀90年代中期的物鏡。計劃複消色差校正,數值孔徑約1.2水浸物鏡稍低的數值孔徑值可比的油浸鏡頭,但添加允許200微米的順序通過水層的高分辨率成像的關鍵能力的厚度。雖然水浸物鏡的主要優點是改善了成像功能在低折射率的生物標本的厚製劑,以及其他的實際利益是來自於使用水作為浸沒流體。水沒有固有的熒光複雜圖像解釋,很少有汙染的生理溶液的風險,水溶液中不要求特殊的清理方法,成本可忽略不計。

 

考慮井上伸也首次提出規範發展,高度糾正60X計劃複消色差透鏡水浸的目的所產生的尼康代表由其他製造商推出類似的物鏡。的物鏡具有1.2的數值孔徑和工作距離為220微米,得到在該深度處的潛在圖像的焦平麵內的水傳播的試樣(見圖1)。的校正環可以調整,以適應護罩玻璃的厚度從0.15毫米至0.18毫米,消除球麵像差的一個基本特征。此外,該物鏡從近紫外到紅色的可見光光譜區域具有高傳輸和色差校正,因此,可以利用共聚焦顯微鏡和常規熒光和微分幹涉相差(DIC)技術。

 

正如前麵所討論的,均勻的浸泡將確保光線偏轉,直到達到物鏡的第一透鏡元件的後表麵上,通過試樣浸沒介質的道路上。如果折射率接口被消除,物鏡可被設計成在其整個聚焦範圍達到衍射極限性能。低折射率的樣品的水浸中的應用的更高折射率的浸沒油消除了該問題,但如果水浸的目的是用來用護罩玻璃,玻璃和水的折射率之間的差被引入(圖2( c)條)。確切的折射率和厚度的玻璃蓋在實現最大分辨率變得至關重要,是許多水浸物鏡的原因,包括不同的護罩玻璃性能的補償校正衣領。光學塑料也可能是有用的減少安裝介質和水物鏡的浸沒流體的折射率之間的不匹配。塑料蓋眼鏡,具有折射率在1.351.4之間的範圍內顯著降低,遍曆從檢體通過水性介質中的物鏡前透鏡元件的成像光線的折射角。

water immersion figure4

水浸物鏡已經實用評測由許多研究者進行的,利用不同的方法來評估在某些應用中,這種類型的係統的好處。基於理論考慮的點擴散函數的球麵像差的影響,清晰等優點水浸過油浸技術,生物研究的預測,尤其是樣品平麵玻璃蓋一定距離。實驗結果在很大程度上支持了理論預測,展示形象深入到水標本的能力,顯著改善,結果與油浸物鏡相比。

 

一個實驗評估,在一個60X1.4數值孔徑)計劃複消色差透鏡油浸物鏡相比,進行了60倍的水浸計劃複消色差透鏡物鏡1.2數值孔徑,如上所述的性能成像測試物鏡和高度詳細矽藻在低於玻璃蓋的各種距離(參見圖4)。與理論預測的結果是一致的生產油浸物鏡隻有當試樣直接接觸玻璃蓋均位於具有出色的分辨率和高對比度的圖像,表現出嚴重的對比度下降時,各項指標均通過84微米成像水層。水浸物鏡生產油浸物鏡,相比稍低的分辨率和對比度,當物鏡標本與玻璃蓋接觸,但圖像質量保持層中加入水時,基本上沒有降解的成像路徑。

 

4展示的是與一個標準的60倍複消色差透鏡1.4數值孔徑的油浸物鏡(圖4a)和圖4b))的結果相比,用一個60倍複消色差透鏡1.2數值孔徑的水浸的目的成像的星形測試物鏡的中央部(圖4c)和4D))。將試樣製備(圖4b)和圖4d))與水或不帶水(圖4a)和圖4c))之間的玻璃蓋(170微米厚),測試物鏡。在圖4a)中,物鏡圖像被捕獲的油浸物鏡和測試物鏡和護罩玻璃之間沒有水。的對比度上麵的半徑為2.3微米,這對應於約0.2微米間距從中心消失。黑盤的中央有一個直徑為1.2微米,以提供一個尺寸參考。當利用相同的物鏡圖像的物鏡84微米之間的水的測試物鏡和玻璃蓋,對比度嚴重退化,低於0.4微米的間距變得不可見(圖4b))。相比較而言,當測試物鏡物鏡之間的蓋玻璃的水沒有水浸物鏡成像,對比度低於0.24微米的間距(圖圖4c))中消失。當與物鏡之間的玻璃蓋(類似於上麵所討論的油浸物鏡),一個84微米的層的水被放置對比度仍然很高(圖圖4d)),水浸物鏡的性能不會受到損害由玻璃蓋和測試物鏡之間的額外的水層。

 

示出的兩個物鏡的性能的定量評價圖形的對比度傳遞函數的測試物鏡組成的等距隔開的各空間頻率(圖5)的光與暗的酒吧。的對比度傳輸曲線圖所示的光學係統是能夠從物鏡(試樣)傳輸到圖像物鏡對比度的量(以百分比表示)。對於一個給定的空間頻率的物鏡保持充分的對比度的圖像,將在圖形上繪製為100%,較完善的對比度傳遞由係統。由於對比度下降在較高的空間頻率,它最終會被減小到零,它可以被視為被評價的光學係統的分辨率的絕對限製在一個特定的行間距。每個圖形顯示在以下幾種情況下產生的對比傳遞函數:沒有水層之間的玻璃蓋和測試光柵,並添加不同的水層厚度。此外,理論上計算出的對比度傳遞函數繪製相應的數值孔徑為無像差的物鏡。數據高達153微米的水被水浸的目的,而50微米的最大水厚度油浸物鏡所示。

 

正如圖5中所示,水浸的目的提供了對比度和分辨率的值幾乎相當於理論極限,80153微米的水層中加入物鏡試樣和蓋玻片之間,並保持其性能,仿真中遇到的情況深於水的材料,例如活細胞或組織成像。與此相反,油浸物鏡表現出分辨率的限製減少了50%,嚴重退化的對比度進行測試時,隻有50微米的水覆蓋的物鏡。的性能急劇下降,隨著空間頻率的增加。

water immersion figure5

額外的評估已經證明的能力高數值孔徑計劃複消色差水浸物鏡,獲得高質量的圖像深度為220微米的水,一個壯舉,就根本不可能使用油浸物鏡。執行其他調查測量的水浸物鏡的點擴散函數,它支持的測試物鏡的性能報告,並進一步說明焦點平麵的上方和下方的功能改進的對稱性的好處。的測量結果表明,隨深度變化的失真可以建模和校正,使透鏡可用於精確測量沿Ž軸垂直分辨率測定。的點擴展函數的客觀事實,即上方和下方的焦平麵(表示最小的球麵像差)是對稱的,使得它可以為目的,其數值孔徑的理論計算的軸向分辨率相匹配。該光學性能的一個有利於整體施加到三維的試樣相比,以相同的技術,利用油浸物鏡在圖像去卷積方法中是一個顯著的改善。此外,基本消除水浸物鏡的球麵像差在改進的信號收集和圖像的亮度時,在水深超過約20微米的在水介質中或組織的成像。

 

共聚焦顯微鏡的特殊方麵

聚焦方法的主要好處包括控製焦平麵厚度的限製,允許光學切片和改進消除耀斑圖像平麵外所產生的信號的分辨率和對比度。這兩個因素綜合起來,以允許提供的三維表示厚標本的XZ掃描圖像。球麵像差限製了這些功能,並在試樣時,試樣的折射率不同的浸沒流體的深度成比例增加。如果油浸物鏡用於與含水的試樣,添加約三分之一波的球麵像差為每微米聚焦深度低於玻璃蓋。少量的球麵像差引起的點擴展函數的擴展和等效軸向分辨率的損失(見圖6)。累積超出約10微米,如果聚焦到一個低折射率的標本的很大程度的像差產生相當大的模糊的點擴散函數和圖像中的對比度的損失。如果不消除球麵像差,清晰度和對比度損失聚焦的方法覆蓋任何利益成像時,在水深超過約15微米的玻璃蓋。利用水浸物鏡消除這些問題提供了實實在在的好處,如活細胞成像時,水標本。

 

折射率不匹配產生的球麵像差,尺寸測量形態的誤解和錯誤的程度,可以發生扭曲光學數據。眾所周知的三維顯微鏡標本的失真表現為沿著光軸(z -軸)的伸長率功能。多項技術來衡量和計算模擬的效果,但超過的幅度和確切原因存在矛盾。的工件已實驗驗證,但是,已知會產生導致它的目的似乎是它的實際大小的3倍(圖3)的軸向伸長。異常取決於浸沒條件下,被認為是一個事實,即不會導致直接對應的焦點位置的位移的軸向階段的活動所造成的。估計距離和體積的錯誤發生,在各種形式的三維定量顯微鏡具有重大影響。其中,已被證明在失真效果方麵發揮作用的因素是嵌入或周圍的介質中和浸沒流體,試樣尺寸,玻璃蓋之間的距離,和物鏡的數值孔徑的折射率之間的不匹配。利用水浸成像低折射率的標本,如生物材料時,將減輕的效果,雖然在某些條件下,將不能完全消除。細胞物質通常在約1.331.39之間的折射率變化,因此一些折射率的不匹配可能仍然存在,即使當使用水作為液浸介質。

water immersion figure5

除了尺寸縮放的折射率不匹配時發生的錯誤,可以由相同的點擴散函數的扭曲引起的信號強度的顯著影響。許多共聚焦係統的配置,掃描整個試樣的照明針孔利用在檢測路徑,被掃描的目的不包括所有來自檢測器的光聚焦在相同的機製。深內的試樣,利用油浸物鏡成像時,球麵像差的嚴重程度,可引起足夠的焦點偏移,大部分試樣中由熒光團發射的光不能穿過針孔探測器。因此,大多數達到共焦檢測器所發射的信號從玻璃蓋除去試樣的區域之前丟失。伴隨著強度的損失,在所獲取的圖像的球麵像差引起的焦點偏移,並繼續減少幾何距離成試樣。

 

發布的理論和實驗分析確認了1.3數值孔徑的油浸物鏡,成像深20微米的熒光平麵內的水介質中,檢測峰強度低於40%,從飛機10 - 千分尺的深度。這個概念是在圖6中示出,其中顯示高數值孔徑的油浸物鏡,和其相應的軸向響應的共焦的點擴散函數的等高線圖,在水中的一些成像深度。在圖6a)的理想的點擴散函數(無球麵像差),而成像深度為51015,和20微米到含水介質中的圖中示出圖6b-6(五)元。通過應用高數值孔徑的水浸的目的是減少或消除球麵像差的有效途徑,以保持足夠的信號電平在高分辨率熒光顯微鏡。

 

一個經常被忽視的優點,使用共焦技術中的水浸物鏡是,水是粘滯性大大小於大多數浸沒油,因而在聚焦過程中,當物鏡和試樣的製備相對位移施加較小的力(表麵張力),在玻璃蓋給對方。玻璃蓋,因此,不太可能彎曲可能位移改變焦點時,在采集過程中的共焦的z係列試樣。在反複的重新調整,需要在光學切片標本最小化運動可能會導致更清晰,更有意義的三維重建圖像的堆棧。

 

最近,水浸物鏡已被實驗證明是適用於多個物鏡4Pi共聚焦顯微鏡和θ顯微鏡技術如。的4Pi共焦顯微鏡中實現類似的軸向分辨率的近場光學技術,是通過從兩個相對的高孔徑物鏡相幹聚焦的球形波陣麵的組合。兩個球麵波陣麵的結果,在增加孔徑沿著光軸,和較窄的點擴散函數的最小的相幹疊加。這種技術產生了最高的三維日期,這是在100納米的結合圖像重建的順序得到的遠場的分辨率。

 

高數值孔徑的水浸物鏡的發展之前,浸油的依賴有限4PI的共聚焦顯微鏡以甘油裝標本。甘油(1.47)的折射率被充分地靠近浸油(1.51),因此,最小的軸向掃描過程中所需的相移補償。細胞研究的很大一部分涉及基於甘油的安裝媒體,和至少一個製造商已經開發出了高數值孔徑的甘油浸泡的目的,以盡量減少從油甘油的折射率不匹配所導致的數據的降解。專為使用石英玻璃蓋(折射率1.46),鏡頭采用了一個的像差校正領容納甘油濃度在72%和88%之間。這一物鏡已被成功地應用在三維熒光顯微鏡,應該簡化甘油裝標本的4Pi顯微鏡。

 

到水或生理溶液中,然而,嚴重的球麵象差和相移的情況下,在深度成像在不允許的4Pi顯微鏡浸油或甘油浸沒物鏡進行。因此,油浸泡4PI方法並不適用於活細胞成像。高孔徑的水浸物鏡,以盡量減少球麵像差引起的折射率不匹配扭曲傳統的共聚焦和多光子成像提供相同的優點在4PI應用於活細胞研究的方法。雖然水浸物鏡比可比油浸鏡頭具有較低的數值孔徑,一些研究已經證明,他們產生有利的點擴散函數的特性,它允許在三維成像的活標本利用4PI顯微鏡軸向分辨率根本好轉。



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