設為首頁 | 添加收藏 |sitemap |百度地圖 |
貨真價實 坦誠無欺
新聞資訊

徠卡顯微鏡:相襯-使未染色相對象可見

2013-10-16  發布者:admin 

相襯是使未染色的相位對象(例如,扁平細胞)在光學顯微鏡下可見的光學對比度的技術。出現在明不起眼的和透明的細胞可以被視為在高對比度和豐富的細節相襯顯微鏡。

MDCK_cells_in_phase_contrast_korr_05_aaab9b6b68.jpg

使用圖像形成的相移

相對象引起的相移的標本的光通過。因為隻有振幅位移(強度差異)對於人眼或光電檢測器是可見的,染色的標本介導的振幅移位和通過的光的強度的差異。許多染色試劑的活細胞是有毒的,但是。相襯顯微鏡提供了一個可以使用的光程長度的差異所造成的相移的標本在光學顯微鏡下可見。它通過幹擾導致光波的振幅變化的相移變化。

1930年由荷蘭物理學家弗裏茨澤尼克相襯顯微鏡技術開發。澤尼克技術在1942年投入使用後,於1953年被授予諾貝爾物理學獎。

MDCK_cells_in_phase_contrast_korr_05_aaab9b6b68.jpg

圖 1AMDCK細胞,相襯顯微鏡


MDCK_cells_in_brightfield_korr_03_e861b8ae98.jpg

圖 1BMDCK細胞,明亮的視野顯微鏡

 

Amoeba_Proteus_Phase_Contrast_2_03_1c24d8d78b

圖 1C:阿米巴變形蟲,相襯顯微鏡


Amoeba_Proteus_Bright_Field_2_04_5136fbccb5

圖 1D:阿米巴變形蟲,明亮的視野顯微鏡

 

光波的幹擾

的光路長度的光路中的兩個點之間的折射率和厚度的商品。這是相關的渡越時間和光速。中的差異導致的光的波以不同的速度的光路長度時,通過試樣(即相移)。其結果的相位差發生。較高的折射率比周圍介質的光波,其相位的相位差導致的減速。

幹擾介紹了兩波與對方的互動,形成一個新的波浪圖案疊加原理。相關參數的幹擾光波,光波的振幅。如果兩個波幹擾,產生的光波的振幅等於兩個幹擾波的振幅的矢量和。

如果所產生的波的振幅增加時,建設性的幹擾將被描述為。這將是要麽兩個波峰或兩個波穀的情況下,如果在同一個時間點見麵。一個波的波峰和波穀又一撥也有可能是在同一個時間點見麵。這將導致降低所產生的波的振幅。然後,這兩個波之間的幹擾被稱為破壞性的。

用相襯顯微鏡的光路中

相襯顯微鏡的關鍵要素是環光圈和相位板。環空孔被放置在冷凝器的前焦平麵限製貫通光波的角度。的相位板位於物鏡的後焦麵和具有相位環的材料製成的,通過它的光變暗,並且改變其相位通過λ/ 4λ為光的波長。

在相差顯微鏡科勒照明的條件下,這是不與試樣相互作用的光波集中在物鏡的後焦麵,為亮環。空間的光環環沿著光軸相匹配,並導致不偏離的光的相移。光的衍射的試樣不主要取得的相位環,因此,不會受到影響。

受影響和不受影響的光波之間的是一個總的為λ/ 2的相移。不偏離的光的相位是先進的λ/ 4的相位環,衍射光的波通常是λ/ 4的延遲的生物樣本。λ/ 2的總的相移可以在圖像平麵上的光的波的破壞性幹擾。暗淡的不偏離的光通過相位環,重要的是要避免的不偏離的偏離光相比一枝獨秀。

λ/ 2的相移,在相襯顯微鏡觀察,波峰和波穀有效地滿足在同一時間點上產生了一個極大的破壞性幹擾效應。因此光的波的振幅減小,被變換成幅移相對象的相移。

Figure-2-neu_53872de098

圖 2:在相襯顯微鏡的光學路徑。的環形形狀的光聚焦在試樣上通過冷凝器,通過冷凝器的環形帶。部的環狀的光衍射結構的試樣(例如質膜,細胞器等),光密經曆了相移約¼λ(通常為生物試樣)。此相移,並繞過衍射光的相位環,和由相位環(大多分布在物鏡的後焦平麵)幾乎沒有影響。與此相反,直接來自冷凝器的環形帶的環形光擊中的相位環,這將暗淡的直射光引起的相移(通常是先進的¼λ或滯後¾λ為正相襯)。作為折射的光之間的總相移的標本的光通過相位環½λ,破壞性的幹擾就會發生。光密的結構也將隨之出現深(正相襯)。

 


Figure-3-neu_f2bdad7f64

圖 3:相環相襯顯微鏡的核心組成部分。一般它是由一個灰色的過濾器和一個保持板。沒有出現衍射,通過試樣的一部分光通過相位環(左箭頭)。灰色的濾光變暗以避免光照射。保持板的非衍射的光的相位延遲允許幹擾的光波,經驗豐富的相移和衍射,通過檢體(右箭頭)。

 

正麵和負麵的 兩種形式的相襯

有兩種形式相襯:正麵和負麵的相襯。它們的主要區別在於由相位差板的照明使用。正相襯,光通過相位環的相位前進相比,偏離光,而被延遲的相位在負相襯。在負相襯的相位的相位差導致到破壞的相位差。光波相和的,建設性的而不是破壞性的幹擾發生幹擾。這將導致產生的光的波的振幅的增加。  

正相襯顯微鏡,具有較高的折射率比周圍介質中的對象比折射率低的對象的顯示的顏色較深。對於負相襯相反。

解讀相襯圖像

相襯顯微鏡可視化的標本的光路長度的差異。的光路長度與試樣的厚度和折射率。蜂窩結構,如細胞膜和細胞器的光學路徑長度產生深遠的影響。由於許多細胞(尤其是在細胞培養)有平麵和定期的形狀,它們是很難在明顯微鏡可見。

甲這種細胞相襯圖像放大細胞結構的差異,可以看作是光密度圖,作為光密度值的標本或材料的折射率有很大的影響。然而,一些效果複雜的相襯圖像的正確解釋,因為他們不直接依賴於不同的光程長度。

光環效應描述的外觀,明亮的邊緣正相襯或負相襯大型物體周圍黑暗的邊緣。暈圈的形成,因為從檢體穿過的相位環,以及衍射光。在不偏離的波所形成的光的環比的相位環和低空間頻率衍射光波從檢體,可以通過該環形帶的小一點點。偏離的光通過相位環保持90°的相位差,因此不會受到破壞性幹擾。這導致了逆轉相反的邊界處的大對象導致的暈。

關閉遮陽效果描述與周圍介質相同的光照強度均勻的部位的標本顯示的情況下。雖然這些區域的光通過經曆的相移時,隻有輕微的衍射和散射角大大降低。因此,這些光波進入相環,如不偏離的光線並沒有受到幹擾。

相襯顯微鏡中的另一個問題是對比度反轉。如果存在具有非常高的折射率與低折射率的對象的對象,它們會顯得更亮,而不是更暗(正相位對比)。在這樣的區域中的相移是不是通常的λ/ 4移位的生物樣本,而不是相消幹涉,發生相長幹涉(相反為負相襯)。

雖然這些效果可以使相襯圖像難以解釋,相襯顯微鏡是一種方便和重要的光學對比度成像技術相對象。此外,相襯顯微鏡使細胞功能和結構的調查活標本,成為最常生物學研究中的應用對比法

Application_199_03_f41eb8f075

圖 4A:黑,相襯顯微鏡


Application_163_Rat_testicles__phase_contrast_04

圖 4B:大鼠睾丸,相襯顯微鏡


phase_contrast_Phaseolus_vulgaris_04

圖 4C:菜豆,相襯顯微鏡



滬公網安備 31011202003519號