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貨真價實 坦誠無欺
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尼康顯微鏡:在光學顯微鏡標本的對比

2013-10-16  發布者:admin 

生物體和類似的透明,未染色標本的高分辨率光學顯微鏡通常遭受缺乏對比,使這些標本幾乎看不見明照明模式。使用的顯微鏡物鏡的全孔徑,未染色的標本的圖像是非常差的,即使是透明的周期性結構的衍射光柵,對齊的纖維,集成電路副本,如絲狀藻類,矽藻。

specimen contrast figure1

 

雖然透明標本通常相互作用的光散射和衍射光束通過誘導相移,這些對象仍然在顯微鏡看不見的,因為人的眼睛無法檢測到不同的階段。樣本,除非是高度著色的染料染色,可為顯微鏡,唯一的選擇是顯著減少聚光鏡工作的數值孔徑,通過關閉可變光闌。然而,這種極端的措施將大大削弱物鏡的分辨率。

 

現代顯微鏡的光學係統,能夠生產高清晰度的圖像,在高放大倍率,但沒有足夠的對比度在圖像這樣的能力是毫無價值的。對比度是不是標本的固有特性,但依賴於相互作用的檢體的光耦合到它能夠可靠地記錄的圖像信息用合適的檢測器的光學係統的效率。顯微鏡的光學係統中的圖像對比度的控製是取決於幾個因素,包括正確的設置的開口的隔膜,光學像差的程度,對比度機製,不同的試樣,和檢測器的特性的。除了專門的對比增強配件,有幾個地點顯微鏡,使操作員能夠調整對比度。的光學係統中最關鍵的是該字段和聚光鏡的孔徑光闌設置,但對比度也可以通過改變電子照相機(或傳統的乳膠膜)γ,改變視頻檢測器的放大倍數,在實時圖像處理操作,以及標本染色。

 

因為人眼感知的對象在其圖像產生的對比度,可能會導致一定程度的混亂,除非有先驗知識的光中發生的事件產生圖像中的對比度。圖1示出了一係列的三個在透射光中包含一個透明的,幾乎無色的Zygnema絲狀藻類根據不同的對比度模式的相同的視場模式下拍攝的數字圖像:明場,相襯和微分幹涉對比。三個數字圖像顯得相當不同,顯微鏡,因為這些變化,可能會得出不同的結論從每個視場的獨立審查。

 

1a)中示出的藻類燈絲,在明視場模式下操作,通過顯微鏡成像與聚光鏡光圈縮小尺寸足以使邊緣可見,露出內部的一些細節。雖然綠色葉綠體內的燈絲的肋可以區分,圖像一般患有整體上缺乏對比度。一個相同的相位對比光學捕獲視場的絲狀藻類,在圖1b)。請注意,一係列肋,環狀結構,似乎是兩個組排列的,高對比度的球形形狀顯露是在圖1a)中的葉綠體。在一般情況下,圖像顯示暗區域所包圍的暈,這是一種常見的工件在相襯顯微鏡。施加通過解Sénarmont補償的偏置一個小的程度與使用微分幹涉顯微鏡成像圖1c)中所示的長絲。試樣遮光介紹了在一側而另一邊是明亮,導致的偽三維圖像的感知的圖像中出現黑暗的補償結果。圖1中的每個視場提供了一個不同的標本圖像的解釋稍有不同,它隻能被破譯知識顯微鏡如何創建這些圖像。

 

吸收光(自然地或通過添加合成染料介導的)產生的顏色或不同的試樣的亮度對比度的明視野顯微鏡的製造一直是經典方法。術語“ 對比度是指一個單獨的標本細節的能力來加以區分時相比,背景或其他相鄰功能。效果,對比度定義為檢體圖像的光強度之間和相鄰的背景,相對於整體的背景強度的差異。試樣屬性產生的亮度變化,或顏色的差異,產生的光的吸收,反射,空間變化折射率,散射,衍射,雙折射,熒光和類似的光學現象。在一般情況下,對比度的測量的最高和最低的圖像中的強度之間的關係,可以說是由一個簡單的公式:

Percent Contrast = [(Ib - Is)/Ib] x 100

 

I(b)是背景強度和I(s)是試樣的強度,對比度被調查的功能。從這個等式中,標本的對比,是指圖像中的最高和最低的強度之間的關係,這是顯而易見的。如果試樣的強度(暗)比背景,對比度被稱為為陽性,而比背景亮的標本,顯示負的對比度。當標本修改的光譜分布(顏色)的光通過時,它會產生顏色對比度。這類對比試樣緊密間隔的周期性結構所產生的白色光的幹涉。

specimen contrast figure2

在圖2中示出的曲線圖標本的對比的背景強度的效果。當背景是很暗的灰度值(I(b) = 0.01;紅線),圖像強度的變化小,會產生對比度的大變化。通過減輕的背景有點淺灰色(I(b)等於0.10;綠線),圖像強度的微小變化,提供了一個有用的對比度範圍。在較亮的背景強度(I(b)大於或等於約0.50,藍線),圖像的對比度是相對不敏感的背景強度,並且圖像強度大的變化隻產生小的增加或減少對比度。

 

在大多數情況下,背景和圖像強度的離散值,但在整個視場的變化,從而導致對比度波動。作為一個經驗法則,透明標本明照明模式顯示約2%至5%的對比,而相位和微分幹涉相襯圖像可以有15%和20%之間的對比度水平,隻是略小於固定和染色標本在明觀察到的照明(約25%)。相比暗場和熒光顯微鏡(對比平均水平的60%和75%,分別),相襯和微分幹涉相襯照明生產整體對比度少,但仍然負擔相似程度的決議。

 

振幅和相位標本

在本發明的的光學對比度增強技術,透射明場照明的最常用的觀察模式,在光學顯微鏡,尤其是對於固定,染色標本或其他類型的可見光具有高的自然吸收的樣品之一。總的來說,的標本容易地成像與明照明被稱為振幅對象(或標本),因為照明的波陣麵的振幅或強度降低,當光穿過試樣。

 

然而,對於許多標本在光學顯微鏡,尤其是未染色或有生命的物質,對比是如此之差,試樣仍基本上是不可見的,而不管其目的是解決或明確分開的細節的能力。通常情況下,為這樣的標本,重要的是不改變它們通過殺戮或治療與化學染料或固定劑。這必然導致的顯微鏡實驗了一百多年,在以嚐試提高試樣的可見性,並帶來了更多的細節,而不改變試樣本身的圖像對比度增強技術。這是一個常見的​​做法是減少聚光鏡推薦的大小以下的孔徑光闌,或降低,以增加標本的對比台下聚光。不幸的是,雖然這些演習的確會增加對比,他們也嚴重降低的分辨率和清晰度。

 

在明照明光源(通常是鎢鹵素燈)和聚光鏡的位置,以填補物鏡前孔部分相幹光的波陣麵是相對於顯微鏡光軸對稱。互動的標本的染色區域的波陣麵的幅度在減小,而試樣的衍射產生突出的第一級衍射邊帶,它是180度的相位與通過試樣的光通過。在形成圖像的過程中,在圖像平麵與環繞光波的衍射邊帶幹擾和背景上出現亮點,與吸收結構在試樣表現出各種顏色和灰度級的色調。然而,當未染色樣品的折射率與周圍介質(通常簡稱為環繞),衍射光的波的強度顯著降低。此外,賦予由試樣放出的衍射波陣麵的相位差的相對相位偏移了90度,而不是通常180度,觀察到具有高吸收標本。這兩種效應相結合,嚴重地限製了試樣的可見性。

 

如上所述,改變透射光的強度的試樣稱為振幅試樣,並在顯微鏡可以觀察到其吸收能力或影響的光的波的振幅的平方成正比的光強度,這是作為一個後果。其他顏色自然或人為化學染料染色的標本,也可以清楚地成像在明照明。這些汙漬或自然的顏色吸收的某些部分的白色光通過,其他顏色的透射或反射。通常情況下,汙漬相結合,產生對比的顏色。例如,藍色蘇木素染色粉紅色的曙紅,選擇性汙漬細胞質細胞核往往是結合。它是一種常見的做法是利用標本上的汙漬不容易吸收光線,從而使這種在顯微鏡可見的圖像。

 

與此相反,不吸收光線,而是透明的標本,通過被稱為相位對象(或標本)的波陣麵產生的相位變化。這些標本幾乎是不可見的,圖像非常困難的,因為人眼可見光波之間的相對相移的變化不敏感。此外,眼睛無法檢測到包含電磁輻射的電場矢量的取向的變化,如偏振效應,。相位標本其特征在於以幾種標準,包括它們的形狀(通常為圓形或扁平),內部的光散射元件的密度,厚度,和獨特的化學或電的結構特性(統稱為折射率分組)。厚的樣品可以是相對透明的,僅包含少量的光散射元件,或者它們可能包含許多散射元素沒有光通過,並呈現有效地不透明的透射照明的試樣。這些標本通常被稱為反射光的標本。

specimen contrast figure3

 

相位的變化主要是由於檢體及其周圍介質的厚度和折射率之間的差異。一個典型的例子是活的組織培養細胞,在光照下顯得幾乎是透明的。當通過一個透明的試樣,在不被修改的照明光的波前在明視野顯微鏡,也不是試樣吸收的圖象形成的波。如果試樣是有點失焦,薄薄的灰度陰影所產生的折射光通過目鏡觀察。然而,當被合適地聚焦顯微鏡,一個薄的,透明的標本的圖像消失(試樣具有顯著的厚度繼續觀察由於折射光從眾多的焦平麵沿光或z -軸)。

 

入射照明光的振幅和相位標本上的效果在圖3中。最上麵的正弦波圖中顯示了一個典型的不受幹擾的光波(環繞)不通過標本。通過隻通過試樣安裝介質的原狀光波的振幅和波長(具有折射率n)圖中所示的(圖3a))。當光波輸入染色標本周圍介質具有相同的折射率(在圖3b)所表示的綠色方塊),波遇到汙漬的吸收減少的幅度作為結果,但它們的相對相位保持不變。然而,當光波輸入的標本,其折射率從周圍介質中(圖圖3c))是不同的,振幅不會受到影響,但是,大約90度的相位延遲。在現實中,大多數遇到的標本表現出的振幅和相位的影響(圖3d))的組合,產生的事件和新出現的光波的振幅和相位之間的關係的變化。

 

光程差和相位梯度

所經曆的事件的波前通過透明標本的光程差和相位梯度利用,充分利用幾個流行的對比度增強技術,包括相襯和微分幹涉對比。在大多數情況下,入射波前部穿過試樣,但不通過周圍介質中,或者是稍微超前或滯後,這取決於試樣和介質的折射率之間的差。當考慮差成像明照明,試件的作用,在改變波通過的光路長度(有效的相對相移)的透明的相位標本是非常重要的。

 

觀察在培養容器中或夾在顯微鏡載玻片和蓋玻片之間的相位標本的大部分是相對平坦的,或板狀,如圖4中所示為一個假設的試樣浸漬在均勻介質中。在該圖中,試樣的厚度記為變量t和折射率為n(s)。周圍介質的折射率為n(m) 。入射光波(黃色箭頭)接近的試樣,沐浴在其周圍介質中,從左側的速度決定的折射率和厚度的商品通過。

當光從一種介質到另一種(例如,從成一個細胞的細胞質中的水的營養組織培養基),速度改變兩種介質的折射率之間的差異。因此,當相幹光通過聚焦鏡燈絲發射的波的相位標本的厚度t和折射率n(s),波可以是增加或減少速度。如果試樣的折射率大於周圍介質,波速度降低,而通過試樣,隨後在相對的相位滯後時,從檢體出現。可選地,當周圍介質的折射率超過試樣,波先進的退出時試樣的相。

 

specimen contrast figure4

點亮旅客隻通過試樣經曆的光路(OP)是由該產品的試樣的折射率(n(s) )和試樣的厚度(t)的。以類似的方式,隻能通過遍曆周圍介質的光波出差的光路距離等於乘以由折射率(× n(m))的介質的厚度。之間的檢體及其周圍介質中的光程差(OPD)可以表示為:

Optical Path Difference (OPD) = Δ = (t × ns - t × nm) = t × (ns - nm)

 

緊急檢體和周圍介質中的波陣麵之間的位置的差異被稱為相移δ)和以弧度為單位,可以定義由下麵的公式:

δ=2πΔ/λ

 

其中π是一個常數(3.142),λ是波長的光照射試樣。的光程差是兩個方麵:在折射率(n)的厚度(t)的和之差的商品。在許多情況下的光程差可以是相當大的,即使對象的厚度相當薄。另一方麵,當檢體和周圍介質的折射率是相等的,光程差為零,即使試樣的厚度是非常大的。在這種情況下,通過試樣的光的行進隻是延遲(相位差)相對於周圍介質中的光通過的厚度相等。

 

相襯顯微鏡的設計,以利用檢體和周圍介質中的各種組件之間的相位差。然而,它不是簡單的相位差,這是必要的,而且衍射試樣必須發生的相襯顯微鏡,產生一個合適的圖像。通過比較,微分幹涉對比依賴於相位的梯度,在經典的偽三維圖像的技術被廣泛地稱為否則透明的標本對比度。

 

相位對象的最常見的形狀是一個連續變化的光路或密度,如在圖5中所示的半球狀的試樣。在這個例子中,可以數學近似的相位物體的側麵,通過棱鏡的形狀,如下麵所討論。被指定在圖5中的相位物體的折射率n(s)是周圍介質中,n(m) 。激進的幾何形狀相對象轉換隻發生在邊緣AB(參見圖5a)條)。入射光影響的對象AB的平麵垂直,而平麵波陣麵是平行於AB

 

1(圖5a)中的圓角相位物體的頂點)的邊界基本上平行於入射的波前,而在AB的邊界垂直。2區到4是微型棱鏡的相位對象(圖5b)條)的圓形表麵的切線定義的。棱鏡的角度訂單中的2區域比在區域4,區域4'是相反的。邊緣à 衍射是最強的。

specimen contrast figure5

 

因此,多棱鏡組成的曲麵狀或半球狀的試樣,在試樣的相對兩側有以相反的方向定向的棱鏡。最陡的棱鏡是在赤道上的球形試樣,用最少的斜率,而棱鏡分別位於頂部和底部。這些微型棱鏡組成的光學梯度

OG (Optical Gradient) = Φ α(ns - nm)

中,α是相對於平麵波陣麵的切線的角度。請注意,光學梯度是兩個方麵的商品:角(α)的光通過,雙方之間的折射率差(n(s) - n(m) )。的光通過棱鏡改變方向的角度φ(見圖5c)和圖5d))。方向的變化可以很大,即使斜率或邊界梯度可能是小的,如果大的折射率差。如果是相同的折射率,光波通過透過相位物體unrefracted。離開棱鏡的光的方向依賴於相對差之間的相位物體及其周圍介質中(n(m) ,參見圖5c)和圖5d)) (n(s) 的 折射率的。

 

如上所述,舍入的相位對象不斷變化的光的梯度,並且每個單獨的光學梯度棱鏡中創建了一個不同的角度的光的偏轉。圖5c)示出的偏轉方向時,周圍介質的折射率大於的相位對象(n(m)n(s) ),圖5d)示出的情況正好相反的方向(n(m)<n(s) )。成正比的角度偏轉,φ,的切線角度(α)的折射率之差(n(s) - n(m) ),使得 :

tan φ = tan α (ns - nm)

 

對於小角度

φ α (ns - nm)(弧度)

 

要總結棱鏡的效果的光學梯度的邊界,當相位物體的折射率超過周圍介質,然後在每個斜坡的梯度的大小相等的對象在相同的角度偏轉。此偏轉角依賴於相對折射率差和幾何切線角度(α)。當介質的折射率(n(m) )是大於對象(n(s) )的折射率時,偏轉相反時,情況正好相反。當沒有梯度,不存在光通過偏轉。

 

的邊緣梯度,以及檢體的厚度,無論樣品是否大致分類為振幅或相位,影響通過的光的波陣麵的折射和衍射角。散射光的隻有一小部分在此被捕獲的物鏡,是一個因素,取決於數值孔徑。剩餘的散射光,這是不收集,表示標本信息丟失所產生的影像。客觀的後側焦點麵上的孔徑模仿為衍射光,必須集中在中間像平麵進行幹擾和形成圖像的低通濾波器(影響大試樣的詳細信息)。因為圓潤光滑的表麵相標本相對較少或沒有衍射網站,他們遭受重大缺乏對比成像時無需的輔助對比度增強光學元件的利益。

 

照度的一致性

當考慮光的方法,以提高標本的對比,它是有用的,考慮檢體的各種特性,可以被操縱來創建的強度變化,這將導致使試樣可見。一個主要的問題是將被改造成的對象有哪些特點了一套獨特的情況下的強度差異。

 

分試樣的細節和具有的尺寸近似的成像光的波長衍射或散射光的邊緣,提供有一個試樣及其周圍介質之間的折射率差。折射率,光線通過空氣或除以光速的速度通過​​真空對象的速度比經典定義。通過任何材料,因為光的速度是小於光在真空中的速度,折光率始終超過值1.0用顯微鏡標本。為了解決小對象之間的距離,並重現其形狀與合理的保真度,必須被捕獲的大角度的衍射光顯微鏡物鏡。

 

物鏡收集衍射光(或背離)必須納入清晰的聚焦在圖像平麵,以產生標本細節。在圖像平麵中,包含的衍射光的光波進行與未衍射的光,通過和試樣周圍的幹擾。幹擾所產生的圖像的質量高度依賴於相幹光照射試樣,並顯著改善圖像質量一般通過增加的連貫性。在光學顯微鏡下,部分聚光鏡孔徑光闌開口尺寸控製在試樣上入射的光的空間相幹性。減小光圈大小產生一個更大的空間相幹性。

 

照明光波至少是部分相幹的試樣在圖像形成的衍射和幹涉的作用是至關重要的,需要在各種形式的幹涉光學顯微鏡,包括相位相反,微分幹涉相差(DIC),和偏光。實際上,光波通過試樣(環繞或不偏離)和試樣的衍射產生相互連貫的字符程度,必須加以保護,使整個顯微鏡的光學列車和相消幹涉,發生在圖像平麵。

specimen contrast figure6

 

如白熾燈的鎢鹵素型光學顯微鏡中常用的,是有顯著數量的同相振動的波陣麵在燈絲上的原產地從他們的角度的部分相幹光源。通過熱燈絲產生的合奏,因為每個光子振動若幹彼此同相,在一個給定的波陣麵內的實際的相幹度僅僅是局部的。此外,浪表現出很強的一致性也是有限的距離隻有幾十波長。其結果是,光波長程的振幅會表現出交替的高和低的狀態,波振動相幹(同相)和瞬時滿分彼此同相,分別。長絲和弧光燈的情況可以比較受激發射的激光源,這是連貫的長距離(成千上萬甚至上百萬的波長),完全語無倫次的熒光發射產生的熒光標記標本。

 

連貫性的起源是來自於一個事實,即原子內的微觀領域中的燈絲強烈互相影響時,它們被激發光子發射點。這些短程效應導致局部同步發射發生在離散捆在整個長絲表麵。其結果是,一種含鎢的鹵化物的白熾燈,或電離的等離子體電弧放電的汞的燃燒器的熱絲,可以描述為獨立發出光的協調突發微型原子的街區的合奏。個人沿著單一方位由燈絲產生的相幹波前被稱為光射線或鉛筆。科勒照明,聚光透鏡(定位後的燈管外殼,但在此之前在顯微鏡視場光闌,光學路徑)形成在台下聚光的前焦麵(光圈)的燈絲的圖像。該孔隨後變成部分相幹波陣麵,用來照亮物體麵中,如在圖6中示出試樣的來源。

 

對於一個給定的光波入射在試樣上(參看圖6)中,存在相幹關係之間的衍射和非衍射的波陣麵(零階)通過試樣。保持這種關係之間的試樣和圖像平麵,光波重組互相幹擾。在那個位置,相幹波夥伴語無倫次與其他波陣麵產生的最終圖像。這個重要的概念的基礎的光學顯微鏡的許多形式,但相位和微分幹涉對比技術是特別重要的,因為通過和相消幹涉的圖像形成要求的照明的至少是部分相幹的。換言之,必須存在一個明確的相位關係之間的環繞聲和衍射的光波,標本和圖像平麵之間的這種關係必須保留。

 

顯微鏡長期依賴,降低聚光鏡光圈開孔尺寸顆粒和邊緣相標本,以提高知名度。振幅對象的對比度,也可以提高由聚光鏡孔徑適當地調整。小物件,邊和粒子將衍射光,無論他們是否屬於振幅或相位標本。的衍射光的隻有一小部分在此被捕獲的物鏡(由於數值孔徑的限製),而其餘沒有收集的衍射光表示的圖像信息丟失。聚光鏡光圈開孔尺寸正確的設置是增強的標本圖像對比度和引進衍射文物之間的權衡。後者表現的分辨率損失,衍射環的疊加,以及從在試樣中所沒有的共同焦點區域的其它不希望的光學效果。隨著接近衍射極限,圖像對比度被泄露的對象的詳細信息變得越來越小,空間頻率變高。

 

在光學顯微鏡下,來自作為照明光的波陣麵和被檢體之間的相互作用的結果的對比,如何處理離開標本的光,但並不是一個特定試樣的固有屬性。此外,顯著影響調製傳遞函數(MTF)和對比度產生模式的顯微鏡標本的對比。調製傳遞函數是顯微鏡的能力,從檢體的信息傳輸到圖像的定量指標。在一般情況下,圖像的對比度降低的試樣結構具有較高的空間頻率(更細的和更緊密地間隔開的細節),無論顯微鏡的對比度機製或調製傳遞函數的。

 

結論

光能夠通過多種機製來生成圖像的對比度與樣品相互作用。這些包括反射的表麵,吸收,折射,偏振,熒光,和衍射。顯微鏡的光學元件和照明模式的物理改性,以及最終的圖像通過照相或數字電子技術的操縱,也可以增加對比度。下麵的討論突出各種檢體和光之間的相互作用,並審查了一些(見表1)的光學顯微鏡技術已被開發,以提高標本的對比。表1總結的對比度增強技術(次)給出一個標本和各種材料,研究了同時發射和反射的光鏡。此表可作為一個粗略的指南,在光學顯微鏡接近具體的成像問題。

 

人類的眼睛是非常敏感的檢體的振幅和波長中的差異。出於這個原因,許多標本切成非常薄的部分(範圍從130微米的厚度),化學染料染色,可以提高對比度,來區分居住於試樣的結構。此技術已相當普遍用了幾百年的生物標本。染料的選擇性吸收光從一個或幾個波長,並通過或反映其他所有波長。一個例子是吸收所有的可見光波長的藍色染料,藍色,反射和透過樣品的異常。的生物試樣的內部結構元件往往是染色用的染料,選擇性地染色這些元素的混合物,對材料是透明的或染色的,不同的顏色的背景下進行的,增大對比度。

 

這些技術也適用於熒光染料,可用於增加對比度標本中具有高度特異性。由一個或幾個波長的可見光或近紫外光激發熒光標本時,他們經常發出較長波長的光,從而成為可見的,或對比,相對於其他對象在外地或在黑暗的背景。

 

對比度增強技術,光學顯微鏡

標本類型

成像技術

透光

透明標本
相對象
細菌,精子,
在玻璃容器中的細胞,
原生動物,蟎,纖維等。

相襯
微分幹涉對比(DIC)的
霍夫曼調製對比度
斜照明

光散射物體
矽藻,纖維,毛發,
淡水微生物,
放射蟲等。

萊因伯格照明
暗場照明
相襯和DIC

光折射標本
膠體懸浮液
粉和礦物質的
液體

相對比度
色散染色
DIC

振幅標本
染色組織
天然彩棉標本
頭發和纖維的
昆蟲和海洋藻類

明照明

熒光標本
細胞組織培養中
熒光染色
塗片和價差

熒光照明


熔化和再結晶雙折射標本礦物薄切片
液晶
化學品
頭發和纖維
骨骼和羽毛

偏光照明

反射光

鏡麵(反射)表麵
薄膜,鏡子
金相試樣拋光
集成電路

明照明
相襯,DIC 
暗場照明

(非漫反射)表麵
薄和厚的薄膜
岩石和礦物
的毛發,纖維,骨
昆蟲

明照明
相襯,DIC 
暗場照明

振幅表麵特征
染色纖維
彌漫金屬試樣
複合材料
聚合物

明照明
暗場照明

雙折射標本
礦物薄切片
毛發和纖維
的骨頭和羽毛
單晶
取向膜

偏光照明

熒光樣品
騎警細胞
熒光染色
塗片和價差

熒光照明

1

 

染色標本的對比度增加的早期,但仍目前采用的方法,采用的色彩對比過濾器,雷登漆​​明膠平方(柯達),或在光路中的幹涉濾光片。例如,如果有一個紅色的染色染色的標本,綠色濾色器將變暗紅色區域,從而增加對比度。另一方麵,綠色濾色器將減輕任何綠色的染色麵積。彩色濾光片是非常有價值的輔助標本的對比,尤其是黑色和白色的顯微攝影時是AG亚游集团的物鏡。綠色過濾器是特別有價值的應用與消色差透鏡物鏡,這是球校正綠燈。此外,在相襯物鏡內部的相位板的設計,以延遲或提前特定波長,通常在550納米附近的(綠光)。

 

活標本和其他相對象,這往往產生不良的圖像查看時,在明照明,清晰可見的光,而不是化學意味著霍夫曼調製相襯,對比度和微分幹涉對比照明下觀察時。這些技術需要特殊的光學元件,顯微鏡,但通常會產生足夠的對比度的圖像,以顯示試樣的結構有關的重要細節。

 

對比度改進的另一個簡單的技術,涉及到選擇的安裝介質,其折射率基本上不同試樣。例如,矽藻可被安裝在各種對比增強介質,如空氣或商業介質蘇合香。的折射率差提高對比度這些無色的樣本,並呈現其輪廓和標記更加明顯。

 

各向異性材料通常表現出兩個或兩個以上的折射率,因此被稱為雙折射,或雙重折射。其中包括在這一類的標本,礦物晶體(表現出高度的結構對稱),纖維,毛發,及廣泛的其他生物標本。當光進入光纖(光學軸的軸線以外)非軸的各向異性晶體,它被折射成兩條射線偏振光其振動方向彼此成直角定向,並以不同的速度。由此產生的光波的偏振,並能幹擾顯微鏡分析儀中複合時產生雙折射的試樣是高度著色的,含有顯著量的造影圖像。

 

當入射的光線照射不透明的表麵,它被反映在具體的方式是該表麵的地形。非常光滑的表麵反射光線相等,這種機製被稱為鏡麵反射的入射光的角度。表麵不均勻或彌漫性往往反映在所有可能的角度通過漫反射進入客觀的光量減少,導致這種現象稱為光。對比度在反射光顯微鏡,可以提高通過仔細試樣的製備。金相樣品往往顯示出晶粒邊界和/或拋光處理,以增加反射的光量進入顯微鏡的反應性液體和氣體腐蝕。汙漬,熒光染料,薄膜,金屬塗層的形式,也可用於引入反射光顯微鏡標本的對比度。可以成像雙折射標本,使用偏振反射光相和透明的對象通常使用的技術,如反射微分幹涉對比度,暗場照明,和Hoffman調製對比度觀察的主題。

 

無論顯微鏡技術產生標本的對比,的三個基本參數,以控製圖像質量的分辨率,放大倍率,和對比度。在顯微鏡的主要功能是增加大小和解決分鍾試樣的詳細信息,但必須完成這一行為與足夠的對比度,以使檢測器(或傳統數字相機或人眼)可見試樣。



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