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尼康顯微鏡:相差顯微鏡的構造

2013-10-16  發布者:admin 

相差光學元件可以被添加到任意明視野顯微鏡,提供專門的階段物鏡符合管長度參數,和聚光鏡將接受正確的尺寸的環形相環。各大廠商都提供了他們的研究和教學水平的顯微鏡,在直立和倒置(組織培養)配置相差配件。

phase configuration figure1

典型相差的組件可用於直立尼康顯微鏡從Eclipse係列研究都說明在圖1中,雖然類似的配件也由其他廠商生產。圖1中的聚光鏡是一種通用的係統設計的應用利用了廣泛的放大倍數(2倍和100倍之間),配件數對比增強技術,包括微分幹涉相差(DIC),暗場和相差。包含內部相差板的物鏡是提供與各種光學矯正因素,範圍從簡單的消色差透鏡和平場複消色差的。此外,相差環板有幾個層次環繞眼波衰減產生不同程度的對比度和背景強度。正麵和負麵的階段物鏡也產生了眾多的廠家。

 

以便使聚光鏡的環形帶與物鏡的後焦平麵,相差望遠鏡(圖1中所示),可以采用插入一體的顯微鏡目鏡觀察筒的相差板。一個完整的階段附件套件範圍的成本從幾百到幾千元不等,這取決於物鏡的修正係數,複雜性和台下聚光光學校正,以及是否相差望遠鏡。以下各節更詳細地描述了這些組件,並提出了指導相差顯微鏡的配置和調整。

 

聚光鏡纖維環設計

相差輪(多個年輪環,是拉丁詞)台下聚光利用一個堂堂正正的顯微鏡,或聚光鏡內的炮塔倒置顯微鏡的照明支柱,必須具體到一個特定的匹配配備一個相應的相差板的物鏡。例如,將需要20倍的物鏡100x物鏡,它們都包含附近的衍射麵(後側焦點麵)的相差板,聚光鏡的環形通道內具有不同的直徑,對應的物鏡放大倍率和數值孔徑。匹配的聚光鏡物鏡相差環板,顯微鏡可以對齊疊加的物鏡階段環環上通過實現相差照明的照明光。

 

相差顯微鏡流行的萬能聚光鏡係統的設計的大部分都配有3個或多個可移動的環形隔膜,這是可用於與4倍,10倍,20倍,40倍,60倍,100倍的物鏡含有適當的相差板。PH1(或同等學曆)聚光鏡環,其中包含最小光圈,設計要采用低暗場功耗的10倍和20倍的物鏡。中間倍率物鏡(40X60X)利用PH2環,而最高權力(和數值孔徑)100倍的物鏡要求的PH3環的,其中包含的最大光圈。一個專門的聚光鏡的環形帶(PHL)是利用與低暗場倍率的物鏡4倍和5倍)時從光學路徑或設計為倒置的組織培養顯微鏡的長工作距離聚光鏡除去聚光鏡擺動透鏡。

phase configuration figure2

聚光鏡的環形帶刀片具有一個衝壓環的中心具有不同的尺寸(圖1和圖2中示出)的圓形鋁板。衝壓操作後,環形盤單位陽極氧化處理及染色,用一台黑色的色素吸收雜散光,確保照明光線穿過纖維環按照定義的途徑。被定位在板的中心的中心光停止,而異的大小取決於物鏡物鏡光圈和放大倍率範圍,由三個細長的選項卡,以120度的間隔隔開固定。環形板被按下,或者粘到圓形框架(也可陽極氧化處理和染成黑色的),它被裝配成圓形的開口部中的聚光器轉盤。

 

現代萬能聚光鏡係統的炮塔(見圖2)通常包含五至八個開放的插槽位置,可以配備環形相差板,DIC諾馬斯基的(沃拉斯頓)棱鏡板,或暗場光站牌。這些板的基本結構是相似的。暗視野照明停止製造的類似的方式逐步環形隔膜,但該環形帶一般是寬,並具有較大的直徑,以使高度斜射光的波前通過。與此相反,DIC棱鏡切成粘到陽極化的幀,插入到轉塔的圓形板。

 

相差聚光鏡的環形隔膜板被插入到適當的位置在炮塔和彈簧夾固定到位,炮塔開口的外圍內的遊樂設施。從彈簧夾的張力迫使環形帶的調節螺釘(螺紋銷)為中心的環形空間中的光學路徑(圖3中所示)使用的一組板對。一些製造商提供聚光鏡係統專為相差,具有不可分割的環中心係統。這些聚光鏡通常有一組可以通過按壓每個旋鈕的軸的致動,直到其鎖定到一個環形帶調節螺釘的調節旋鈕。後螺釘齧合時,扭動旋鈕使操作者相對於的物鏡相差板的中心聚光鏡的環形帶。

phase configuration figure3

每當一個普遍的顯微鏡聚光鏡用於相差觀察,操作人員應是若幹研究的孔徑光闌調節杆的位置,以確保膜片的開度較大比聚光纖維環的直徑。事實上,這是一個好主意,要始終打開隔膜相差期間觀測到最寬位置。一些製造商提供專為相差的聚光鏡,其中有一個彈簧加載的機製時自動打開聚光鏡孔徑光闌相環旋轉到光學通路,但禁用此功能相同聚光鏡明場觀察。相差實驗結束後,可以返回顯微鏡明視場模式下,根據本發明的物鏡的數值孔徑調節聚光鏡可變光闌開口。

 

可在很寬的頻譜範圍從基本的阿貝設計(無色差和球麵像差校正)高度糾正齊明消色差係統,配備了性能優良的光學校正水平,相差聚光鏡。此外,專門的相差聚光鏡可具有較長的工作距離(LWD)的光學元件,為直立和倒置顯微鏡,以允許成像厚血管中的試樣。許多研究級倒置顯微鏡組織培養具有超長工作距離(ELWD聚光鏡相年輪非常大的容器中,使觀察活細胞。

 

相差配件的規格可以從一個製造商的另一個顯著變化,也沒有公認的標準相環形隔膜(和物鏡相差環板)為數值孔徑或放大尺寸。其結果是,從一個顯微鏡製造商的相差物鏡不能通常被耦合到從另一個(反之亦然)的相差聚光鏡

 

單環相聚光鏡是非常普遍的,在同一時間,但已在很大程度上取代了萬能回轉頭模型。老聚光鏡需要刪除和插入不同階段年輪為物鏡改變時,繁瑣和費時的任務,往往必須重複檢查細標本細節時經常在幾個倍率。中心定位在一個單一的環形帶聚光鏡的環形光闌類似的方式完成的,新的,普遍聚光鏡。對葉或螺旋彈簧單元聚光鏡內的住房,無論是平刃或艾倫型的螺紋銷或螺絲是用來按環板。

 

為了適應標準的阿貝,消色力,或齊明台下聚光相差觀測,必須建立一種機製,放置或非常靠近聚光鏡前焦距(光圈)麵的環形隔膜。幾種聚光鏡模型製作的孔徑可變光闌(總是位於焦平麵)定位在所述聚光鏡的基礎上,相鄰的槽設計為能接受的相差差板或暗視野照明停止。其他的聚光鏡設在殼體的中央區域,這是相對不可訪問的輔助元件,例如作為相差環形帶的開口麵。

 

相差物鏡

相差顯微鏡的設計物鏡的最重要的屬性是一個專門的相差位於或非常接近的衍射或後側焦點麵的存在下。物鏡之間是不可互換的相差差板,並經常永久蝕刻成的內部透鏡元件之一。蝕刻環上塗有金屬膜的局部吸收,降低暗場了光透射,並且通常是由,使得相差光通過一個四分之一波長的相對於光透過玻璃的其餘部分將向前。

phase configuration figure4

4中所示的一個典型的相差物鏡甲切去圖。插圖示出的相差板,被定位在後側焦點麵上。其他部分的物鏡是相同的,包括內部鏡頭​​元件,建設標準的明視場顯微鏡物鏡。校正因素,包括平場消色差,平場消色差,熒光,複消色差相差物鏡的範圍可以從各大廠商幾乎涵蓋了完整的域。這些物鏡也可與蓋玻片校正套環(幹燥的高數值孔徑物鏡)和用於浸漬技術在水,甘油,油。此外,相差物鏡生產的,在不同的中性密度和相差差值的相差差板,在正麵和負麵的相差模式以產生一個廣泛的對比度水平。

尼康和其他製造商生產的各種相差物鏡(見圖5),不同的符號(正或負),範圍從相對較低暗場的對比度非常高。正相差,最常見的形式,出現暗光密的部分薄試樣的背景下,具有更輕的灰色陰影。負相差標本呈現明亮,但疊加在一個黑暗的背景,類似暗場照明。

 

如圖5所示的數字圖像記錄,可使用目前的尼康的相差物鏡證明,得到的對比度變化,,由差板中性密度變化和環繞的波前相差差(或提高)水平的比較。圖像從一個固定和安裝準備的Zygnema絲狀藻類是相同的視場。圖5a),圖5b)和5(三)比較暗低暗場低暗場,變跡暗相差物鏡DLLDLADL,),產生類似程度相對較輕對比灰色的背景。黑暗和光明的介質尼康相差物鏡(圖5d)和5E))表現出積極和消極的一個中型的灰色背景相差。個別尼康相差物鏡的性質在下麵討論。

phase configuration figure5

相差物鏡由各種類型的標本的對比得到的程度是複雜的事實,大的波動的折射率和厚度可以製作試樣區域內的對比度反轉和顯著的光散射相差的焦平麵。應用於移的相差板(環繞的光的波前衰減)和相差特性(延遲或提前環繞的波陣麵)的相差板在相差顯微鏡觀察的結果有很大的影響的吸收材料的密度。下麵列出了幾個重要的特點,Nikon製造的各種階段的對比度物鏡

 

DL低暗-中等對比度) - DL物鏡產生較暗的圖像輪廓淺灰色的背景,是典型的用於各種用途相差觀察的物鏡。這些物鏡是提供最強在具有主要從周圍介質的折射率差的試樣的暗的對比度。DL相差物鏡檢查細胞和其他半透明的生活材料,是最流行的款式,尤其適合於顯微攝影和數字成像。

 

DLL低低-對比度) -類似設計DL物鏡的,該DLL係列明照明產生更好的圖像,往往是作為一個“通用”的物鏡,在顯微鏡係統,利用多種照明模式,如熒光,DIC ,明場,暗場。“DLL相差物鏡產生對比度較低暗場DL物鏡,但擁有更高的光傳輸值,光學矯正,比標準DL對應的數值孔徑的。大部分由製造商提供的DLL相差物鏡有螢石或複消色差的像差校正水平。

 

ADL(變跡的暗色-中等對比度) -尼康最近推出的變跡相差ADL物鏡包含了二次中性密度環環相差環板中央的兩邊。此外次級環有助於減少不必要的“鹵素”常與成像的大顆粒或在相差顯微鏡的試樣的功能(如細胞核,整個細胞和纖維)的影響。變跡的物鏡是在平場消色差透鏡光學校正和功能類似的到DL物鏡係列的對比度水平。

 

DM(中暗-高對比度) - DM物鏡產生一個中型的灰色背景上的暗圖像輪廓。這些物鏡被設計成用於有標本的具有小的相移或細纖維,鞭毛,纖毛,顆粒劑,和非常小的顆粒的折射率的差異,如高的圖像的對比度。通常僅限於高倍率物鏡具有大數值孔徑(螢石和複消色差的),DM相差物鏡執行非常薄的樣品,但厚標本成像時,經常表現出逆轉的對比。

 

BM(中亮-負對比度 -通常被稱為負相差,BM物鏡一個中型的灰色背景上產生明亮的圖像輪廓。BM物鏡是理想的細菌鞭毛,纖維蛋白束,分球,以及血液細胞計數的目視檢查。

 

為了使顯微鏡技術能夠快速識別相差物鏡,許多製造商題重要的規範,例如倍率,數值孔徑,管長校正等,在綠色字母上的外筒。綠色的字母數字顏色代碼用於區分普通明場,偏光,DIC和熒光的物鏡,或者使用另一種顏色的代碼或標準的黑色字體相差物鏡。此外,相差物鏡有銘文桶指示的物鏡是專為相差匹配環指定。表1中所述的一些最常遇到的物鏡每桶版畫。相差的物鏡,也可以很容易地識別持有物鏡明亮的光線透過玻璃窺視觀察中央位置的黑暗階段環。

 

相差物鏡稱號

縮寫

類型

Phase, PHACO, PC

相差

Ph 1, 2, 3,

相差聚光鏡123,等

DLLDLDMADL

低暗低低暗,中暗,變跡低暗
(變跡正相差)

PLPLLPMPH

正,低低正,
正中等的,正高對比度
(正相差對比)

NLNMBMNH

負,中負,
中亮
(負相差)

1

 

6給出了一個典型的係列相差物鏡具有增加的數值孔徑和放大倍率。作為一般規則,當物鏡的數值孔徑和放大倍率增加時,相差板的寬度和直徑都下降(和聚光鏡的環形帶的尺寸的增大)。此外,如圖6中所示剖切表示正和負的相差板的施工背後的基本概念。正相差板產生暗的對比度而包含部分吸收膜的設計,以減少環繞波陣麵的振幅。此外,該板包含設計轉向90度(延緩)的衍射光的相差相阻燃材料。負相差板還包含兩個相阻燃,部分吸收材料。然而,在這種情況下,兩種材料被放置於圓形的相差環,使未衍射環繞的波陣麵成為受影響的唯一的物種,衰減和相差滯後90度。

phase configuration figure6

對比度是調製的相差物鏡通過不同的相差板的屬性,包括金屬膜(防反射塗層),相阻燃材料的折射率,和的相差板的厚度的吸收。大多數製造商提供的相差差板是通過真空蒸鍍法,在玻璃板上或直接到一個顯微鏡物鏡的透鏡內表麵的薄的介電和金屬膜。電介質膜的作用是把光的相差,而金屬膜未衍射的光強度衰減。一些製造商利用多個抗反射塗層與薄膜結合,以減少眩光量和光學係統的雜散光反射回。如果相差板的透鏡的表麵上不形成,它通常位於附近的物鏡衍射平麵的連續鏡頭之間的膠結。的厚度和折射率的電介質,金屬,和防反射膜以及水泥的光學,精心選擇的,產生所需的相移的相差之間的互補(衍射)和共軛的區域(環繞)板塊。在光學術語,改變環繞的光的相差相對於衍射光的相差90度(或正或負)被稱為四分之一波長板,因為它們的光程差的影響。

 

相差望遠鏡

如果聚光鏡的環形帶,位於台下聚光的前焦麵,沒有確切固定的相差對準在物鏡板(即位於中央位置沿顯微鏡光軸),相差對比光學係統所提供的對比效果將極大地損害。為了確保正確的顯微鏡操作,並最大限度地相差效果,物鏡的後側焦點麵應與聚光鏡的環形帶在這裏進行檢查,以確保正確對準顯微鏡。這個任務可以通過使用相差望遠鏡,它可以插入到一個目鏡觀察管(代替一個正常的目鏡),或顯微鏡,雙目或三目鏡筒組件內置到一個勃氏鏡

phase configuration figure7

相差望遠鏡,通常也稱為作為輔助望遠鏡顯微鏡輔助,包括一個簡單的兩個或三個透鏡望遠鏡(圖7中示出)布置成充當一個微型光學係統之間的中間物鏡和目鏡的組合望遠鏡和顯微鏡。相差望遠鏡的焦距範圍從約150毫米到200毫米,使移動設備以集中在物鏡上的後側焦點麵,當插入的顯微鏡目鏡觀察筒。物鏡的焦平麵的放大圖,清楚地揭示了聚光鏡之間的環空和物鏡相環被合適地聚焦時的相差望遠鏡的空間排列。在檢視固定的相差環在物鏡上,操作者就可以執行到聚光鏡的環形帶的位置調整對準兩個相差觀察(參見圖8)。

 

設計主要是為了在偏振光下觀察或微分幹涉相差顯微鏡往往有伯特蘭透鏡目鏡觀察管單元或目鏡管和顯微鏡體之間插入一個中間管被納入。勃氏鏡是較為複雜的比簡單的相差望遠鏡,和作為中繼透鏡,傳輸到顯微鏡中間圖像平麵位於目鏡孔徑光闌的物鏡的焦平麵的圖像。因此,物鏡的後焦平麵(和相差/聚光鏡的環形帶對應)的勃氏鏡與顯微鏡光學路徑插入,可以通過顯微鏡目鏡觀察。在大多數顯微鏡配備有伯特蘭透鏡,透鏡的光學通路的流入和流出旋轉,通過目鏡管下方的一個小的指輪機構。後來模型顯微鏡往往伯特蘭透鏡安裝在炮塔一起改變圖像的放大倍率的鏡頭。是用一個小旋鈕,伯特蘭透鏡的位置,以及0或其他一些放大倍率鏡頭標記的pH調整。

 

相差望遠鏡和Bertrand鏡頭必須配備了一種機製,調整焦距,因為物鏡的後側焦點麵的位置可以隨放大倍數(以及一些其他因素),並在於在不同的高度,在顯微鏡內。對焦的典型相差望遠鏡隻需通過加撚眼管(參見圖7),直到物鏡的後側焦點麵,重點突出。以類似的方式,的的大多數現代顯微鏡的透鏡特朗配備的聚焦指輪,在物鏡上的相差板,使操作員能夠集中伯特蘭透鏡目鏡組合。利用匹配的物鏡集(齊焦,具有相同的光學矯正及管長的)時,應保持的後焦平麵位置基本上是相同倍率發生變化,從而減少了必須重新調整相差望遠鏡或勃氏鏡。

 

相差顯微鏡對準

在試圖對準顯微鏡相差觀察,仔細檢查儀器,以確保所有的物鏡包含相差板,並牢牢地固定在物鏡轉換器。物鏡也應該在它們的排列順序排列的物鏡轉換器上,從低暗場到高的放大倍率,以盡量減少一個聚光鏡之間的環形空間和其他的切換頻率。通常情況下,10倍和20倍的物鏡,都有一個共同的聚光鏡環,40倍和60倍的物鏡。高度校正的物鏡,如浸油設計的複消色差,往往有相似的數值孔徑,並在更寬的範圍內的放大倍數(40倍到100倍),利用相同的聚光鏡的環形帶。低暗場功耗相差對比(4倍和5倍),通常需要擺動鏡頭聚光鏡和一個專門的聚光鏡環。

phase configuration figure8

聚光鏡的環形板也應被順序地排列,從較低暗場倍物鏡設計用於與環形出發設計了一個以最高的放大率。在一般情況下,在整個放大倍率範圍可覆蓋三個或四個獨立的環形通道內。如果一個普遍的聚光鏡,最低暗場放大倍率的環形帶(例如,PHLPh1染色體)到明視野插槽的右側,相鄰的插槽中的其他板按順序定位。通常情況下,試樣必須在明檢查之前或之後相差觀察,所以這個安排將提供一個容易的工作流程。

 

如圖8所示的物鏡的未對準(圖8a)和圖8c))的後側焦點麵的圖片,和聚光鏡的環形帶和相差環後已被正確地對準(圖8e))。在該圖中還示出了通過目鏡觀察(圖8b),圖8d)和8f)條),這表明顯微鏡試樣時出現錯位(圖8中觀察時,出現在相應的圖像( b)和圖8d)),並小心地對準(圖8f)條)按程序概述如下。

 

建議采取以下步驟相差顯微鏡對準。

 

在舞台上放置明亮的染色標本和旋轉10X相差物鏡的光學通路在明照明模式。聚焦樣本,並關閉視場光闌,直到它進入視場邊緣。使用聚光鏡高度調節旋鈕,倉台下聚光,所以個人的視場光闌葉片處於銳聚焦內,使用主聚光鏡中心調整旋鈕,以確保視場光闌,在視場的中心。仔細檢討顯微鏡配置,以確保科勒照明已經實現,並且標本是大家關注的焦點。

 

取出染色標本和標本在顯微鏡舞台上放置一個階段。物鏡試樣的情況下,僅具有最小的光程差(和可能是困難的可視化),對準顯微鏡相差模式中,已知會產生高對比度的標本。聚光器轉盤旋轉,直到被定位在相應的環形帶的光學路徑(PH1或相當於10倍的物鏡)。檢查以確保聚光鏡環顏色代碼或題字相匹配的物鏡。檢查聚光鏡光圈撥杆的位置,將它移動到最廣泛的光圈位置(聚光鏡設計相差可以這樣做,自動)。

 

如果在顯微鏡配備有勃氏鏡,使用指輪控製擺動透鏡到位。另外,刪除一個顯微鏡目鏡插入一個階段望遠鏡觀察筒。

 

雖然通過目鏡或相望遠鏡窺視,調整伯特蘭透鏡的焦點或望遠鏡焦點眼管,直到在物鏡上形成了鮮明的重點相差環板,明亮的圖像之間的重疊的聚光鏡環和深色中性密度材料的相差板是顯而易見的。在許多情況下,在顯微鏡將初始對準和環形帶的圖像,因此無法準確地疊加在相差板的中性密度材料(如在圖1中(a)和圖1c)所示)。

找到聚光鏡環形定心銷(或螺釘),該環形帶的位置調整用螺絲刀或一對相應的旋鈕,直到它是重合的物鏡相差板(圖1(五))。注意:不要試圖定心旋鈕(通常位於聚光鏡上的安裝支架連接到顯微鏡)與主聚光鏡聚光鏡的環形帶的位置調整。這方麵的努力將可能不會達到預期的聚光鏡環對齊,肯定會危及的科勒照明條件,先前應該已經成立。

 

聚光鏡的環形帶的中心,所述環的光通過聚光鏡將中性密度材料施加到的物鏡相差板,減少纖維環圖像的強度衰減。因此,如果中心不當聚光鏡的環形帶,一個明亮的月牙邊緣將出現在的物鏡相差板(圖1a)和圖1c))的中性密度材料相鄰。如果圖像不符合環內的暗圈相差環板,那麽無論是聚光鏡物鏡不集中焦點(科勒照明是不成立的),或相望遠鏡(或伯特蘭透鏡)後焦平麵。在某些情況下,即使當相望遠鏡(或伯特蘭透鏡)和台下聚光正確對焦,聚光鏡環圖像模糊和出現的焦點。這可能是由於從試樣的低暗場頻衍射。如果發生這種情況,從舞台取出試樣,並進行顯微鏡對準。

 

如果聚光鏡的環形帶的圖像顯著不同的物鏡相差板的尺寸,檢查以查看是否錯誤的環形帶板已安裝在所述聚光鏡(最可能的原因)。另一種可能性,如果高數值孔徑的油浸物鏡聚光鏡前鏡頭元件的設計是浸漬。在這種情況下,它可能是困難的(或不可能)疊加到聚光鏡上的相差板的環形空間之間的聚光透鏡的顯微鏡載片上(和/或物鏡和蓋玻片之間的)沒有一滴油。

 

聚光鏡環和物鏡相差環板是在正確對齊,圖1e)所示的圖像應該出現在相望遠鏡目鏡與伯特蘭透鏡到位。在這一點上,在顯微鏡相差照明試樣的觀察而正確的配置。

更換相望遠鏡的目鏡,或旋轉伯特蘭透鏡的光學通路,檢查標本。應顯示的背景顏色的中性灰色(根據物鏡相差板的中性密度)與試樣中可見高對比度。

 

一旦相差顯微鏡已對齊,它一般會保持其中心定位有相當數量的物鏡/年輪的變化,但應定期檢查,以確保正確對齊。如果在顯微鏡開始偏離了對齊出現在目鏡(或在計算機顯示器上),圖像會出現越來越多像那些觀察明照明。

 

顯微鏡製造商提供了一個綠色的幹涉或吸收濾波器與其輔助相差包,因為濾波器會產生用於原始校準的物鏡相差差板具有相同波長的單色光。其結果是,對比度提高,當過濾器被插入到光學路徑(通常是在照明聚光透鏡和視場光闌)。的大多數商業的相差差板的物鏡是產生一個四分之一波長的相移在可見光光譜的綠色(550納米)的部分。從理論上說,如果利用白光,而不是單色光,幹擾滅絕不會是完整的所有顏色,對比度將受到影響。這個限製就顯得尤為重要,如果消色差透鏡的物鏡,這是糾正色差,隻能在綠色區域,用於相差觀察或記錄圖像。然而,隨著目前的高度校正的螢石和複消色差的物鏡,對比度的區別通常是可以忽略不計,因此,無關緊要的。

 

用相差照明成像成功的關鍵是正確地對準的顯微鏡,並確保足夠薄的試樣在顯微鏡載片上的安裝介質內均勻地分布。經常遭受非常厚的標本圖像的對焦模糊和難以解釋的對比反轉工件,可以。如果在相當長的一段時間內利用顯微鏡,偶爾檢查物鏡的後側焦點麵,在物鏡驗證聚光鏡的環形帶的對應的相差板。



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