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貨真價實 坦誠無欺
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尼康顯微鏡:維持活細胞顯微鏡載物台上

2013-10-16  發布者:admin 

越來越多的調查,使用活細胞成像技術的基本性質,細胞和組織的功能,特別是由於目前正在目睹熒光蛋白合成熒光技術的快速進步提供重要的洞察。由於這些進步,活細胞成像已經成為必要的分析工具,在大多數細胞生物學實驗室,以及一個常規的方法,在廣泛領域的神經生物學,發育生物學,藥理學,和許多其他相關的生物醫學研究的學科實line。其中最重要的技術挑戰進line成功的活細胞成像實驗是細胞維持在一個健康的狀態,並合成熒光和/或熒光蛋白的存在而被照亮顯微鏡舞台上正常工作。

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環境的嚴密的控製是一個成功活細胞成像實驗中的最重要的因素。特別是,在何種條件下細胞的顯微鏡載物台保持,雖然在許多要求,這取決於生物體廣泛變量,往往決定了一個實驗的成功或失敗的。容易地操縱包括環境方麵的腔室中,細胞的生長和成像的物理參數,溫度控製的本地化程度,大氣條件(氣體混合物和濕度),營養增補劑,生長培養基中的緩衝液(pH),培養基的滲透壓。

 

1中所示的一係列的捕獲的圖像從幾個不相關的細胞係,每個標記的合成的熒光基團和/或熒光蛋白的不同組合。兔腎上皮細胞(RK-13 line,在圖1a)與增強型黃色熒光蛋白(EYFP)和核靶向信號肽,在細胞核中定位一種黃綠色的標簽的融合質粒轉染。隨後用MitoTracker Red CMXRos的細胞染色的線粒體。在圖1b)中,負鼠腎近端小管上皮細胞(OK)轉染EYFP-actin蛋白的亞細胞定位載體標記的絲狀肌動蛋白細胞骨架網絡。線粒體有針對性與DsRed2在圖1c)在印度麂細胞融合載體,,而EGFP-peroxisomal的嵌合質粒亮點過氧化物酶在人宮頸癌細胞(HeLa line)在圖1d)。正常的金色敘利亞倉鼠腎成纖維細胞(BHK-21line)的貼壁培養的精選圖1eDsRed2 FP-內質網和EGFP-細胞核亞細胞定位載體轉染的混合物,從而本地化綠色熒光蛋白標簽細胞核和橙紅色的探針的內質網。最後,人骨骨肉瘤細胞(U2OS line),圖1g)中示出的轉染與天藍熒光蛋白融合到線粒體靶序列標簽線粒體。對於圖1中的每一個圖像,一個單獨的信道被記錄,可使用微分幹涉對比,並且重疊的熒光通道(s),以確定小區邊界和其他的共同的結構特征,如細 ​​胞核。

 

在製定計劃的過程中,為活細胞的觀察和長期的成像實驗,是值得認真考慮的一些重要因素。試樣應準確地標記的熒光團的熒光蛋白質或合成的(次)還,以便清楚地可視化的物鏡生物成分。也許更重要的是,在細胞培養中,必須保持在一個條件,促進生長和正常功能,以避免潛在的工件的實驗結果的解釋中。此外,細胞應成像的方式,不會誘發光毒性或擾動定位的熒光探針具有足夠的空間和時間分辨率。其中最重要的活細胞成像,必須加以解決(在下麵詳細討論;見表1)常規考慮溫度,氧,濕度,滲透壓,pH值(中小型緩衝),光毒性,在實驗室環境中,顯微鏡焦點漂移,流血通過熒光信號強度,和分辨率。

 

維持活細胞顯微鏡舞台上處於健康狀態的任何活細胞成像調查無疑是最關鍵的環節,一般需要結合機械別出心裁,伴隨著敏銳的洞察正在研究細胞或組織的生物學。雖然許多實驗室擅長於生長溫度控製二氧化碳孵化器中培養的細胞,維持長期成像實驗的細胞在顯微鏡載物台的任務更為苛刻。成像室必須保持正常運作的持續時間的實驗的細胞(或組織),同時允許通過顯微鏡的物鏡的不受限製的訪問權限。高數值孔徑的油或水浸泡物鏡正在使用時,會變得特別困難的這一壯舉。在許多情況下,調查員必須能夠引進的試劑,而成像(擾亂一個​​特定的細胞的過程,而不會幹擾時間推移序列轉移焦點或舞台上的地位,。其他重要的因素是簡單,可靠性和合理的成本。下麵的討論中主要集中於哺乳動物細胞中,但其他生物的各種技術之間的輕微差異,通常是不嚴格的。例如,酵母,昆蟲,和植物細胞的培養物沒有嚴格的溫度要求,介質組合物,而不是細菌細胞的要求。

 

培養介質哺乳動物細胞係

盡管媒體在細胞和組織培養的早期嚐試的混合物,含有胚胎提取物,血清,的蛋白質hydrosylates和主機其他體液傳播,迅速 ​​過渡到生化要求的基礎上定義的媒體建立。其中,最流line的是鷹的基礎(EBM)和最小基本(MEM)文化傳媒,貝科的修改MEMDMEM),火腿的媒體(F-10F-12),和2高度精煉的媒體配方設計在羅斯韋爾公園紀念研究所(RPMI 1640RPMI 199)的。此外,設計的碳酸氫鹽緩衝液的情況下(和二氧化碳)中培養細胞的培養基中,LeibovitzL-15,已被廣泛采用。所有這些培養基都需要添加血清(通常來自於胎兒和新生兒的牛犢或馬),至終體積分數5%和20%之間不等。嚴格定義的條件下,在生物製藥line業中的應用受益,也已發展為高度專業化的培養細胞無血清培養基。許多實驗室在培養涉及各種各樣的細胞類型往往危及一個確切的配方的嚴格要求使用一個複雜的介質,如火腿的F-12的混合物,與一第二介質(DMEM培養液,例如)含有較高的氨基酸酸和維生素的濃度。

 

細胞培養基的組合物,差別很大,但大多數配方包括氨基酸,維生素,無機鹽(礦物質),微量元素,核酸成分(基地和核苷),糖,酶,脂類,三羧酸循環的中間體,各種其他生化。簡單的媒體,如MEM,含有必需氨基酸的氨基酸,維生素,和它的鹽,而更複雜的配方(RPMI及無血清培養基)有數百個組件。細胞培養基通常是為特定目的而設計的,包括常規增長的正常永生(轉化)的細胞株,小學文化的萌生,病毒傳播,藥物製劑,並定義遺傳變異的生長條件。在所有組織培養的培養基配方的控製變量之間的pH值,緩衝容量,氧濃度,滲透壓,粘度,表麵張力。當細胞在顯微鏡成像,即使是很短的時間,這些相同的培養基條件下,必須仔細地再現中的活細胞成像係統。

哺乳動物細胞係的環境變量

變量

最佳範圍

評論

溫度

28-37°C

與標本室加熱器控製
使用內嵌灌注加熱器,
物鏡加熱器
環境控製箱

氧合

變量

灌注或定期更改媒體
使用大腔容積

濕度

97-100

封閉(密封)商會
加濕環境商會
自動填充係統開放錢伯斯

pH

7.0-7.7

使用HEPES緩衝媒體
灌注或定期更改媒體
無酚紅指示劑

滲透壓

260-320 MOSM

避免蒸發
封閉(密封)商會
加濕環境商會

氣氛

空氣或5-7
二氧化碳

使用HEPES緩衝控製空氣
封閉(密封)商會
大氣媒體的商會

媒體緩衝區

碳酸氫鹽或
合成生物緩衝劑

謹防光毒性
封閉式和開放式錢伯斯
氣控製商會

1

大多數流line的活細胞成像實驗中使用的細胞株生長非常好,在一個狹窄的範圍內的pH值在7.27.4之間,但一些正常的成纖維細胞pH值略高(7.7)有更好的表現,而許多轉化細胞係成長得更快更多的酸性介質中(pH值至7.0)。在pH值的情況下,對於實驗的準確性,電鍍效率測定應在物鏡pH值,以確保在選定的單元格線將及格。大多數市售培養基配方中含有近似的視覺測定pH值的指示劑(酚紅)。在溶液中,酚紅產生一個明亮的紅色色調,在pH值為7.4,在pH值為7.0,變為橙色和黃色,在pH 6.5,顏色的轉變,往往是當介質變得更加酸性文化形成融合單層。在較高的pH值,在pH 7.6,酚紅是粉紅色的紫色,在pH 7.8和以上。許多組織培養實驗室發現它很有用在平衡鹽溶液在不同pH值的比較文化傳媒建構一套使用酚紅的pH值標準。指示劑染料雖然是必不可少的常規細胞培養,由於高的可見光吸收的消光係數,它的使用應避免在活細胞熒光成像的實驗,以減少背景噪聲的電平,以防止光毒性。認識到這一點,廠家提供的最常見的培養基配方在無菌液體或粉末狀無酚紅。

 

幾乎所有細胞係都要求二氧化碳和碳酸氫鹽緩衝係統來調節pH值,並且必須要嚴格控製濃度二氧化碳的一小部分(通常為5%至7%,根據碳酸氫鹽濃度)的氣氛中,在專門的孵化器中培養溶解的氣體。對於活細胞成像顯微鏡,可以產生一個合適的氣氛與二氧化碳困難和通常需要培養室是專為受規管的氣氛。的引入,如合成生物緩衝劑的TRISHEPES,可疑的值已經在消除二氧化碳的要求,盡可能多的細胞株,因此無法容忍的二氧化碳缺乏,特別是在低細胞濃度。在一般情況下,1020毫摩爾HEPES緩衝液的濃度可以控製pH值在生理範圍內的情況下,在二氧化碳氣氛中,但培養基中仍然應該補充最佳的細胞生長,用碳酸氫鈉。

 

嚐試增長細胞顯微鏡單獨使用HEPES通常會導致大幅降低增長率(尤其是長期實驗),並應仔細檢查每個細胞係的能力成長和功能的媒體沒有二氧化碳緩衝係統。注意,補充HEPES在細胞培養基中的碳酸氫鹽緩衝係統不僅降低了pH值漂移率,並且不消除將培養物暴露在大氣中時所發生的堿度逐步增加。此外,許多報告已經浮出水麵HEPES毒性在活細胞成像實驗,推測可能是由於增加自由基的形成可視化所需的熒光探針的照明條件下合成的緩衝區。LeibovitzL-15培養基中,一個專門的配方,通過使用具有高氨基酸濃度的丙酮酸鈉和緩衝的目的是消除二氧化碳。包括在培養基中丙酮酸鈉使細胞增加內源性產生的二氧化碳,理論上使它們獨立的氣體(如碳酸氫鈉)。然而,許多細胞係並沒有很好地適應到L-15培養基,並配置基於這一提法的活細胞成像實驗前應徹底檢查幾個段落。

 

細胞係可以有很大的不同,雖然他們的氧氣需求正常大氣中的氧張力水平將滿足大多數文化。哺乳動物細胞通常需要氧氣呼吸在體內,但往往可以成功地替代糖酵解(厭氧過程)時,生長在培養容器作為主線路或之後永生。以上的細胞培養液中的深度可以影響生長在玻璃或塑料的表麵上的貼壁細胞的氧擴散率,並應保持低於5毫米。在大多數情況下,活細胞成像,嚴格氧調控是沒有必要的,相反,氧氣的消耗,經常被用來作為一項戰略,以減少光損傷,可以通過與氧自由基反應發生在熒光照明。然而,應該指出的是,降低氧張力可以是一樣有害的細胞,如果他們開始遭受低氧應激。減少的氧含量的最常用的方法涉及的商業氧氣耗盡係統的應用,如Oxyrase。替代技術來限製,由於分子氧自由基的損害,包括清除劑,如抗壞血酸(抗壞血酸維生素C),或Trolox(維生素E衍生物)的培養基中添加,但降低照明強度的策略,再加上高度敏感的攝像係統也應考慮。

 

大多數流line的細胞株有一個相當廣泛的公差滲透壓將增長以及滲透壓260320 milliosesmolar之間。低滲介質中的情況下,細胞常規生長在培養皿或開放式平板培養,可以被取代的,以補償蒸發。有機緩衝劑或篩選質粒的藥物,如HEPESG-418,由另外的結構改變時,重要的是監測培養基的滲透壓。在活細胞成像中的離子和有機營養成分的濃度將最初的實驗中選擇設置,但大多數成像室容納少量的媒體滲透壓的變化(這個問題通常是由於蒸發嚴重,當介質被加熱到37攝氏度)。因此,必須特別注意裝配時,細胞進入室,改變培養基時,如果發生任何蒸發(細胞滲透壓的快速變化是非常敏感的)。此外,在成像實驗,蒸發應最小化,或者通過使用一個密封的係統,由覆蓋與油具有較低的密度比水(通常為礦物油中)的一個開放的腔室中的介質,或通過在成像過程中,加濕室。請注意,在一般情況中,微環境提供的一個活細胞成像腔室的體積小,在本質上是不太穩定的二氧化碳培養箱中的每一個細節需要相當多的關注。

 

選擇活細胞成像細胞係

用於活細胞成像實驗細胞株的選擇往往決定(有限)由多項因素,包括物鏡生物的調查觀測能力的細胞合成熒光,轉染效率,必須標明一個特定的line的嚴格的培養室的環境和光照條件下的耐受性。過於頻繁,顯示優異的性能,在一個或多個類別的細胞係進line輕微或完全在另一個失敗。例如,正常牛肺動脈內皮細胞(BPAE線)可以被固定和染色,在使用合成的熒光基團揭示錯綜複雜的蜂窩結構的細節與細膩清晰,但的線隻能在效率低(少於5%的熒光蛋白載體轉染的)和相對不耐長期在低光照水平,不影響許多其他細胞係的照明。或者,兔腎上皮細胞(RK-13 line)可以用各種質粒轉染高效率十分寬容延伸的數天的時間推移序列期間的高照度水平(包括激光),但沒有得到充分沾上許多共同合成的熒光團(如MitoTrackers)專為活細胞成像。

 

在成功的一個最重要的因素觀察活細胞的生物現象研究和成像選擇特定line必須顯示必要的形態和生理特性,以清楚地表明利益的概念。針對有絲分裂的研究,例如,許多細胞係不到足夠的成像,由於這樣的事實,分裂的細胞成為球形的,並可能從基材上分離。相反,在有絲分裂過程中保持相對平坦的,並連接到基板的細胞係是遠遠優於在細胞分裂過程中揭示的有絲分裂紡錘體的細節。其中最有用的lineline有絲分裂研究大鼠袋鼠腎細胞(PtK1 PTK2線,見表2),這隻能在相對 ​​低的轉染效率,但包含在顯微鏡更容易區分的染色體是一個小數目。其他幾個腎細胞係,其中包括從豬(LLC-PK1)和另一名來自非洲綠猴(BS-C-1 )也仍然附著在有絲分裂過程中,更容易轉染。豬和猴細胞中含有較多的染色體比鼠袋鼠,但其易於轉染和成像使它們優秀的替代品進line調查的有絲分裂。細胞在細胞分裂過程中保持扁平的培養室的玻璃是有用的有絲分裂紡錘體的觀測,此外,也可以顯示其他細胞成分的分布,如高爾基體,細胞骨架元素,內質網和線粒體。

 

活細胞成像實驗有用的哺乳動物細胞係

細胞係

細胞類型
(形態學)


(組織)

種類

標記
(應用程序)

B-16

紡錘

黑色素瘤

鼠標

產生黑色素
細胞骨架調查

BHK-21

成纖維細胞

倉鼠

質粒和病毒
轉染

CHO-K1

上皮

子房

倉鼠

需要脯氨酸
DNA

COS-7

成纖維細胞

猴子

T抗原
DNA轉染

LLC-PK1

上皮

有絲分裂
DNA轉染

HeLa細胞

上皮

宮頸

人的

細胞角蛋白
溶血卵磷脂

MDCK

上皮

角蛋白
圓頂運輸

NIH-3T3

成纖維細胞

鼠標

質粒
轉染

PC-12

合計

腎上腺

神經生長因子的
響應

PTK2

上皮

鼠袋鼠

細胞角蛋白
基因轉

2

 

應進line調查的骨架與細胞的蛋白質表達和具體定位(s)表示,正在研究,表現出高水平的。絲狀肌動蛋白應力纖維通常是更清楚地定義在成纖維細胞,上皮細胞相比,但有許多例外。細胞角蛋白中間絲形成廣泛的網絡在整個細胞質中,很容易與可視化免疫熒光或熒光蛋白在一些上皮細胞株(雖然並不普遍)。不幸的是,細胞角蛋白網絡是不好界定或成纖維細胞,上皮細胞和內皮細胞以及許多品種幾乎不存在。同樣,波形蛋白,結蛋白,外周神經絲蛋白,核纖層蛋白和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)中間絲形成突出的結構網絡在多種細胞類型,但在別人難以察覺。在幾乎所有的情況下,靶line應先固定,合成熒光基團和/或抗體標記在試圖本地化熒光蛋白活細胞成像前測試。

 

細胞生物學相關的動態過程中的信息,在追求各種耦合熒光蛋白活細胞成像的應用開辟了許多新的途徑。先進的熒光顯微鏡技術漂白後恢複(FRAP),共振能量轉移(FRET),相關光譜(FCS),斑點顯微鏡(FSM)在其發展明顯受益,從使用的熒光蛋白。這些隨處可見的分子也被轉基因生產,可光活化的特異性地標記的一個更大的分子群體的個別成員的新一代光學熒光筆。更進了一步,福斯特共振能量轉移技術,熒光蛋白偶聯已經產生了一類新的生理生物傳感器探針是有用的報告各種離子,如鈣,鈉,鉀,氯離子,pH值,此外還有一個過多的細胞事件,包括酶的活性,膜電位變化,神經遞質的釋放,和氧化還原。所有這些強大的新技術的基礎是建立在活細胞表達的基因編碼的熒光探針成像。

 

列於表2是幾種哺乳動物細胞係,一直到許多活細胞成像實驗在科學文獻中報道的重大服務的清單。研究人宮頸癌細胞(HeLa細胞)線是一個永生化上皮細胞已經聚集了豐富的信息。這豐盛的轉染細胞係可以在高效率熒光蛋白載體,產生高水平的表達,並定義本地化。轉化的非洲綠猴腎細胞(COS-7線)已被用來研究蛋白質動力學在高爾基體和內質網,而倉鼠細胞係(BHK-21CHO-K1)調查涉及的分子和細胞的最愛生物病毒,細胞內酶的活性,受體,促進功能和傳輸機製。表2中列出的其他細胞也響應於轉染,微注射技術,合成熒光標記與長期在寬視場共焦熒光顯微成像實驗。

 

活細胞成像錢伯斯的簡要概述

標本室多年來描述係統,提供卓越的光學性能,同時允許不同時間量要保持標本,顯微鏡和一些設計史上的一個不可或缺的分支已經公布。短期成像實驗中(2030分鍾或更小),可以簡單地進line附加到載玻片含有貼壁細胞的蓋玻片,使用隔離物,以保持細胞的損壞(物理應激可誘導某些細胞係中的自發熒光)。能夠確保蓋玻片與一些密封劑,包括熔化的瓊脂糖,橡皮泥,真空潤滑脂,或一個有用的製劑稱為VALAP(凡士林,羊毛脂,石蠟的1:1:1的混合物)的任何一個,以提供水密密封和消除培養基中的蒸發。由矽橡膠(市售)或碎片的蓋玻片的切薄的墊片,可以用作隔離物,以保持細胞的顯微鏡載片上的直接接觸來。蓋玻片表麵含有細胞正麵朝下放置在隔板上,並填寫蓋玻片和幻燈片之間的空隙用生理緩衝液(如磷酸鹽緩衝液PBS)。密封蓋玻片的邊緣周圍使用的試劑的選擇和放置在顯微鏡載片上,在舞台上成像。細胞沒有生長培養基中,溫度控製,將正常的隻有幾分鍾,但是這往往是足夠的時間來獲得必要的圖。

 

對於較長的實驗,特別設計的環境試驗箱提供一種機製,用於觀看和活細胞成像顯微鏡載物台,以及培養保持長時間的最適生長條件非常接近。在一般情況下,成像的腔室包括一個玻璃窗口,通常的厚度的蓋玻片(約170微米),通過它的細胞,可以容易地工作在高數值孔徑的物鏡觀察。溫度控製,對於大多數細胞中,一個關鍵的參數往往是通過使用外圍紅外輻射或加熱後的空氣源(如吹風機或溫熱雞蛋的),直接耦合到腔室的熱敏電阻控製下的金屬加熱板,或用光學透明通過蒸發施加到蓋玻片的表麵,以提供更有效的熱傳導到腔室的導電性金屬氧化物的薄塗層。

 

多種市售室可以購買(或者,很容易在內部構造)活細胞成像通常分為兩個基本功能類別:開放室,培養皿,進入到大氣中,其中有自由;封閉的腔室是密封的保護細胞的培養基中的蒸發。一個開放的腔室係統通常會允許生長的細胞的快速訪問,從而很容易使顯微注射,添加藥物的培養基中,細胞或其他操作,改變。與此相反,封閉的腔室提供來自外部環境的保溫效果更好,但使進入細胞更加困難。最封閉的室內設計包括端口允許添加新鮮培養基和藥物在實驗過程中不中斷的成像序列。在這些係統中,灌注的調節蠕動泵,馬達驅動的注射器,或通過重力控製歧管。新的解決方案,當被添加到一個封閉的腔室,這是至關重要的,除了前平衡到相同的溫度,細胞。此外,許多細胞對剪切敏感的,所以應該進line灌注連接到蓋玻片的貼壁細胞在非常低的流速。一些更先進的密閉腔係統的設計提供控製剪切力。

maintenance figure2

許多最簡單的商業開放室的成像係統的構造,通過安裝到一個普通的組織培養皿或陪替氏培養皿底部的蓋玻片。標準3560毫米的無菌培養皿中鑽一個小孔(直徑約一厘米)在盤170微米的塑料蓋玻片融合,使高分辨率成像。矩形蓋玻片和一個小的單個或多個孔塑料成像室密封玻璃的顯微鏡載片也有市售,但是相當昂貴的。這些腔室的設計是比較簡單的使用,但它們不是緊密地密封,這樣的培養基中,在實驗過程中蒸發的量必須被仔細地監測。另外,大多數的簡單的成像腔室不包括任何加熱係統,必須安裝在顯微鏡載物台配備有一個輔助的加熱單元,被專門設計用於容納腔室。沒有溫度控製,簡單的開放室係統性能是僅略微優於使用密封蓋玻片上述方法。

 

FCS2 Bioptechs活細胞成像室在圖2a)所示類似的密封封閉腔比最簡單的開放室係統更昂貴,但他們提供了更多的控製環境,對許多人來說,並能保持細胞處於健康狀態小時(甚至數天或數周)。一個典型的封閉室係統提供了兩個光學表麵分離灌注環密封墊片。這種三明治,然後用金屬或複合材料外殼,其目的是提供溫度控製和安全地適應顯微鏡載物台的夾緊在一起。有了這樣的外殼,灌注率,介質體積,溫度,氣氛,流動的幾何形狀,和光穩定性成像室控製到相對高的程度相比,開放係統室。先進的密閉腔係統(圖2a)條)降低流體的交換時間,提供流量控製的灌注介質,以避免令人不安的貼壁細胞,提供卓越的溫度調節,並保持接近光學表麵的觀察使用高數值光圈顯微鏡的物鏡。此外,用戶可以定義培養基在細胞表麵的流動條件,以滿足實驗要求。各種各樣的封閉小室的活細胞成像係統可以買到。

 

巔峰活細胞成像室倒置顯微鏡,提供幾乎完全控製的環境下,其中的一個例子是在圖2b)有效地結合了細胞培養孵化器。孵化器的外殼是最常見的有機玻璃建造,圍繞顯微鏡階段,物鏡,熒光過濾器,並傳送聚光。在這些腔室可用於與各種培養皿或包括標準培養瓶,培養皿,配有蓋玻片的顯微鏡載玻片,上麵所討論的,其他打開和閉合係統和許多。與外部加熱單元(通常強製空氣)和二氧化碳的濃度來控製的感測單元,其耦合到一個穩壓器,它的輸入由純氣體的氣缸的溫度被保持。這些單位也可配有濕度控製等多種設計方案,提供橡膠手套訪問操縱細胞時,在成像過程中對環境的平衡,以避免幹擾。為了維持高度的溫度控製,一些更複雜的孵化室括幾乎整個顯微鏡目鏡,攝像頭,lamphouses異常。在下line路上,環境試驗箱可以阻礙快速訪問標本和繁瑣的重複操作時是必要的。此外,腔室內部的高濕度水平可加至維持齒輪潤滑油過早降解和氧化的金屬表麵和透鏡塗料由於儀器費用。大多數的顯微鏡製造商提供了一個自定義的孵化器選項倒置顯微鏡,而售後市場供應商更簡單,更先進的機型填補了國內空白,以及許多有用的配件。

 

如上所討論的,廣泛的打開和閉合的活細胞成像室設計是市售的,其中有許多是相當適用於特定的應用程序。這是值得探討的各種可供選擇的時候走上了漫長的道路,成功的活細胞成像。多數研究者的青睞的技術,使用一個特定的係統,反映他們的經驗,而這些喜好跨越室設計的色域。事實上,據報道,有幾個功能的係統與現成的上門維修絕緣薄片,膠帶,和廉價的加濕器使用幹衣機的排氣管連接到所述腔室的構造。關鍵的一點是,在一個給定的實驗室必須保持細胞功能的最佳環境,提供了一個清晰的光學窗口,在其中捕捉到內室發生的事件。由於實驗變量到另一個,從一個調查不同的設計偏好,可以改變,最好的方法是測試各種不同的係統,以便確定一個是最適合於該細胞係和實驗條件。

 

溫度控製

所有活細胞成像配置,可能出現的困難進line實驗時,溫度明顯不同於周圍的實驗室環境(注意,溫度波動在活細胞成像通常是規則,而不是例外)的準備工作需要。細胞的功能是對溫度變化極為敏感,甚至一對夫婦的具有深遠影響的程度,對細胞生理變化。有多種方法可用於溫度控製的細胞在顯微鏡舞台上,許多的上述商業係統,包括加熱元件直接耦合到所述室。雖然這一戰略提供了一個簡單的集成解決方案,溫度控製往往局限於室本身,而忽略相關的組件,可能會產生負麵影響,對保持一個穩定的溫度。其中與溫度波動最重要的因素是顯微鏡階段,框架和物鏡可以充當散熱片和抵消試樣加熱係統的努力。這個問題是複雜的,當浸沒物鏡的光耦合的介質,它可以是油,甘油,水,這是因為利用具有高得多的熱導率比空氣。加上高數值孔徑物鏡的接近的接近度的試樣,以及物鏡本身的熱負荷,整個係統可以迅速地被剝奪熱量,如果物鏡不是熱控製。區直屬的物鏡在上述靜態室的情況下,往往是至5度(攝氏)的溫度比所述試樣腔室的其餘部分。

maintenance figure3

根據配置,整個顯微鏡可以用加熱,但幾個臨界溫度控製的問題,可以簡單地通過使用市售的物鏡加熱器(參見圖3),采用循環加熱的水或電阻加熱元件避免。目的加熱器,與合適的試樣加熱係統相結合時,可以部分抵消試樣和前透鏡元件之間的溫度梯度。然而,請注意,即使有一個客觀的加熱器,可以仍然是沿客觀桶之間的物鏡和顯微鏡本身的溫度梯度。(b)是圖3a)和圖3中示出的可調節的加熱毯和循環水套的物鏡加熱器基本上是相同的,從熱力學的觀點來看。唯一的區別是電產生的熱量在橡皮布(圖圖3a)),而外部產生的熱和由流體轉移到夾套的物鏡(圖3b))。在這兩種情況下,熱傳導是相對低效的,大部分的熱輻射相差的直接下方的檢體,而不是被轉移到的物鏡物鏡的區域。不幸的結果是過多的外部熱對流向上引導的標本在附近產生較大的溫度變化和過度的熱循環試驗箱控製係統。

 

顯微鏡物鏡作為其物理參數的功能,不同的隔熱型材。大多數物鏡是設計和銷售為目的的固定細胞顯微鏡(在室溫下進line),因此選擇物鏡時,被聘用在活細胞成像,應小心考慮這些物鏡的能力,以有效地加熱。循環加熱係統除了從客觀加熱問題,可以改變蓋玻片位置,導致標本飄散出焦。此外,研究人員應知道,反複加熱和冷卻的物鏡已被錯誤地報告大大縮短的壽命,特別是在內部透鏡元件的無應變字符。事實上,很少有可靠的證據表明,溫度循環影響的應變特征在專門的物鏡,也最能承受的溫度高達攝氏50度,而不會損壞。唯一的負麵影響,加熱顯微鏡物鏡的後退止動筒潤滑劑的粘度增加(達到的柔韌性口香糖),在較短的一段時間比與不加熱的物鏡。然而,浸油的傾向,蠕變到桶通常在溫水浸泡物鏡的情況下,原來的潤滑油的壽命延長。

 

永久性安裝,一大盒可圍繞顯微鏡,與暖空氣加熱。在這種情況下,大多數的顯微鏡可以平衡到一個單一的溫度提供的優點是消除顯微鏡部件的熱膨脹產生的任何移動。然而,空氣流周圍的試樣腔室本身也必須被最小化。在構建的外殼時,訪問顯微鏡和可調元件可能是有限的,所以它可能是值得框中,然後從比較普遍和廉價的元件構造的情況下,需要重大修改。

 

最後要考慮的是嚴格控製溫度不僅在顯微鏡,也是整個實驗室。現代顯微鏡製造範圍廣泛的材料,包括鋁,塑料,複合材料,玻璃,黃銅,鋼,所有這些都具有不同熱膨脹係數。甚至一個單一度的變化可以產生多餘的動作,在顯微鏡的光學列車,產生焦點或對應位移。顯微鏡現在的位置鄰近的空調或供暖管道往往會產生局部溫度波動的影響,最終導致聚焦問題。對於長期的觀察,許多研究者建立一個大型的舞台周圍的恒溫控製箱(見上麵的討論),或在一個房間裏,保持在37攝氏度(相對不舒服的工作情況),甚至將整個顯微鏡。確切的戰略最終取決於特定的應用程序,但它絕對是至關重要的,在一個活細胞成像係統將被安置在它的實驗室設計時考慮這些問題。

 

實驗室環境的注意事項

當選擇一個房間,將用來進line活細胞成像實驗,這是必要的,以確保有足夠的通風可消耗臭氧釋放的汞和氙弧放電燈,以及用於清洗的有機溶劑的煙霧從光學表麵和消毒,在顯微鏡階段。周圍留出足夠的空間,適當的通風,以及清潔的地麵,長椅,桌子,和實驗裝置的顯微鏡係統。設備故障通常可以追溯到進氣口被堵塞,靠近地板,或者放置在一個人跡罕至的位置。實驗室應精心保持幹淨,並保持在一種有序的方式,以減少水平的灰塵,煙霧,和其他破壞性的蒸汽,可以減少光學以及電子性能。為了減少由微生物活細胞培養汙染的發生率,顯微鏡載物台和周邊地區的應定期用70%乙醇或商業消毒毛巾擦拭。文化媒體泄漏,在活細胞室操縱一個不可避免的因素,應立即清洗及周邊地區進line徹底消毒。

 

在機械振動源,可以影響顯微鏡的性能是中央供暖和製冷機組通過附近的走廊(或空氣處理)在閣樓或屋頂上的建築,冰箱,低溫恒溫箱(甚至在相鄰的房間),和交通。冰箱和其他來源,可能不會立即明顯的振動可以對顯微鏡的穩定造成了嚴重的影響。多種技術可以應用,以減少空間和建設的低頻振動,包括反饋控製的隔離表,充氣(最昂貴的選擇)和成本相對較低的靈活的合成高分子隔振墊(見圖4) 。後者被銷售中的各種幾何形狀和阻尼水平,以適應廣泛的配置。半英寸的鋁或一個預先鑽好的隔振平台的振動片和一個重片的組合通常會降低振動無法察覺的程度。雖然倒組織培養顯微鏡幀重得多,而且通常不太敏感的振動與直立顯微鏡相比,他們仍然受益隔離。,在許多情況下,高頻率的振動可以通過加載表的頂部與附加質量,如鉛磚大幅減少。最後,當子分辨率的功能是非常小的位移受調查者,額外的步驟可能被要求,如工作在深夜或清晨,當環境比較安靜。

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除了穿過樓板的振動進line,還必須考慮可能的空氣源。據報道,原本穩定的設備上產生麻煩振動高分辨率顯微鏡設備冷卻風扇或空調扇在實驗室,甚至從附近的車輛(通過實驗室窗玻璃進line),排氣噪聲。激光冷卻風扇等主要設備的振動也能影響活細胞成像工作站。之間放置冷卻風扇和激光頭的一段柔性導管。可以有效在去耦風扇振動。在灌注和地心吸力媒體係統,振動由於氣體鼓泡通過喂食解決方案可以通過油管標本室,並產生周期性的機械位移。噪音也可以是一個源的振動和降低顯微鏡穩定性。單位應及時更換風扇噪音和其他設備,往往會產生過量的噪聲(也可能是振動),如果可line的話,應該搬遷到另一個房間。顯微鏡通常配備有內置的光源,電力變壓器,可以逐漸加熱顯微鏡幀,並產生一個緩慢的焦距漂移試樣。

 

室溫原本穩定的活細胞的顯微鏡成像係統中的控製是另一個主要關注的問題,可記錄時間推移序列時遇到的最重要的問題之一。局限於一個小,通風不好的房間,一台顯微鏡,可以產生相當的大氣溫度上升。光源,溫度控製器,百葉窗,攝像頭,電腦和其他設備產生的熱負荷可能超過標稱容量的房間,需要一個輔助冷卻係統的服務。額外的冷卻,提高了操作的所有電子設備,隻要它不引入額外的振動和灰塵。在這方麵,將冷卻風扇的顯微鏡係統的計算機和高速的磁盤驅動器的容量可能變得不足機箱充滿了產生熱量的卡,如那些用於相機控製器,圖像處理軟件,和額外的內存。存在的問題主要表現為係統崩潰,噪音增加,在最壞的極端情況下,丟失的數據。增加一個低噪聲的框中,然後風扇的計算機殼體通常能夠減少這一困難。

 

雖然現代反組織培養顯微鏡(那些最青睞活細胞成像實驗)被設計成堅實的單機儀器通過了大量的工程設計工作,以盡量減少振動源,售後的輔助組件可以經常危及這種固有的穩定性。快速快門和濾光器變換器(濾光輪)在操作過程中產生的顯著水平的振動,並直接連接到顯微鏡的幀時,往往引起擾動,可以持續幾十到幾百毫秒。此外,許多研究級顯微鏡通常含有內置的電動組件(物鏡轉盤,重點控製等),可以振動源,除非廠家限製的速度,這樣的設備和/或引進機動功能之間的延遲和圖像采集。從輔助元件的振動可以顯著減少甚至消除獨立地在不同的的台燈相鄰顯微鏡通過安裝這些設備。剛性鋁光學麵包板市售含預鑽安裝孔,是理想的住房都顯微鏡及配套組件。

 

焦點漂移

顯微鏡焦平麵從活細胞中的連續的圖像的收集過程中的軸向位置的波動的時間推移顯微鏡中最嚴重,最經常遇到的問題之一。通常被稱為焦點的漂移,在顯微鏡焦平麵的變化通常發生由於在成像室或房間內的溫度變化中,該文書被容納。廣義定性分析顯微鏡的熱狀態和焦平麵位置之間的關係表明,1度(攝氏)的溫度增加或減少約一個半微米(500納米),可以轉移焦點。凹凸的表麵在玻璃蓋玻片上,以及齒輪滑動,潤滑脂層的壓縮,顯微鏡的運動部件之間的穩定,但通常不關注的一個主要來源,也可以向集中的漂移所產生的機械不穩定性。沒有反饋裝置連續監視和正確對焦的漂移最好的補救措施之一是采用恒溫控製的外殼完全融入顯微鏡和相關組件。雖然它未能取得留在短的時間內,無需輔助設備,高比例較長期的實驗重點的圖像序列,由於注重漂移失敗。在幾乎所有的情況下,通常可以被追蹤顯微鏡光學列車的蓋玻片或溫度梯度的彎曲的熱不穩定性導致的失敗作為源。

 

擊敗焦點漂移應該是一個主要的考慮時間推移成像顯微鏡的配置過程中,尤其是當使用高數值孔徑狹窄的聚焦深度(約300納米)的物鏡需要一個焦點的位置保持在100納米初始平麵。整個係統,包括顯微鏡,攝像頭,百葉窗,濾光輪,照明,活細胞室總成,和主機工作溫度應提請至少2448小時,前啟動時間推移成像序列。當裝配成像室,確保含有貼壁細胞的蓋玻片上牢固地安裝在其外殼的腔室本身是不允許無論是在橫向或軸向方向移動的方式定位在舞台上。在成像分辨率高,油浸物鏡可以是源的焦點漂移,跨油腔室蓋玻片和鏡頭前端部件(幹的物鏡沒有這個問題)。客觀加熱器,如上所述,應使用所有的配置,采用浸泡物鏡。一旦顯微鏡是在正確的操作溫度和所有其他設備的實驗上演過了一段1224小時,使用一個固定和永久安裝的試樣,監測重點的初步時間推移順序將提供一個極好的指示係統的穩定性。

 

顯微鏡和廠家售後的各種市售的軟件和硬件解決方案已經出台與之抗衡的焦點漂移。的硬件設備是測量的物鏡的前透鏡之間的距離和反射的下表麵接近的表麵上的物鏡(蓋玻片)的試樣通過檢測光或聲音的自動對焦係統。然而,這種方法可以被阻礙,用於高分辨率的油浸物鏡時,由於對比度和反射率作為傳感的光穿過油的損失。最先進的自動對焦係統使用低強度的近紅外線激光或發光二極管(LED)源,以反映的照明光束,通過物鏡和蓋玻片的上表麵上(支持細胞和培養基中沐浴),隨後回收的物鏡的反射光,並把它傳遞給一個檢測器控製的反饋電路來調整位置的物鏡有關的蓋玻片培養介質接口。

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試樣的位置的瞬時值反饋使毫秒的時間間隔中被檢測到的觀察過程中,從而自動地校正聚焦實時漂移的蓋玻片和物鏡之間的距離。這些係統是特別有用的,在終止焦點漂移產生的溫度降低時發生的變化和灌流培養基或添加試劑(如藥物)的文化。此外,持續關注修正成像檢查細胞,以確定候選人是促進了多點圖像采集過程中的觀察和設置位置在翻譯階段。軟件附帶的自動對焦係統,可自由選擇焦平麵通過調整偏置控製。由於使用長波長的激光或發光二極管光源,近紅外檢測係統不侵入用於觀察的波長上,應該是不可見的熒光檢測器。

 

5中所示的是一個典型的自動對焦漂移校正機製為一個倒置的組織培養顯微鏡(圖5a)),與比較常見的熒光蛋白的熒光發射公司與自動聚焦激光器的波長光譜的光譜窗口示意圖線(圖5b))。聚焦到物鏡的後焦平麵的激光(或發光二極管)具有指定的偏移量,並介紹其中心軸線平line。的定位反饋回路分鍾幾何從蓋玻片上表麵和培養基之間的界麵被反射的光束的位置變化,由於焦距偏移進line校正。在圖5中所述的光譜發射曲線(二)代表一些最有用的熒光蛋白覆蓋的波長範圍在450700納米之間,包括增強型青色(ECFP),綠色(EGFP),黃色熒光蛋白(EYFP),作為礁珊瑚以及紅移的變種,單體Kusabira橙(MKO)和mCherry。熒光蛋白的信號不幹擾的焦點漂移校正係統所使用的770納米的激光線。

 

在激光掃描共聚焦顯微鏡焦點漂移校正的時間推移的調查期間通常是通過獲得在每個時間點的多軸向的圖像與圖像堆棧的每一個隨後的分析,以確定到一個預先選定的參考點相對應的一個共同的焦平麵。其他方法使用軟件算法來決定使用對比功能,記錄影像的連續向上和向下的步驟,並比較結果,直到獲得最高水平的對比(在這一點上,間隔)將焦點設置的時間點之間的焦點位置。軟件技術依賴於一個相對恒定的水平,標本的對比,然而,這往往是沒有的情況下,活細胞成像碎片等文物可以隨意漂浮到視場改變明顯的最佳焦平麵。

 

光毒性和光損傷

除了毒性的發生是由於合成的熒光基團和熒光蛋白的過度表達的濃度過高,健康長壽的最佳標記的細胞在顯微鏡成像室也可以受到由眾多其它有害因素。其中最重要的是,被熒光標記的細胞反複暴露到從激光器和高強度的電弧放電燈的照明光引起的損傷(光毒性)。在它們的激發態,熒光分子傾向於與分子氧反應,產生自由基,可以破壞亞細胞成分和危及整個電池。此外,一些報告表明,特定的成分的標準培養基,包括維生素核黃素和氨基酸色氨酸,也可能導致不利的光誘導對培養細胞的影響。熒光蛋白,由於這樣的事實,他們的熒光基團的保護的多肽包絡線內被深埋,一般都不會對細胞的光毒性。然而,許多合成的熒光基團,如Mitotracker有和核染色(Hoechst公司,SYTO花青染料,DRAQ5),可以高度即使是相對短的時間內照射時的細胞毒性。在設計實驗中,熒光團,表現出激發波長最長,應選擇以盡量減少破壞細胞短波照明。

 

6給出了標記的合成的熒光團或熒光融合蛋白的表達的細胞的照明光毒性誘導的三個例子。正常兔腎細胞(RK-13 ),如圖6所示(a)在第一轉染融合載體的EGFPSV40病毒T抗原核靶序列本地化細胞核內的綠色熒光。其後,將細胞治療用20分鍾Mitotracker有紅CMXRos,順序地想像在30秒的時間間隔為24小時。幾個小時後,液泡開始形成含有線粒體圍繞原子核的地區。如圖6所示(b)是一個單一的表達mCherry熒光蛋白融合到人類的β -肌動蛋白經過幾個小時的觀察人腦膠質瘤細胞(U-251線)。注意細胞進入壞死發生的顯著惡化的細胞結構。支隊瑞士白化小鼠胚胎成像下麵一個小時的治療與DNA結合的核的Hoechst 33342染色後的細胞(3T3線)被描繪在圖6c)。紫外線吸收核染料(例如Hoechst公司)通常表現出光毒性作用更迅速地比在可見光譜中,在較長的波長被激發的探針。

 

如上所討論的,合成的生物緩衝劑HEPES已報告的,以產生光毒性在某些情況下對細胞的影響(雖然在許多情況下,這可能是由於更直接的碳酸氫鹽水平不足)。調查員應該記住,所有的細胞在本質上感光,並加入到培養基中的化合物靈敏度熒光團或芳香成分。通過激發態的熒光基團產生的自由基損害的隻能是有限的,無法阻止。然而,健康的細胞有內在的自由基,減少有害化合物的酶的機製,並能容忍熒光激發他們的酶係統不飽和。培養基中減少氧的水平,提供了細胞的生存氧氣撤回,可以起到限製的漂白度和自由基的產生的雙重目的。

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不管潛在的細胞,酶處理所產生的熒光基團和培養基成分的毒性,細胞暴露在光線在成像設置應減少到盡可能低的水平,以限製其他來源的細胞的損傷,並盡量減少在實驗中的產物的可能性。每幅圖像的照明劑量可以通過明智的中性密度過濾器中的應用受到限製電弧放電燈,照明光源(激光器)的輸出功率降低,快門組件的編程限製僅在暴露於熒光激發光圖像采集。此外,熒光濾波器帶寬應仔細選擇,以減少不必要的波長的數目和強度,將照亮細胞與光,是沒有用的成像。使用高數值孔徑物鏡,采用了最好的的光吞吐量和光學元件最少的幫助下成功地降低照明水平在活細胞成像能力。

 

哺乳動物細胞的敏感性,紫外線燈照射的熒光基團的情況下,即使在被記錄(稱為光損傷的現象),和許多細胞係至少是同樣用來激發青色和綠色的波長區域,藍色光敏感熒光蛋白質。成像實驗中,必須要在最低的光水平下可以觀察到細胞的活細胞在顯微鏡配置的可視化,應盡可能快地進line時,為了盡量減少光損傷和光毒性。應使用中性密度濾光片(或非常低的激光功率),以衰減的最佳方式是與數字成像係統的照明源和可視化的細胞。通過顯微鏡目鏡觀察細胞需要花費幾秒鍾,這是在至少十倍長於往往是必需的,獲得的圖像具有足夠的質量,用於小區選擇和聚焦。另外,使用明場,相襯,微分幹涉對比(DIC)的成像模式,可位於候選細胞成像。在所有情況下,應使用綠色或紅色的幹擾濾波器,在安裝過程中,以提高對比度和降低細胞暴露藍色光。

 

活細胞成像研究的546納米(綠色)的廣泛應用過濾器的起源,因為這個波長區域相匹配的主要汞弧光放電燈發出的光譜線。然而,實現適當水平的光照強度是很少有問題的活細胞的調查和現代化的物鏡被修正到這種程度,他們並不需要使用高分辨率成像綠燈。因此,應限於最好由細胞的耐受性在各區域的照明波長的選擇。緊接細胞分裂(前期),大多數的哺乳動物細胞係是非常敏感的紫外光和紅外光,是最不敏感的紅色,綠色和藍色光,以遞減順序。因此,為了盡量減少光損傷,紅色600納米和650納米之間的區域用一個帶通幹涉濾光片是活細胞觀察的理想選擇。在哺乳動物細胞和組織的自體熒光,也降低了在可見光光譜中的較長的波長。請注意,光學分辨率是依賴於波長和紅光收益率最低的理論值由於波長較長參與分辨率。然而,在大多數情況下,使用的紅色光不是限製因素,因為實現了在活細胞成像的分辨度經常會損害細胞內部運動,溫度漂移,在光學係統中的缺陷,以及照明波動。

 

活細胞成像實驗在選擇過濾器,帶寬應精心挑選的紅外線和紫外線,即使痕量水平被淘汰。盡管現代的帶通濾波器的設計表現良好的可見光光譜中的中部地區,他們往往通過非常低和非常高的波長的輻射。因此,建議安裝專門的玻璃過濾器,阻止有害的紫外線和紅外線波長附近的照明源(s)。汞,並在較小程度上,氙燈產生大量的紫外線,而鎢鹵燈發出的(發送的)顯著量的紅外光。作為最後一個步驟,安裝電子快門(鹵鎢燈和電弧放電燈)限製暴露的細胞損害的輻射期間,沒有被捕獲圖像時。明智的模板的照明源是成功的活細胞成像實驗中的最重要的因素之一。

 

檢測技術在過去幾年進展是可line的,在活細胞成像實驗中進一步降低照明水平。不斷推出越來越敏感的光電倍增管陰極共聚焦顯微鏡和先進的電荷耦合器件(CCD)相機係統廣角鏡。集約化和電子倍增攝像係統現已能輕是極其低的水平,與高靈敏度活細胞成像。許多這些相機采用薄型背照式CCD的,通常冷卻功能,高量子效率在整個可見光和近紅外光譜區域,以進一步提高靈敏度。如果最好的相機都無法使用,靈敏度可提高相結合,來自多個像素的信號(在這個過程被稱為分檔)的空間分辨率為代價的。在激光共聚焦顯微鏡,保持縮放比例較低水平會降低光毒性細胞。增加共焦的變焦倍率,使總要掃描的激光光量的試樣在一個較小的區域,從而將細胞暴露到更強烈的光照。

 

選擇光衰減的確切程度和正確的曝光時間幾乎都是經驗性的練習。對於一個新的細胞係含有未知參數,最好的策略,以盡可能多地衰減光,亞細胞結構,使所獲取的圖像是勉強可見,適用於很短的曝光時間。一個好地方,開始是一個中性密度濾光片,光學密度為1.0,曝光時間為100毫秒或更短。激光掃描共聚焦顯微鏡,用激光功率約1%,並開始增加電壓(增益,如果必要的話)的光電倍增管。使用像素停留時間縮短約50%,比那些通常會產生足夠的信號電平。如果該細胞是通過長期的時間推移實驗能夠容忍這種光的水平,然後在照度和曝光時間可以慢慢增加在隨後的實驗中,直到信號與噪聲和細胞存活率之間實現可line的折衷辦法。應該指出的是曝光的單元格可以容忍,個別的曝光時間的長度的總量之間通常存在非線性關係。在一般情況下,細胞是最健康的,當暴露在非常短暫的脈衝光,因為長時間曝光(大於半秒)在很長一段時間,往往是致命的。

 

監測細胞的活力和變異

與新鮮細胞的活細胞成像腔室已被加載後,組裝,安裝在顯微鏡載物台上,下一個步驟是,以可視化的細胞,建立其整體狀況和形態,並確定適當的成像的候選。在絕大多數實驗中,尤其是在最近的成像細胞瞬時轉染熒光蛋白,將是一個顯著的細胞群的形態變異量。它並不少見要麽沒有轉染的細胞觀察或表現較差的本地化探頭。此外,轉染的細胞的百分比將超額表達熒光蛋白,經常點創建一個潛在的毒性作用。其他細胞可能會表現出常見的健康問題表現在從基板脫離的形式,過多的空泡形成,線粒體腫脹,胞質小泡(圖7中所示)。在不同文化中相同的細胞係可以顯示不同圖案的釘珠和出泡,這可能是一個症狀,不同的應激因素。健康狀況下降,往往會影響細胞的生長和運動的速度,通常會導致活動普遍減少。然而,健康狀況不佳並不總是顯示細胞活性下降,受損的細胞可以表現出明顯增加,類似布朗的細胞器運動。細胞顯示出即使是輕微的偏離正常和健康的外觀不應追求成像和數據收集。此外,如果超過50%的人口被判斷為異常,整個培養應被丟棄,一個更好的生理條件交換。

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許多活細胞成像實驗隻有一個,頂多幾個細胞。調查人員應牢記培養的細胞形態,可以很方麵存在明顯的表型變化。這種異質性的結果,細胞生長周期的不同階段,或可能是內在的差異,個別成員的人口(小學文化,後者更明顯)。出於這個原因,它往往是要記錄數據,從單個細胞數,以獲得一個統計上顯著的細胞line為和動態采樣。正如上麵所討論的,研究者應當牢記,在活細胞觀測的成像條件必須是最低限度,為了不顯著影響實驗結果的細胞擾動。活細胞成像實驗,其中最關鍵的環節是建立一個標準下判斷的健康細胞研究,使實驗的成功,可以客觀評估。確切的條件會有所不同,這取決於實驗,但要考慮的最重要因素之一是所預期的結果是否達到無損傷成像過程中所產生的細胞。在某些情況下,所研究的現象可以與固定細胞得到的結果相匹配,但是這往往是不可能的。

 

應監測成像實驗,以確保在實驗條件(培養基,緩衝策略,大氣,腔室配置)基本上不改變細胞的生長率,有絲分裂指數,或凋亡性質。如果可能的話,每個實驗組件的潛在負麵影響,應分別評估。例如,細胞生長在一個標準的二氧化碳培養箱用於成像實驗的可line性,有絲分裂指數和判斷在培養基中,和一般的形態變化。作為最後的檢查,細胞可以被安裝在無光照的環境成像室為若幹小時,然後同樣地評估。這種策略隔離的各種貢獻一般細胞的健康,容易識別任何需要修改的程序。

 

如上所述,細胞暴露於高劑量的照明在活細胞成像實驗中,那些標有熒光團可能可敬的產生會嚴重影響細胞功能的活性分子種類。的假設,至少一些已發生的損害程度,應采取在成像實驗步驟期間,以確定它是否足以產生不利的影響是顯著的,因此,它是安全的(和審慎的)。這是最好的離開細胞成像室,與隨後的定期檢查,以確定細胞是否啟動凋亡或進入並完成有絲分裂的實驗完成後,在顯微鏡舞台上完成。在實驗後的評估過程,可以記錄的影像時間推移,在廣泛分布的時間間隔(1030分鍾),超過的小時數。

 

用於確定細胞存活率依賴於適當的途徑中存在的標準下檢查細胞。一些轉化的哺乳動物細胞株有倒閉的細胞周期檢查點,使測定有絲分裂和細胞凋亡無用的進展。不同的細胞類型應仔細評估,以確定可line性評估與顯微鏡下成像序列,可用於標準。其中最簡單的檢測之後的成像實驗是比較明顯的健康和在調查期間沒有受到照射在相同的腔室與相鄰小區的已暴露在光線下的細胞形態。兩個種群相襯或DIC觀察時,類似的功能是一個很好的跡象,一般健康狀況還沒有被攻破。這一觀察結果與熒光成像,熒光團定位,以確定是否已經改變了在實驗過程中,應遵循。最後,應間歇地觀察到這兩種細胞群體幾個小時(天)後的實驗,看看如果細胞進line成像,同樣地line為的非成像的細胞。這種類型的比較往往揭示是否已發生重大損害下的細胞研究。

 

檢查的有絲分裂通路在活細胞成像是一個很好的機製,用以監測細胞光損傷。細胞有絲分裂周期才剛剛開始啟動染色體凝集(前期)過度照明損壞時,往往不能進入早中期,隨後完成細胞分裂。掃描文化與微分幹涉對比顯微鏡操作模式可以揭示這些細胞開始有絲分裂,實際實驗成像條件下仔細觀察,可以分離出一個合適的人選。如果染色體進line質解聚的觀察期間內,不能在幾個小時內重新進入有絲分裂的細胞,是一個很好的光損傷的可能性發生。請注意,改變培養基質解聚在許多細胞的前期染色體也將啟動,因此這種分析應進line幾個小時後,細胞被放置在顯微鏡舞台上。細胞係差異很大,他們的忍受能力在有絲分裂過程中的光。建立人類和動物細胞的原代培養可以對光線極其敏感的細胞來自胚胎(如果蠅和線蟲),而往往缺乏逮捕分裂周期的途徑,在DNA損傷反應和更寬容的光損傷。

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除了光損傷和光毒性,以及嚴格的維護要求現任活細胞成像相關的眾多問題,研究者也必須要警覺到的實驗過程中微生物汙染的可能性。最常見的感染的發生是由於細菌,真菌,支原體,酵母菌,黴菌,在罕見的情況下,原生動物。除非它變成一個頻繁的事件,參與的感染或物種的性質是不一樣重要的確定汙染的來源。在一般情況下,快速生長的微生物是由於這樣的事實,它們通常是很容易檢測和培養可以迅速丟棄問題較少。更重要的是這些感染的存在是神秘的,無法可視化的文化,因為在常規檢查的物理尺寸,或使侵略者逃脫檢測水平增長。在培養基中的抗生素的過度使用是一個共同的問題,通常會導致一個低級別的汙染,它可以保持很長一段時間未被發現,最終可能會幹擾正常的哺乳動物細胞功能。

 

列於圖8是顯微照片,示出三個最常見的可見活細胞培養物中的微生物汙染來源。未經檢查的細菌的生長(圖8a))在高放大倍率(通常伴隨著在培養基中的pH值的快速下降),很容易檢測到,甚至可以被可視化的生物體編號開始時在培養基中的濁度用肉眼就可以到達飽和度。酵母(圖8b))增加速度將遠遠超過細菌,但有一個明顯的殖民主義的動機,揭示了他們的存在。黴菌汙染(圖8C))通常在2448小時之內,超越文化,往往可以被認定為一個濃密,纖維的入侵。然而,也許是汙染最嚴重的形式,是不顯著對比增強用常規的顯微鏡技術(相襯和DIC)。支原體(圖中未示出)可以嚴重地改變細胞的line為和代謝,但不是通過逐漸惡化的跡象,常常是細微的其他在細胞培養中是不容易確定。應定期進line支原體檢測,確保文化的活細胞成像這一嚴重神器。揭示支原體的存在下,包括熒光染色(核染料Hoechst的),聚合酶鏈反應和放射自顯影的各種檢測方法是有用的。

 

時間推移成像

1909年由法國博士生的學生讓Comandon,誰提出的最早報道時間的推移,梅毒螺旋體,查理·卓別林的前5年他的第一部電影的電影片引入動態成 ​​像的生物活性。Comandon的技術,他稱之為microcinematography,使捕獲事件在微觀世界,可以狂奔到一個脆弱的暗視野顯微鏡使用一個巨大的電影攝影機記錄的電影生產。這些電影證明器樂教學醫師如何區分疾病造成螺旋體是無害的,並演示了如何時間推移觀察,可以采用無追索權獲得重要的生物信息,圖像分析,處理,甚至是經驗的定量測量。在未來75年中,許多的顯微鏡適應日益先進的電影膠片相機,顯微鏡,以便產生更好的薄膜高得多的分辨率。

 

由於管為主的視頻攝像機成為負擔得起在20世紀70年代後期和20世紀80年代早期,研究人員開始用光學顯微鏡夫婦這些設備產生模擬時間推移圖像序列的實時視頻。管攝像機最終讓位麵陣CCD20世紀90年代初,預示著一個新時代的顯微攝影和信令的電影的最終消亡。憑借先進的數碼相機係統可在21世紀,日益流line的技術時間推移cinemicrography的捕獲事件發生在活細胞中的期間範圍從幾秒鍾至數周(甚至幾個月)越來越廣泛的應用。該技術涉及重複成像的細胞培養在規定的時間點,從而提供了無數的動態過程經常發生的時間尺度分布廣泛的信息。當時間推移調查耦合到標記細胞合成熒光基因編碼的熒光蛋白質,亞細胞和分子水平上的事件可以調查。

時間推移成像可以在兩個空間維度,使用廣角技術,並進一步延長,甚至三維成像,激光共聚焦顯微鏡。此外,現代的共聚焦顯微鏡配備了線掃描軟件的快速和反複的單次掃描線成像。二維時間推移成像涉及順序捕獲單個焦平麵(X - Y廣角鏡和x - Ÿ所述 - žŸ - Ž在激光共聚焦顯微鏡),而三維成像光學堆疊多個焦點平麵厚的樣品在各種尺寸的格式。當在橫向平麵(xy)單一的焦點是結合作為時間的函數的z堆棧成像,該技術被稱為一個4-D時間推移成像。同樣,增加第五個維度(波長)產生5-D成像,而加入的2,4-D堆棧中的多個波長或多個橫向區域被稱為6-D時間推移成像。如上所述,順序的圖像采集的時間間隔,使用這些技術的範圍可以從毫秒到幾天甚至幾個月。

 

越來越多的小分子,重要的合成產生高度特異性的細胞或亞細胞標記圖案的熒光探針,現在市售。此外,巨大的努力,以產生有用的熒光蛋白,具有生成樹的可見光和近紅外光譜的發光顏色開始生產令人鼓舞的結果。綠色熒光蛋白及相關光譜變量現在經常被融合到其他感興趣的蛋白質蛋白質地理,運動,血統,以及在活細胞生物化學透露細節。在此方麵,這些生物探針提供了一個重要的新的方法來了解蛋白質的功能,這是一個合乎邏輯的步驟細胞過程的調查,現在許多生物體的基因組序列已被確定。許多熒光蛋白的固有亮度和耐光性,使它們非常適用於需要重複的成像時間推移研究。總之,合成和基因編碼的熒光探針,得到一個看似無休止的可能性陣列成像在活細胞的分子組成。

maintenance figure9

如圖9所示是一個24小時的時間推移順序兔腎上皮細胞(RK-13 )被抓獲結合使用熒光和微分幹涉對比幾個圖像。在轉染細胞的嵌合體mCherry熒光蛋白融合到人的β -肌動蛋白,以顯示這個細胞骨架的成分分布在主細胞身體以及lamellapodia的。圖9中的白色箭頭(一)表示細胞質肌動蛋白在細胞的中心區域的大池附近的皺褶的啟動。序列過程中,小皺褶開始膨脹,擠壓朝左手側的圖像,在波浪狀運動,集中明亮的標記的肌動蛋白的融合蛋白,因為它的增長(由箭頭表示在進入前緣圖9b)至圖9d))。,由於lamellapodium擴散到覆蓋麵積大,前緣後麵的小簇標記的肌動蛋白的形式(在圖9e)和圖9f)條中的箭頭),在結構元件可能podosomes的過程中參與細胞粘附到玻璃基板上。

 

時間推移成像技術的顯著的關鍵顯微鏡輔助元件,如電子光快門,濾光片輪,電動載物台,和焦點的漂移校正機製,它可以協調和控製由一台主機計算機,使用市售的圖像采集應用程序的幫助下的軟件。電子快門是必要的以阻止相機曝光之間的試樣的照射成像時,熒光標記的細胞,以盡量減少光損傷,光毒性,光漂白,這樣可以極大地延伸的圖像的質量在很長一段時間的細胞存活率通常用在時間失效的實驗。同時成像的多個熒光基團,以及結合的熒光和DIC成像,要求電動濾光輪,可以迅速在一些熒光過濾器和/或偏振片之間切換。在實踐中,激發照明控製由一個包含兩個或兩個以上的帶通激發濾光片的濾光輪,而收集到的第二個過濾器輪容納無論是帶通或長通屏障過濾器(發射)的熒光發射。物鏡下方的,多個帶通二色鏡安裝到協調通過一個單一的,固定光學元件的激發波長和發射波長的同時通過阻擋和反射。先進的濾光輪可以在相鄰的過濾器在3050毫秒之間切換與具有操作規格的電子快門,在同一範圍內,這是在時間推移序列的連續圖像之間的最短的時間間隔確定的限製因素。

 

在共聚焦顯微鏡中,時間推移采集圖像的掃描反射鏡的速度是有限的。掃描速率最高達到減少圖像的像素尺寸,采用光柵速度最快可在儀器上,但通常僅限於約810幀每秒。在較短的時間間隔收集圖像序列需要單線掃描,掠場的儀器,或旋轉磁盤顯微鏡。現代紡紗磁盤和掠場顯微鏡可以定期捕獲圖像序列,在高利率,介乎一至幾百幀每秒,通常隻有有限的數碼相機係統或光電倍增的速度。這些儀器的設計,以適應主機高速非常低光照時間推移成像實驗中的變量。

 

結論

活細胞成像實驗可以非常強大,但他們也可以顯著受益於互補調查采用固定細胞檢測,以協助在活細胞中觀察到的現象的驗證。雖然這可能似乎有悖常理,由於活細胞檢測細胞和分子動力學的標準經常舉line這樣的事實,在調查期間的技術困難和破壞細胞的風險可以基本上克服了類似的結果,如果在動力學和時間點事件可以被固定的細胞與驗證。在許多情況下,比較固定的細胞,活細胞成像是完全不可能的,無論是因為一個事件的動力學速度過快或實驗的性質(例如,動態),因為不能進line有意義的固定細胞內進line。此外,點活細胞實驗揭示事件或屬性都沒有進line觀測或固定細胞容易解釋。然而,它是值得考慮使用這種方法作為一種技術用於監測事件看出,在較長的時間推移實驗,以確認不存在有害影響擴展照明。

現代儀器使成像高信號噪聲比使用非常低的水平,在入射光的活標本,目前作為一個強大的技術分析細胞內的分子動力學。成像技術的不斷進步和熒光探針的設計增強了電源的這種做法,並確保其未來在現代生物學中的一個重要工具。儀器儀表的技術和觀念上的進步,也可能推高時空分辨率的新限製,以及完善的模式在目前使用的熒光顯微鏡。的幾個最近推出的方法,如受激發射損耗的4Pi顯微鏡,看來是有前途的活細胞成像的技術,但其在生物應用中廣泛使用的潛力還沒有被建立,並且有限製的厚度可接受的標本。然而,在最後的分析中,技術服務和所需的專業知識與目前可用的儀器進line了成功的活細胞成像實驗的可能性很大,甚至有可能進步,仍然存在著許多障礙。



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