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奧林巴斯顯微鏡:DIC顯微鏡的基本概念

2013-10-16  發布者:admin 

活細胞等透明,未染色的標本往往是難以觀察到,在傳統的明照明下使用全孔徑和分辨率的顯微鏡的物鏡和聚光係統。,首先在20世紀30年代開發的釉澤尼克相襯,經常使用這些具有挑戰性的標本圖像,但該技術受到暈文物,被限製到非常薄的樣品準備,不能利用充分聚光鏡物鏡孔。

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基本差幹涉對比(DIC)的係統,在1955年首次由Francis史密斯設計,兩個渥拉斯頓棱鏡附加的,一個聚光鏡的前焦平麵的變形的偏振光顯微鏡物鏡的後焦平麵的第二上麵的(參見圖1)。幾年後,喬治諾馬斯基,波蘭出生的法國物理學家,修改了標準的的沃拉斯頓棱鏡配置使這些極其薄的光學元件的物理位置遠離光圈共軛平麵。

微分幹涉對比顯微鏡的光學元件不掩蓋或以其他方式阻撓的物鏡聚光鏡孔(如相或霍夫曼調製對比),從而使儀器能夠被完整的數值孔徑。其結果是分辨率顯著改善(尤其是沿光軸),消除暈文物,並有能力產生極好的圖像比較厚的標本。此外,微分幹涉對比產生一個圖像,可以容易地控製使用的數字視頻成像技術,以進一步增強對比度。

1中顯示的是典型的微分幹涉對比配置為一體的現代化還配備熒光照明的透射光顯微鏡。基本的光學計劃類似於一個傳統的偏光顯微鏡加裝專門分光棱鏡。甲插入聚光鏡之前和之後的物鏡的光學路徑的偏振器和分析器。(改性渥拉斯頓或利用Nomarski)幾個光束分離棱鏡設計,以適應具有不同的焦距和光圈尺寸的聚光鏡安裝在轉台組件的物鏡,而一個單一的利用Nomarski棱鏡(兼容所有物鏡式樣)駐留在一個滑塊幀定位在物鏡轉換器。這些輔助部件的相對的光的方向和順序定位也表示在圖中。

與相襯,微分幹涉對比標本光學路徑長度為振幅的差異,可以提高對比度,可視化產生的圖像轉換梯度。的檢體的光程差是由折射率差之間的檢體及其周圍介質中,經過的光束的光路上的兩個點之間的幾何距離(厚度)的商品。微分幹涉對比顯微鏡的圖像有一個獨特的影子投外觀,仿佛他們是從一個非常斜的光源從單一方位照亮。不幸的是,這種效果,往往呈現標本中的偽三維浮雕,由不知情的顯微鏡技術經常被認為是實際地形結構的一個指標。

微分幹涉對比顯微鏡不同於傳統的雙光束幹涉儀器的情況,在很大程度上是一種定性的而非定量的技術。標本進行采樣,由兩個緊密間隔的部分相幹的,但正交的,分隔的波陣麵的距離稍稍下方的顯微鏡的橫向分辨率。由於采樣光束和參考光束遍曆試樣類似的區域(和/或周圍介質),該密閉空間的間隔距離小於2微米,DIC,因此無法產生精確的測量試樣的折射率或厚度。相反,該技術可用於確定相梯度方向,並充分利用物鏡光圈超越眼前的焦平麵標本功能定位的模糊幹擾產生薄的光學部分。

微分幹涉對比中采用的波對所產生的來源於鎢燈絲的平麵偏振的相幹光的波陣麵的雙折射分束器(無論是一個的渥拉斯頓或利用Nomarski化合物棱鏡)的動作的前焦麵的顯微鏡聚焦到聚光鏡(分束器的位置)。當由分束器產生的一對相幹光遇到相位梯度,由於折射率和/或厚度的變化,將成為變形和每條射線在遍曆試樣時,遇到一個稍微不同的光程差。剛剛從檢體時,光線將是不相等的相位。的光程差是翻譯由DIC顯微鏡目鏡中觀察到在最終圖像中的振幅變化成。然而,從簡單地檢驗圖像,它是不可能的,以確定是否在試樣的相位梯度的折射率或厚度(或兩者)的差異的原因。這種不確定性是由於這樣的事實:折射率和厚度的產品是來自於光程差,缺乏任一數量的獨立的信息,原產地的差異,不能確定。

光束分離棱鏡的試樣通過相位梯度所產生的波陣麵後,通過微分幹涉複合第二棱鏡和分析器(另一個偏振片)的梯度,得到高對比度的再現。依賴於試樣的采樣光束和參考光束之間的相位差,振幅變化的基礎上產生一個圖像的兩個微分幹涉對比,相位相反的。相襯圖像轉換從試樣衍射光波和參考光束通過聚光鏡的環形帶,試樣和相位板之間表現出的相位變化的振幅信息。DIC圖像的區別,但是,對應於數學的一階導數的大小,從試樣得到的光程差的梯度分布,而不是。

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DIC的顯微鏡的光路中的梯度和強度分布之間的關係示於圖2。圖2a)中提出的標本是一個環形的人紅細胞微分幹涉對比與剪切軸由雙箭頭(西北向東南)表示在高放大倍率成像。的光程差(縱軸)的詩句甲積紅細胞的直徑沿剪切軸(橫軸)是圖2b)中所示。需要注意的是光路配置文件反映了薄中心厚邊展出人體紅細胞。跨微分幹涉對比度的圖像,非常密切的對應的光程差曲線(圖2b)),當添加到一個恒定的一階導數,在圖2c)的強度掃描。正麵和負麵的道中的紅細胞的光路配置文件生成區域的較高和較低的幅度,分別在一階導數的掃描和相應的微分幹涉相襯圖像。的光程差分布的區域的,沒有表現出的斜率變化為背景,以有相同的強度對應的光程差的一階導數的積的基線。

微分幹涉對比光學配置

戰略布局的精確匹配的光學元件(或)共軛附近的飛機和其他的特定位置,於顯微鏡微分幹涉對比(參見圖1)的配置方案是必不可少的。所有的主要製造商提供高品質,精密DIC的光學配件,往往在銷售工具包,為他們倒正派研究顯微鏡。在一般情況下,隻有四種基本組件都需要配置研究或標準實驗室的明視野顯微鏡觀察,微分幹涉對比:

· 線性偏振器 -插入到在顯微鏡光端口(或後的任意位置的照明光源聚光透鏡)和聚光透鏡組件(參見圖1和圖3)之間的光學路徑中,該組件被設計為產生必要的平麵偏振的光幹擾的成像。振動麵的電矢量分量的透射軸被定向在一個東-西的方向(從右到左,在顯微鏡前站立時),典型的一個標準的偏光顯微鏡。某些微分幹涉對比設計包括一個旋轉偏振器結合為四分之一波長的相位差板,在此位置在顯微鏡。同時,這些組件被稱為一個Sénarmont補償,並設計用於調節圖像的對比度,如隨後將要討論的,以提供更精確的控製。

· 聚光鏡渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡 -為了分離成兩個部分偏振光從偏振片發出的,一個專門的光束分離棱鏡(通常稱為為聚光鏡棱鏡)被置於聚光鏡光圈光闌孔徑的共軛焦點麵或其附近的如在圖3中示出。事件平麵偏振光波前分割(或剪切)到相互垂直正交偏振分量(稱為普通非凡的波前)沃拉斯頓棱鏡諾馬斯基。

· 物鏡利用Nomarski棱鏡 -後麵的物鏡位置(圖3),可以在一個可調節的滑動框架或固定安裝,第二光束分離棱鏡采用重組剪切的波陣麵的共軛麵的物鏡後孔徑。此組件,這是至關重要的幹擾和圖像形成的元素,也被稱為物鏡棱鏡。在大多數情況下,在聚光鏡物鏡焦平麵下棱鏡的設計和光學特性不同,以確保幹涉顯微鏡孔徑平麵光學共軛的平麵重合。

· 分析儀 -第二線性偏振物鏡棱鏡後麵,通常安裝在顯微鏡物鏡轉換器之間的中間管和觀察(目鏡)管。稱為一個分析器,該偏振元件位於前管透鏡(無限遠校正的顯微鏡)和圖像平麵(圖3)中的光學路徑。該分析儀的方向(北-南)的電場矢量垂直於的台下偏振器的透射軸。圓形和橢圓偏振光,通過分析儀和隨後到達從物鏡棱鏡通的組件進行幹擾產生DIC圖像中間顯微鏡影像平麵(目鏡固定膜片或相機係統投影鏡頭光圈)。

當渥拉斯頓和/或利用Nomarski棱鏡從微分幹涉顯微鏡的光學路徑中刪除,光學配置相當於調整的最大消光(正交偏光)的標準偏振儀器。由於DIC技術依賴於平麵偏振光,雙折射標本或緊張光學元件,可幹擾圖像強度,生產未聚焦的明亮區域,否則暗(或黑色)背景。出於這個原因,DIC顯微鏡的配置應采用無應變的物鏡和(優選)聚光透鏡元件。標準顯微鏡物鏡通常包含應力簽名的鏡頭坐騎緊張,閉塞和雙折射的不均勻性,在鏡頭產生的玻璃。這些缺陷往往會導致降低的對比度水平,它可以產生嚴重的後果的最終圖像的保真度。此外,分離的波陣麵的接近(略小於衍射限製的分辨率)需要高精度的顯微鏡物鏡的規格,特別是在大的放大倍數,為了實現這種技術的能力的完整分辨率。

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3給出了通過一個典型的DIC顯微鏡的光學列車是一種理想化的主要組件和光路的概略圖。透過偏振片射出的局部區域的燈絲通形成直線偏振光方向平行的軸線的相幹波陣麵由相鄰的​​偏光元件(相對於45度的頁麵的平麵)的雙箭頭所示。渥拉斯頓組合棱鏡位於聚光鏡上的前焦麵的偏振波陣麵會聚。

由棱鏡(下麵討論),剪切後得到的正交或相互垂直的波陣麵被示為一係列的紅色雙箭頭(波前平行於頁)點和藍點(波前垂直於頁麵)。一旦他們所走過的光路梯度標本中,波前聚集的物鏡和收斂後焦平麵,第二沃拉斯頓棱鏡定位。重組的波陣麵,然後穿過第二偏振器(分析儀),其中偏振元件相對於子聚光鏡型偏振器(90度)的左側的黑色雙箭頭所指示的透射軸的方向與。注意聚光鏡棱鏡成像到圖3中的物鏡棱鏡,所以,在每一點上的棱晶(相對於彼此反轉)沿表麵相匹配的波前的剪切。翻譯沿剪切軸(垂直於顯微鏡光軸平行於頁,如下麵所討論的)的任一棱鏡產生的波陣麵的不匹配是均勻的跨顯微鏡孔徑。

沃拉斯頓和諾馬斯基棱鏡

雙折射的沃拉斯頓和/或諾馬斯基棱鏡插入在光學通路與剪切軸取向成45度角(西北向東南),偏光器和分析儀。兩個精密研磨和拋光的板坯生產的高品位的光學石英,單軸雙折射晶體楔形棱鏡組成的。必須製作兩個石英楔具有垂直方向的光軸,以產生一個單一的渥拉斯頓棱鏡(或利用Nomarski)。楔形件上麵的斜邊膠合在一起,以產生光學各向異性的複合板,其中的第一楔形晶體的光軸垂直於光軸的第二楔形。入射的直線偏振光進入棱鏡的偏振光以45度的角度,在與光軸取向在聚光鏡孔徑的波陣麵被劃分成兩個獨立的正交波,稱為普通特殊的波。

相互垂直的不尋常和普通的組成部分的波陣麵是一致的,在相同的方向上具有相同的幅度(70.7%的原來的極化波),以及旅遊,通過渥拉斯頓棱鏡的下半部分。然而,波以不同的速度傳播,由介電性能的低雙折射石英結晶楔的沿軸和快軸的定義。普通波通過棱鏡所得的快軸方向(具有低的折射率),而通過慢軸,它具有更高的折射率的非尋常光的行進。石英,快軸和慢軸之間的折射率差約為0.6%,和快軸的取向垂直於晶軸的楔形。因此,普通的波穿過石英楔部,而垂直於光軸的方向平行於該軸的異常波。

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膠結石英楔子,剪切角的角度定義為空間上分開的波成為上麵的折射率之間的交界處發生的波陣麵的角度分割或剪切。在這個邊界,普通且平凡的波也交換身份(圖4)。一個波陣麵(普通)從低折射率的介質傳播到較高的折射率的第二介質(上楔塊)和彎曲朝向的法線(垂直於的楔子光軸的),根據斯涅耳定律。秒的波陣麵(特別)離開高折射率的介質進入的第二介質的折射率低,彎曲的波前相差的正常,但作為第一個波陣麵在相同的角度。

剪切角和分離距離是恒定的整個麵部的棱鏡的所有事件的波陣麵,無論的入口點。波陣麵的剪切的方向被定義由棱鏡剪切軸,在於渥拉斯頓棱鏡的平麵是平行的光學軸(晶體學)的的石英楔部的下(如圖4中所示)。其結果是,將一個進入Wollaston棱鏡的偏振波陣麵的剪切軸方向平行的方向,而另一種是麵向垂直於該軸。剪切角是由棱鏡組件的設計(石英楔角,不到一定程度的電弧),並在顯微鏡中無法調整。然而,剪切距離為分鍾(通常小於一個微米),沒有可觀察到的光束分離發生在從棱鏡射出。

在旅途中通過較低的石英楔子在渥拉斯頓棱鏡,普通和特殊的波陣麵遇到不同的折射率,如上所討論的。其結果是,在普通的波陣麵通過比非凡的波陣麵的晶體在一個較高的速度傳播。於石英楔子的下限和上限之間的界麵的波陣麵的交換身份時,普通的波陣麵的變成非凡的波陣麵的,反之亦然。此外,波陣麵時,通過下部和上部的一半的渥拉斯頓棱鏡的幾何路徑是相同的,經過棱鏡的下半部分中的相移(由於折射率差),在上半部完全補償(圖b)段)。離中心體驗的旅程,通過較長的下棱鏡楔前被剪(圖4C)),或上楔形剪切後(圖4a)),在退出之前穿過棱鏡的波陣麵。由波陣麵擴展的距離通過單棱鏡楔最終使波(無論是普通的(圖4a)條)或非經常性(圖4c))領先於其他到達石英空中接口橫向麵的棱鏡,每單位長度的恒定相移發生在剪切方向上是相等的,但相反的,普通和特殊的波陣麵(圖4a)和圖4c)),一端非凡的波陣麵的棱鏡,提前出現的普通的波陣麵,而在相應的位置上的另一端,普通的波陣麵射出棱鏡之前的非同尋常的波陣麵。

如果剪切軸平行的方向上的渥拉斯頓棱鏡的入射偏振光的波陣麵,然後正交分裂的波前將不會發生,直線偏振光,會出現從棱鏡。同樣地,如果入射的偏振光的波陣麵的方向垂直於棱鏡剪切軸,它也將出現從棱鏡相對於取向不變。理想的情況下(和所需的微分幹涉顯微鏡)發生時,入射的偏振光的波陣麵以45度的角度的棱鏡的剪切軸的取向。電矢量的直線偏振光進入從這個角度一分為二成兩個分量矢量,每個振動的快或慢的石英晶體軸線的平麵,並具有(70.7%)的根均方原來的波陣麵的振幅。兩個沃拉斯頓和諾馬斯基的棱鏡表現出定向依賴特性。準直的線偏振光束,在一個45度角進入對麵的棱鏡,(這次從頂部)也將產生正交平凡和普通的波陣麵。然而,極化波將顛倒過來。

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渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡時被夾在兩個交叉的偏振器之間,並檢查與透射光通過兩個偏振器,棱鏡,平行與一個主要的中央的黑色帶(邊緣)(圖5中所示),可以觀察到的幹涉條紋的圖案。這些模式的結果之間的斜高亢的普通且平凡的波陣麵棱鏡的臉出現的幹擾。的外圍邊緣的左側和右側的中央暗幹涉條紋,顯示的經典偏振幹涉色譜的日益增加的訂單。專為物鏡,具有不同的焦距和數值孔徑棱鏡楔切越來越淺的角度(放大倍率和數值孔徑增加)產生較窄的幹涉條紋綁紮。圖5為一係列的固定利用Nomarski棱鏡設計的連續的較高的物鏡的放大倍數(圖中所示)上的右手側示出這個概念。

如果一階補償器(紅板)被添加到在對角位置(圖5中未示出)的交叉偏振器夾心,被替換為黑色條紋表示減法(黃色)在一邊和另外(藍色的幹涉色)原來的暗條紋的位置的另一側。添加的第二沃拉斯頓或利用Nomarski棱鏡頂部的第一相移補償(以及由此產生的幹涉條紋)的第一棱鏡的整個長度上,導致消光(如圖5中所示,注意才能觀察到,這種影響,如果實驗有兩個棱鏡相同的剪切角)。翻譯棱鏡相對於其他橫向均勻的偏置,或路徑長度的變化,將被引入,可以觀察到(圖5)通過三明治。在一個方向上滑動棱鏡將變暗,然後減輕棱鏡,在另一個方向上滑動的同時,將產生一係列均勻的幹涉色(從黃色一階)。

夾在兩個偏振器之間利用Nomarski棱鏡觀察到的幹涉條紋出現浮在空間上方幾毫米,棱鏡。然而,當相同的條紋被視為使用Wollaston棱鏡,它們似乎在於內部的棱鏡。利用Nomarski和渥拉斯頓棱鏡的幹涉條紋的位置被稱為幹涉平麵。因為在傳統的渥拉斯頓棱鏡的幹涉平麵被定位在棱鏡的中央部,在約中心線之間的楔形件(圖6),它是難以適應沃拉斯頓棱鏡的使用與標準的顯微鏡物鏡。該問題是因為棱鏡的幹涉平麵必須一致,並且重疊的後側焦點麵(也稱為衍射麵)的物鏡,這往往在於以下的玻璃透鏡元件的內螺紋安裝。

大多數製造商規避的物鏡孔徑間隙問題通過采用諾馬斯基(偶爾被稱為改性沃拉斯頓)棱鏡聚光鏡物鏡焦平麵梁剪切和重組的職責,分別。由於一個專門設計的,如下麵所討論的,利用Nomarski棱鏡的幹涉平麵位移到一個站點以外的棱鏡,而不是在傳統的沃拉斯頓設計的楔形元件跨越幾個毫米。利用Nomarski棱鏡不要求物理上位於物鏡聚光鏡焦平麵,但可以定位一些距離。利用Nomarski棱鏡雖然不產生更好的對比度,它們避免了潛在的問題,幹涉條紋變得不可見視。應該指出的是徠卡顯微一旦產生一種流行的顯微鏡被稱為史密斯的T微分幹涉對比係統,其中納入標準的渥拉斯頓棱鏡到特別設計的物鏡。然而,這樣的設計策略是罕見的例外,而不是規則。

利用Nomarski棱鏡,像一個Wollaston棱鏡,由膠合在一起為斜邊的兩個光學石英楔子。楔常規渥拉斯頓石英楔子是相同的,並具有的光軸取向平行於棱鏡表麵。然而,修改的第二楔形切割石英晶體,以這樣的方式相對於平坦麵的棱鏡的光軸傾斜的方向。當楔塊相結合,形成複合棱鏡的雙折射,在焦平麵(和幹涉條紋的產生當偏振光通過棱鏡時)之外的棱鏡板中,如上所述,如圖6所示。產生這種情況的,因為現在的剪切發生在空氣 石英界麵的下楔塊,石英楔之間的界麵處的折射導致剪切的波陣麵的銜接交叉點以外的棱鏡。利用Nomarski棱鏡焦平麵的實際位置可以調整超過幾個毫米的範圍內,通過改變在第二石英楔子用來構造棱鏡的光軸的傾斜角度。

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盡管利用Nomarski棱鏡廣泛為物鏡棱鏡,在現代微分幹涉相襯顯微鏡,有較少的電容式棱鏡的空間的限製,而這往往是孔徑平麵內精確定位。因此,常規的渥拉斯頓棱鏡有時可以被插入顯微鏡聚光鏡,但在許多情況下,利用Nomarski棱鏡代替。在聚光鏡中被利用時,利用Nomarski棱鏡,棱鏡的設計,以產生幹涉平麵位於更接近於棱鏡比用於與物鏡構成。其結果是,除了被安裝在具有不同幾何形狀的幀,利用Nomarski棱鏡發現在現代DIC顯微鏡不同的被切斷,並且是不可互換的。總之,對於微分幹涉顯微鏡,聚光鏡棱鏡(也稱為作為次要的輔助補償的複合棱鏡)作為一個主剪切分束器的偏振波陣麵的物鏡棱鏡(主體棱鏡),而重組的分離波和調節的程度低下之間的平凡和不平凡的波陣麵。

重要的是要記住,對準顯微鏡科勒照明是一個重要和必要的步驟,以確保正確的定位,利用Nomarski棱鏡幹涉平麵與聚光鏡物鏡的共軛孔徑平麵重合。中央,或零階的幹涉條紋,這是觀察時,利用Nomarski棱鏡被放置在交叉的偏振器(如上麵所述),可以用於在顯微鏡的取向,以確定正確的方向的棱鏡。

DIC波前關係和圖像形成

從所述聚光鏡的渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡的孔徑平麵出現後,剪切的普通和特殊的相幹波陣麵聚焦透鏡元件的檢體之前,由物鏡收集聚光鏡和穿越。沿著它們的軌跡在聚光鏡物鏡之間保持相互平行地,波陣麵分離由來自聚光棱鏡的幾何約束進行的剪切距離。波陣麵(剪切的距離)之間的空間距離隨聚光鏡和物鏡的數值孔徑,但現在在0.11.5微米之間的實際的限製,被設計為稍小於(或等於在某些情況下)的橫向分辨率的線性範圍的物鏡。微分幹涉對比分辨率可以增加(在對比度為代價的)通過減少剪切距離大約一半的物鏡的最大分辨率。

大多數顯微鏡製造商上的剪切與距離分辨率和對比度權衡妥協,產生棱鏡有一個最大的剪切距離約0.6微米較低倍物鏡(10倍)下降到最低接近0.15微米的高倍率物鏡(60X100X)。不管剪切距離,然而,重要的是要注意,緊密間隔的波陣麵的對,空間上分布在整個顯微鏡的光圈,樣品試樣的每一個點在圖像平麵上的雙光束幹涉,以最終提供。

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當受到檢體的存在下,相幹波前對遇到相同的試樣和圖像平麵之間的光程差,到達物鏡的後側焦點麵,具有相同相位的關係,當他們離開聚光鏡。利用Nomarski棱鏡位於後麵的物鏡重組的波陣麵在物鏡的焦平麵,以產生具有台下偏振器的透射軸相同的方向電矢量振動的直線偏振光。阻止通過第二偏振片(或分析儀)的偏振器(圖7a)和圖7b)),它具有一個透射軸取向垂直於退出物鏡棱鏡的線性偏振的波陣麵。其結果是,出現在視場中觀察到的圖像的背景很暗或黑,簡稱為消光的條件。

沒有試樣引起的相移,聚光棱鏡的光束分離動作的精確匹配,逆轉的物鏡利用Nomarski棱鏡最終產生直線偏振光束重組效果。換句話說,當在顯微鏡科勒照明(高分辨率微分幹涉顯微鏡的重要先決條件)而正確的配置,聚光鏡物鏡的協同運行,投射圖像到物鏡棱鏡的光源和聚光棱鏡。物鏡利用Nomarski棱鏡,方向反轉相對於聚光鏡棱鏡,介紹了精確地補償由聚光棱鏡產生的波陣麵之間的非線性相移的相移。這個動作發生的所有配對的波陣麵在整個顯微鏡光圈。聚光鏡物鏡棱鏡的軸以45度角度的交叉的偏振器(偏振器和分析器)的透射軸相對於彼此的取向為平行。兩個棱鏡的取向軸的被稱為剪切軸,一個重要的概念,定義的時候,他們離開聚光棱鏡的普通和特殊的波陣麵的軸線之間的橫向間隔,直到它們被由物鏡棱鏡複合到達圖像平麵。

波前畸變在發生相幹成對的波陣麵遇到標本中存在的相位梯度,而通過從聚光鏡物鏡,被誘導的波將經過沿剪切方向的相移,並遍曆稍微不同的光路(雖然沒有變化極化而發生)。當到達物鏡棱鏡,相移成對的波陣麵被重新組合,以產生橢圓偏振光(在相反的直線偏振光,在沒有製作的標本)。電位移矢量所得到的波陣麵,而不再是平麵的,掃出一個橢圓形的通路,因為它穿越的物鏡棱鏡和分析儀(圖7c)中示出)之間的區域。因為分析儀的透射軸平行的橢圓形的波陣麵的一個組成部分,通過分析儀的波的某些部分,並產生具有有限的幅度和最終能夠產生圖像平麵中的強度的平麵偏振光。

總之,試樣中的光路梯度引起的相移,在配對的相幹波陣麵的剪切由聚光棱鏡,通過對平行的軌跡。這些相移被翻譯成由物鏡利用Nomarski棱鏡的相位差,創建橢圓偏振光,是能夠通過線性成分通過分析器創建映像。事實上,在整個試樣字段,創建的相位梯度的存在或不存在線性和橢圓偏振的波陣麵,有選擇地通過其振動平麵的方位角的分析裝置的組合。可以通過分析儀的波陣麵都是平麵平行的,並可以產生一個試樣的振幅圖像,通過在圖像平麵上的幹擾。當物鏡棱鏡精確地補償聚光鏡棱鏡(因為它在科勒照明)的影響,分析儀塊的波陣麵在源自該字段的所有空間位置的缺乏(沒有檢體相的梯度)的相移。由此產生的背景是暗視場觀察(參展總滅絕)的異常陡峭標本折射率或厚度梯度,這似乎更亮(通常以大綱形式)的區域顯示。形象出現的經典,簡單,暗場照明技術所產生的圖像非常相似。

這些概念被描繪在圖8中,其中提出後通過相試樣(具有較高的折射率比周圍介質中),和它們相應的振幅(或強度)的配置文件在圖像平麵的剪切波陣麵之間的相位關係的圖形。相互垂直的波陣麵(標記為Σ(1Σ(2) ,請參閱圖8a)),通過試樣的扭曲,並顯示局部區域的相位延遲(稱為差分相位延遲)。的物鏡利用Nomarski棱鏡重組取消引入由聚光棱鏡的角波剪切的波前的波前變形的過程中產生的橫向位移。波前畸變型材(平凡和普通的組件)在圖像平麵重建沿剪切軸線的說明在圖8a)在雙棱鏡儀器配置已經調整到最大的滅絕。試樣引入的波陣麵的相位延遲(φ)表示的剪切軸(x)的浸沿的寬度,而在縱坐標上(以納米為單位)表示放大的試樣直徑(在這種情況下,一個單一的液滴的油狀物)。

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在圖8a)的波陣麵的相位滯後後已發送通過分析器團聚在圖像平麵和相消幹涉,由此產生的強度分布沿剪切方向(圖8的振幅積可以表示為( b)段)。對於本例中考慮對稱的油滴標本,作為剪切軸之間的距離的函數的振幅的積產生暗的兩側是明亮的區域(參見圖8b))的中心空腔。數字圖像的實際標本在顯微鏡下觀察(圖8C))顯示明亮的邊緣疊加在黑色的背景和暗幹涉條紋帶中心的球形微。圖8中的圖像被記錄在一個直立顯微鏡光學係統的配置與DIC。倒立組織培養顯微鏡產生基本相同的結果,但是,中央幹涉條紋二等分的半球狀的油滴將定向為垂直於圖圖8c)中所示的那些。

介紹偏置遲緩的

調整最大的滅絕在微分幹涉對比顯微鏡,視場呈現一片漆黑,幾乎是黑色的,背景,表現出非常高的靈敏度標本地區,同時具有增加和減少相梯度。圖圖8c)中所示,一些標本細節模糊或非常困難的,以解決在此配置中,可以遍曆突出的特點,常常可以觀察到的幹涉條紋的零級。在實踐中,物鏡利用Nomarski棱鏡沿剪切軸的橫向偏移量,均勻地轉移通過試樣的普通和特殊的波陣麵的相對的相位位移。因此,從物鏡棱鏡出現的光的偏振矢量方向可以調整,從線性到各種程度的橢圓形,甚至圓形。相對於普通的波陣麵的相位移的轉移的非凡的波陣麵通過翻譯的物鏡棱鏡通常被稱為偏置相位差DIC的顯微鏡的介紹

物鏡利用Nomarski棱鏡橫向移動(或者左側或右側的顯微鏡的光學軸),波前對背景越來越滯後的相位與相對於彼此。其結果是,在進入分析儀的波陣麵的橢圓偏振的程度增加,背景強度逐步轉換從黑到介質和較輕的灰色陰影。此外,引入的偏置相位差的變化的零級幹涉條紋的位置,並產生相應的變化,在該樣本中的相位梯度的強度水平。這些取向依賴目前較亮的背景顏色通常被稱為零階灰度明亮的區域和黑暗的陰影疊加產生的結果。最終DIC圖像不依賴於被引入完全通過翻譯的物鏡棱鏡的光程差,並沿顯微鏡光軸聚光棱鏡時,可以得到相同的結果。然而,在大多數儀器,它是更為方便的產生偏置相位差,通過移動的物鏡的位置,而不是安裝在聚光鏡中的炮塔的棱鏡的棱鏡。

通過改變偏置相位差引入到試樣發生亮度梯度沿剪切軸的聚光鏡物鏡棱鏡,一般出現源自以45度角(西北部到東南或反之亦然)時,觀察到的試樣目鏡(參見圖8f)條)。請注意,在圖8中所示的梯度(六)被記錄,與一個正立顯微鏡。倒置顯微鏡生產強度梯度,麵向垂直直立顯微鏡中觀察到的那些。在一個方向或另一個會影響幹涉條紋偏移和改變普通和非凡的波陣麵之間的相位關係(智障或高級),從而扭轉了陰影投在試樣方向移動棱鏡。

引入偏置相位差的淨結果是使試樣在偽三維浮雕圖像增加光程差(傾斜的相位梯度)的區域出現明亮的(或暗),和那些表現出路徑長度減小出現在反向。試樣的功能出現類似的高原升高或凹陷的凹部,根據相位梯度方向,這是一個顯著特征的微分幹涉對比。然而,三維外觀隻對應相梯度,不應該被混淆與實際試樣的幾何形狀(如過於頻繁的情況下)。在某些情況下,實際的地形特征也是不斷變化的相位梯度的網站,但作為獨立的調查的結果,獲得的信息的情況下,這個事實不應假定。

在微分幹涉顯微鏡的偏置相位差簡介圖圖8d)中示出通過圖8f)就組成的多個半球狀的油滴的相位標本。當在顯微鏡調整最大消光,顯示普通和特殊的波陣麵沿剪切方向的相移,但不表現出背景的對應的區域(圖8a))的相位差。翻譯的物鏡棱鏡的偏置相位差此外一個波陣麵之間的相對相位移位相對於其他的(圖圖8d)),但保持相同的波陣麵的剪切。幹擾的像麵,產生的振幅(或強度)的積,作為剪切距離的函數(圖圖8e))後,顯示一個明亮的邊緣區域的一側上的油滴和暗區域的相對側上。在顯微鏡中觀察時,試樣顯示出陰影鑄態的外觀,就好像它是從一個高度傾斜的角度(參見圖8(六))照射。為了觀察最大消光之間的差別,除了偏置相位差,比較試樣圖像呈現在圖圖8c)及(f)。的陰影的方向,這是依賴於剪切軸(圖8中的(c)和(f)段),在相反的方向上按相同的量的物鏡棱鏡翻譯可以扭轉的雙頭箭頭。

偏置已翻譯物鏡利用Nomarski棱鏡沿著光軸來回使用微調旋鈕位於端的安裝框(通常放置在顯微鏡的物鏡轉換器殼體或中間管)引入傳統的微分幹涉差顯微鏡。一種替代技術,這是日益深入人心,是四分之一波長相位差板的安裝在固定的方向之間的偏光器和聚光鏡的棱柱(稱為Sénarmont DIC補償)。最大消光,相位差板的快軸與偏振器的透射軸對齊,兩個光學單元可以是(往往都是)的基礎上,在顯微鏡的同一殼體內包含。去Sénarmont補償器的備用位置,在顯微鏡配備適當的中間管的物鏡棱鏡和分析儀之間。

為了使引入的偏置使用去Sénarmont補償器,偏振器的透射軸旋轉(加或減45度)的相位差板,保持固定在一個90度角相對於分析儀的快軸相對於傳輸軸。當補償器的快軸相一致(平行)與偏振器的透射軸,隻有直線偏振光通過通過去Sénarmont補償器的聚光棱鏡。但是,當偏振器的透射軸旋轉時,從四分之一波長的相位差板的過程中出現的波陣麵成為橢圓偏振光。旋轉偏振器在一個方向上會產生右撇子的橢圓偏振光,旋轉的同時在另一個方向上的偏振器將改變矢量軌跡生成一個左手係的橢圓掃描。

dic intro figure9

當起偏器的透射軸的方向達到無論是加或減45度(相等於四分之一波長的相位差),補償器的光通過圓偏振光(再次在任何一個慣用左手或右手的意義上)。因為橢圓或圓偏振光代表的普通和特殊的新興的從去Sénarmont補償的波陣麵之間的相位差,偏置引入到係統的波前進入聚光鏡棱鏡和剪切。正偏壓時,得到的偏振片在一個方向上旋轉,而通過在相反的方向旋轉偏振器引入負偏壓。

不管偏置是否被引入到翻譯的物鏡利用Nomarski棱鏡或旋轉的偏振片上解Sénarmont補償由一個微分幹涉對比係統,最終結果是相同的。正如前麵討論的,在一個正確配置的顯微鏡,科勒照明,圖像的光源和聚光棱鏡是由光學係統(聚光鏡物鏡)轉移到位於上麵的物鏡的後側焦點麵倒立的第二利用Nomarski棱鏡對準。整個麵部的聚光棱鏡的線性相移被精確地補償由一個相反的相移在物鏡棱鏡。翻譯的物鏡棱鏡沿剪切方向不改變的相移分布,而是,添加或減去一個恒定的相位差在整個顯微鏡的光圈。旋轉在去Sénarmont補償偏振器中相同的方式,還引入了一個變量,並控製相位差。匹配的棱鏡係統使圖像形成發生與每一個波前對投影來自聚光鏡的孔徑相同的偏置電壓的相位差,不論路由通過它穿過試樣到達物鏡

如圖9所示的是一係列的數字圖像記錄在DIC使用偏置在一些中間步驟中的二十分之一到四分之一波長的相位差範圍。樣品是15微米邊的固定和安裝小鼠小腸包含波動厚度的區域。的試樣細節和陰影鑄的偽三維效果是最顯著的在較低的偏置相位差值(圖9a)和圖9b)),但細標本細節的對比度和清晰度都惡化,作為偏置相位差的移交增加(圖9c)到9f)條)。在偏置遲緩最高值(四分之一波長;9F)),對比度極差,極少數的結構細節可見。對於這個特殊的試樣,最佳相位差範圍介於的二十分之一的波長的十二分之一。

作為光路梯度增加的標本,因此圖像對比度。改變偏置相位差在不同程度上也可以產生顯著的對比目鏡(圖9)中所觀察到的試樣中的波動。在一般情況下,誘導的翻譯的物鏡棱鏡,或通過旋轉在去Sénarmont補償偏振器之間的普通和特殊的波陣麵的位移,是最佳的程度上的順序小於十分之一波長。但是,該值是在很大程度上依賴於試樣的厚度,有用的範圍的生物樣本的偏置相位差之間的三十分之一和四分之一波長。對比標本中具有非常大的光學梯度往往可以受益於更大的偏置相位差值(全波長)。成一個微分幹涉對比顯微鏡使偏置遲緩階段更容易被觀察的標本,並與傳統的膠片或數碼相機係統,極大地方便了成像努力。

DIC顯微鏡補償遲緩板

偏置微分幹涉對比普通和特殊的波陣麵之間的相位差,也可以通過使用最初的物鏡作為定量的相位差測量裝置和偏振光顯微鏡的對比增強元素的補償操作。補償板賦予更大的控製,用於調整試樣的細節的對比度有關的背景強度和顏色值中,並且也能夠更精確地調整的波陣麵之間的偏差值。這些雙折射元件也經常采用的光學透明的標本的染色,通常呈現在有限範圍內的灰度值。

當一個標準的物鏡利用Nomarski棱鏡翻譯顯微鏡沿光軸的四分之一波長,這兩種試樣的功能,並獲得一個頻譜牛頓幹涉色偏振光顯微鏡中觀察到的相似的背景之外的路徑差。試樣和背景的顏色過渡,通過一係列的灰度值,通過白色,黃色,紅色,藍色和高階遷移變得光染色。光學染色產生的戲劇性和精美的彩色圖片,但對科學應用的用途有限。通常情況下,最佳的標本的對比被限製到二十分之一到四分之一波長的相位差的範圍內。

補償器可以插入到物鏡棱鏡和分析儀或偏振器和聚光鏡棱鏡之間的DIC顯微鏡的光學路徑。許多顯微鏡在中間管或為此物鏡而設計的台下聚光器殼體有一個插槽。另外的一階補償器(通常稱為全波一階的紅色板)具有等於全波長的可見光(約550納米),綠色區域中的延遲值,引入了頻譜的幹涉色檢體和背景。與補償器代替,綠色光無法通過分析儀,因為它從與偏振器的電場矢量具有相同的方向的線偏振光的相位差板。然而,在紅色和藍色光譜區域的波陣麵發生相位差小於一個波長,成為橢圓偏振光,使他們能夠通過分析器傳遞組件。其結果是,這些顏色混合形成的視場中的品紅色的背景。

因此,當試樣中觀察到的白色光微分幹涉對比光學係統和一階補償,背景顯示品紅色,而在將顯示在二階的藍色和黃色的顏色的一階(視方向而定)的圖像的對比度牛頓幹涉色譜。補償到位的翻譯諾馬斯基棱鏡(或旋轉偏光鏡在一個Sénarmont補償),具有大光學相位梯度結構中觀察到的幹涉色產生快速變化,小的變化獲得偏置遲緩的。這種技術是有用的顏色(光染色)引進具有高折射率的界限,如細胞膜,細胞內顆粒大,纖毛和細胞核的地區。標本功能顯示的幹涉色,可以比較在米歇爾征收的比色圖表獲得的估計值的光程差的值。

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在圖10中示出幾個透明的標本已光學染色,呈現在偽三維浮雕通過DIC的光學技術。圖10a)示出口的犬鉤蟲(犬鉤蟲),而圖10b)的特點是在突起的邊緣處的櫛魚鱗。圖10(三)大,豹紋蛾(Ecpantheria scribonia)的七彩翅膀上的鱗片。在所有情況下,利用Nomarski棱鏡被翻譯通過顯微鏡光軸的偏置相位差值,該值超過全波長。雖然這些圖像不顯示隱藏的科學信息有關的標本,他們這樣做有可能提前DIC的光學顯微鏡技術,作為一個合法的科學和藝術之間的橋梁。

開成一個微分幹涉對比光學係統引入偏置與解Sénarmont補償顯微鏡配備一個全波的相位差板可以被添加到光學染色試樣與牛頓的幹涉色,並提供更多的定量信息的路徑差。如上所述,Sénarmont補償經常采用DIC的顯微鏡取得的偏置相位差的精確測量的水平,但該設備也是有用的,監視對應的光學組件。在視頻的增強型DIC的顯微鏡,去Sénarmont補償往往利用優化對比度標本細節在於顯微鏡的分辨率極限以下。

DIC圖像的解釋

其中最顯著和廣受認可的微分幹涉對比顯微鏡獲得的圖像方麵是高度可見的浮雕,表現通過賦予偽三維寫實的陰影投效果。在一般情況下,標本出現,通過光從低角度與高度傾斜的光源,讓人聯想得到的結果與傳統的斜照明或霍夫曼調製對比。然而,謹慎,圖像應始終被解釋與理解的陰影和高光的影子投引渡相或光學路徑漸變指示標誌和坡向,不一定透露精確的幾何或地形參數。

從觀察在幾乎每一個產生的圖像通過偏置相位差的陰影鑄造定向本,光學剪切方向是明顯的,可以精確地定義為顯示的最高和最低亮度值的區域的軸線連接。應考慮的另一個考慮因素是檢體之間的關係及其周圍介質中,因為陰影的方向通常相反試樣具有較高或較低的折射率比周圍的詳細信息。其結果,致密的亞細胞顆粒,如細胞核,核仁,線粒體,細絲,中期染色體,,溶酶體通常顯示提出的海拔(小山頂)的外觀,而較低折射率的夾雜物(例如,吞飲小泡,水空泡,脂滴)似乎是凹陷的凹部(凹)。

檢體相梯度(偽立體感的程度)的微分幹涉對比賦予的對比度電平是翻譯諾馬斯基棱鏡或旋轉偏振器去Sénarmont中的,由該光學係統引入的量的偏置相位差的函數補償器。因為利用Nomarski和渥拉斯頓棱鏡的設計和其他約束涉及微分幹涉對比的波陣麵取向的剪切軸是固定的,不能被改變的軸線方向上影響標本的對比,通過一個簡單的顯微鏡上的設置。然而,普通和非凡的波陣麵之間的相對相位延遲是可以逆轉的搬遷物鏡棱鏡,從一個側麵顯微鏡的光學軸(偏置遲緩轉移由負轉正,或反之亦然)。此操作也可以通過旋轉偏振器上去Sénarmont的補償器的相應的負值。當相位延遲被改變如剛才所述,在試樣上的亮區和暗邊的方向扭轉180度。在本質上,可改變相對於試樣的剪切軸的顯微鏡的唯一機製是為調整試樣本身的一種手段,有利於從圓形360度可旋轉的階段(設計主要是為偏光顯微鏡)的利用率。

在微分幹涉對比度的圖像,陰影和高光強度是最大的沿剪切軸的顯微鏡,和恒定的折射率的顯示亮度值是相同的背景區域的。當檢查的試樣具有球形的幾何形狀(圖8f)條)從幾個方位接壤的背景邊緣的對比度,它被發現是最小的對比度區域中垂直於剪切軸。事實上,試樣和背景之間的對比度差異逐漸減小,直到他們到達定義的零級幹涉條紋(垂直於剪切軸)的軸線的方向中的最小值。在圖8c)和圖8f)中的試樣表現出最低級的對比度(無標簽的白色箭頭指示的)的區域,在中心區的邊緣正好垂直於剪切軸的油滴。為了驗證這個概念,比較幹涉條紋滿足的背景圖像中的記錄,可在最大消光(圖8c)條)的偏置相位差引入後生成的圖像中的相應區域的邊緣(圖8f) )。無標簽的白色箭頭標記的區域,普通和特殊的波前畸變對齊的配置文件,減去取消剩餘遲緩和屈服強度值完全匹配的背景分析儀。

在微分幹涉顯微鏡檢查每個試樣將有一個最佳的偏置相位差設定在最終圖像中產生最大的對比度水平。非常薄的試樣顯示一個淺的折射率梯度,如活細胞的培養,一般可使用同樣低的偏置設置僅稍大於最大的相移標本中存在(約一個波長的二十分之一的順序,或約30納米)。然而,較厚的標本往往需要較高的偏置設置(四分之一波長)大型聚光鏡孔產生令人滿意的結果,通常是通過光學切片。因為許多試樣組成的功能,顯示的各種不同的尺寸和折射率,最佳偏置相位差設置通常是一種妥協。

方位角微分幹涉對比一些試樣的取向現象的影響列於圖11。在所有情況下,剪切軸指向西北向東南,但並不表示對個人的數字圖像。圖11a)和11b)示出的毛孔及皮紋所表現出的安裝來自矽藻布紋attenuatum frustule周期間距。當長軸的frustule的取向垂直於剪切軸(圖圖11a)),毛孔合並成一係列緊密間隔的脊,單獨都沒有解決。與此相反中,剪切軸平行的方向上重新定位frustule揭示的旋鈕狀的幾何形狀的孔結構在這樣的物種。

dic intro figure11

含鰓排骨淡水水蚤(水蚤),圖11(三)胸部區域。在該取向中,各個肋結構都清晰可見(垂直於剪切軸線),並連接到一個共同的脊椎,顯示為剪切軸線平行的一長係列的旋鈕。當試樣旋轉90度(圖第11d)),許多肋結構失去對比度,脊髓旋鈕合並成一個單一的脊。最後,夾雜物在櫛魚鱗缺乏對比度和疊加在紋狀體棘(圖11E))時,很難區分。試樣的旋轉帶來的的棘平行剪切軸(圖11f)條),它們的對比度降低,使夾雜物清晰可見。

許多因素時,應考慮調整偏置遲緩,產生最佳標本的對比。水平偏差,必須引入最大限度地變暗一個斜坡或試樣邊緣也產生最大可能的試樣和背景之間的對比度。因此,對於每一個標本,一個特定的物鏡棱鏡(或取消Sénarmont的補償器)設置通常會引入最大程度的對比。超過此值時,對比度會降低。較厚的標本,經常遭受來自光散射文物,通常需要一個更大的偏置遲緩設置(全波長)比薄的標本獲得具有顯著的階段梯度地區滅絕。最後,當在聚光鏡中的可變光闌開口尺寸超過75%的物鏡後孔,減少過多的在光學係統中的光散射的結果對比。隨著這個困難時,請小心打開聚光鏡光圈以執行光學切片實驗。

光學切片

大型聚光鏡和物鏡的數值孔徑的微分幹涉對比標本圖像的能力,能夠創造顯著的淺光從一個集中的圖像部分。如果沒有光暈和側麵去掉從焦點從明亮區域分散注意力的強度波動的幹擾,該技術得到銳利的圖像,都整齊地從複雜的三維相位標本切片。此屬性通常利用取得清晰的輪廓,在複雜的組織細胞的光學部分的焦平麵上的上方和下方的結構以最小的幹擾。

在所有傳統形式的透射和反射的光鏡,孔徑光闌聚光鏡發揮了重要作用,定義圖像的對比度和分辨率。產生增強的對比度的同時,減小光圈的大小字段和整體圖像的清晰度增加了深度。但是,如果隔膜被關閉太多,衍射工件變得清楚和分辨率犧牲。通常情況下,最佳的光圈設置是準確地渲染足夠的對比度和保留圖像分鍾功能需要的分辨率,而避免衍射文物的標本細節之間的一種折衷。

高性能的微分幹涉差顯微鏡的光學係統與聚光鏡部分閉合的可變光闌(約70%的物鏡後的光圈大小)產生優異的對比度,而且還當膜片被打開以與物鏡孔徑大小相匹配性能極佳。為了實現光學切片分辨率和對比度之間的最佳平衡,必須正確地配置在顯微鏡科勒照明棱鏡元件和偏振器應精確對準。高數值孔徑物鏡設計用於浸油隻應利用圖像試樣滑動到聚光鏡的底部的油。

在高放大倍率和數值孔徑(例如,100倍和1.4),微分幹涉對比景深接近一個限製值,約400納米(0.40微米,約1.5倍的橫向分辨率極限的物鏡)。通過一個人口腔上皮細胞在高放大倍率(100倍物鏡)和數值孔徑(1.30)的中央區域所拍攝的圖12中所示的光學部分。該單元格是約3微米厚的附近的細胞核中,利用取得的圖像在圖12中為約0.5微米的配置和景深。細菌是清晰可見的單元格(圖12a))的上表麵上,是平行的,在膜旋轉脊非常相似的手感的人的指紋。甲隆起對應於細胞核膜在較低的中央部的圖中也可看到。當焦平麵被轉移到細胞內部(圖12b)條),核結構和細胞內顆粒變得可見。最後,在細胞膜放在顯微鏡載片上的表麵(圖圖12c))的下邊界,揭示許多折疊脊(的上表麵上所觀察到的相似)。

dic intro figure12

當執行用較厚的生物標本(特別是那些在水溶液中的鹽溶液浸漬)的光學切片實驗時,必須警惕的顯微鏡蓋玻片和安裝介質之間的界麵處的折射率不連續所產生的球麵像差的可能引入。這些項目將降低分辨率的光學部分係列更高的穿透深度。

當前甲顯著量的微分幹涉對比理論的研究和開發集中在引人注物鏡光學切片的技術特征。最終,從標本的三維折射率分布圖的定量估計,可以實現通過計算模型。此外,目前的研究還衝著新車型正在開發的部分相幹的透射光DI​​C的光學元件和圖像形成。

結論

微分幹涉顯微鏡基本上是作微小的,一般的艾裏斑的直徑稍小於剪切係統,在該係統中,將參考光束的光束剪切幹涉。事實上,在該樣本中的每一個點所代表的兩個重疊的在最終圖像中,一個明亮,其他比背景暗的艾裏磁盤。基本的顯微鏡係統,首先由Francis史密斯1955設計,是修改後的兩個渥拉斯頓棱鏡附加的,一個聚光鏡的前焦麵和第二物鏡的後焦平麵的偏光顯微鏡。

後來的修改,建議由喬治利用Nomarski,使棱鏡相差的光學孔徑共軛平麵在物理上位於。聚光鏡棱鏡將每個成兩個稍微移位,相對於彼此是正交偏振的平行光束,照射試樣,而物鏡棱鏡用於重新組合的光束的波陣麵。鏡像到另一個由光學係統,這兩個棱鏡的組合,是在高數值孔徑的微分幹涉對比,以形成銳利的圖像的能力的一個重要特征。

用梯度的幾何路徑長度或試樣的折射率,這會導致在橢圓偏振光的合成光,退出物鏡Wollaston棱鏡被引入到兩個正交波陣麵的相位差。偏置相位差可以被引入到係統翻譯的物鏡棱鏡沿顯微鏡光軸或通過四分之一波長板的偏振器或分析儀相結合。因此,通過簡單的旋轉控製旋鈕,可以得到最佳的對比度,場亮度和靈敏度。

由此產生的DIC圖像具有陰影鑄態的外觀,有效地顯示為低和高的空間頻率的光學路徑的梯度。這些試樣的光路的區域增加沿基準方向顯得更亮(或暗)的區域出現在路徑差減少,而以相反的對比度。陡峭的梯度光程差導致較大的反差。各種各樣的標本與微分幹涉相襯成像是很好的候選人,包括非常薄的細絲或尖銳的接口,從而產生良好的對比度,甚至當他們的直徑低於光學係統的分辨率極限。

其中主要的微分幹涉對比顯微鏡的成像優勢是較小的標本特征的形象,不像暗場或相襯,沒有遮擋相鄰的地區,具有較大的光學梯度。此外,中性灰色的背景上顯示的圖像的陰影鑄造,耦合到成像非常小的特征,連同那些大得多的靈敏度(例如,分鍾附屬物活細胞或動態的夾雜物在細胞內的細胞器和移動)傳統相襯技術是一個重大改進。這些好處,除了對比度控製寬動態範圍和淺景深,都促成了該技術的廣泛普及。

對比度在DIC的顯微鏡是有方向性的,表現出最大沿剪切的軸線和在正交方向最少。艾裏斑分離(平均峰-峰的分離磁盤半徑的二分之一到三分之二)的方向與剪切軸的顯微鏡,它是最大對比度的方向相一致。其結果是,DIC對比度傳遞函數(CTF)也是方向沿著剪切軸。通過試樣的兩個波陣麵之間的橫向位移大約一半的物鏡的分辨率極限。這種小程度的剪切力,誘導,由渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡類似的行動,一個高通濾波器的空間頻率的對比度細節在試樣。相應的調製傳遞函數(MTF)緊跟在明照明的高空間頻率觀察,但樣品的功能,超過幾個微米大小(空間頻率較低)顯示急劇下降。

適合在DIC的觀察標本包括液塗片檢查,活細胞培養物,血細胞,亞細胞器,未染色的組織,染色體,原生動物,胚胎,矽藻,聚合物,副本,以及比較厚的超薄切片。更多信息可以通過檢查振幅和相位幅度混合標本,如天然色素原生生物,藻類和淡染的組織學標本。該技術通常是組合使用,以顯示細胞形態與熒光區域熒光顯微鏡。當耦合增強的視頻技術(稱為VEC-DIC視頻增強的對比度微分幹涉對比),DIC可以被用來產生結構,具有以下的尺寸的顯微鏡的光學分辨率的圖像。



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