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新聞資訊

徠卡顯微鏡:共聚焦顯微鏡的最終來源白光激光束

2013-10-16  發布者:admin 

共聚焦顯微鏡在生物醫學應用的理想光源應如何執行?它應具有足夠的強度,可調諧的顏色同時激發的一係列樣品。此外,它應該是一個脈衝光源壽命熒光實驗。已經發明這種源:白光激光器。它由一個高能量脈衝IR被饋送通過光子晶體光纖的光纖激光器,產生的光譜的連續。小bandlets選自該連續的聲光可調諧濾波器的裝置。該儀器提供足夠激烈,像一個普通的激光束 這是衍射極限照明的要求,可調焦的光。它允許通過頻譜從藍色到紅色的顏色的連續調諧。八並行可調顏色為標準。,它提供了一些額外的好處,這是由於由脈衝的能量發射。它本質上是一種基於單光子熒光壽命成像源。並且它允許抑製在檢測信道的激發光通過玻璃 自由電子發射濾波。

Fig_0_Lambda_square_01

超連續譜白光光源

古典激光光源通常隻提供一個單一的窄的發射。某些氣體激光器可以同時發射了幾行。最著名的例子是氬氣體激光器,這可能是有5條線中的藍綠色的範圍內。其他類型的激光器,染料激光器一樣,是可調諧的,但一次隻發射單一的顏色。此外,染料激光器是非常不穩定的,需要一定的耐心才能正常運行。有全固態激光器是可調諧的,但僅限於紅外範圍(如鈦薩激光器)。除了其高複雜性和昂貴,他們也可以隻發出單一波長的時間和調整過程是很慢的(多少秒)。

這種情況已經完全改變了本發明,同時在很寬的範圍內發射的光源,但仍像激光器在可聚焦。

這些源采用了光纖紅外激光發射光脈衝在大約80兆赫。這種化合物被用於作為“種子”,即提供了一個精確的時鍾,但具有相當低的能量。一個二極管泵浦的激光放大器中放大,其後的脈衝。放大激光也是基於光纖的,兩個係統都無縫耦合光纖熔接。放大器的輸出可能會達到約10 W的紅外光的平均功率,但切碎約脈衝。200 PS80 MHz。這種高能量的脈衝,最後集中在一個所謂的光子晶體光纖(PCF)的入口表麵的。這些纖維具有在纖維的中心的空心管的圖案的。強烈的非線性過程在單色光擴散成一種廣譜達到藍色或什至紫外線管圖案的表麵,導致包括群速度色散(最多順序排列),自陡,拉曼散射和等離激元的裂變。

根據不同的PCF的長度,單色紅外峰頻譜擴散到高達幾百納米。典型的纖維長度為0.52米。

WLL-Figure-1_04

圖 1:左:光子晶體光纖橫截麵。空心管的中心圖案是複雜的非線性光子相互作用產生的光子能量廣泛的空間。
右:白色的激光所產生的放大紅外脈衝激光,這是美聯儲通過光子晶體光纖。PCF是一個堅實的超連續譜發生器。連續體的寬度取決於光子晶體光纖的長度-以及許多其他的工程細節。所有零件的基於光纖的固有的免維護。通過棱鏡產生的PCF的出口處的頻譜,並投射到一張紙上。

顏色和強度的兩維聲光調諧

就像在任何其他的顯微鏡,使用白色熒光照明源,白光激光共聚焦顯微鏡[需要一種手段來選擇顏色,具體地激發各種熒光染料。如果可能,多種顏色是非常有用的並行乘法染色樣品的激發。在寬視場熒光顯微鏡中,這個任務是由激發光濾光片。具有3個或4個傳輸頻帶dichroitic過濾器用於多染色樣品。

從超連續發射的光束提供一個更靈活的解決方案。的聲光可調諧濾波器可以挑選出的頻譜單行(這實際上是一個狹窄的扁帶),並轉移到一個不同的方向。頻譜的其餘部分將通過晶體直行。由於顏色的扁帶是由機械激發頻率控製的偏轉,從輸入頻譜可以選擇任何顏色的無級可調。該扁帶的寬度是約1 ... 3納米的波長而定。這樣的細帶中的能量是在幾毫瓦,這是足夠遠成像的和經常使用的,即使對於FRAP實驗的範圍內。通過添加更多的電子驅動器,以產生在晶體中的機械波,它是可以直接到為了同時一係列顏色。八色同步標準(但不是技術限製)。這些bandlets中的每一個都是可調諧的波長和強度。

這種組合使白光激光共聚焦顯微鏡激發WLL的理想來源。它將為所有已知的染料在可見光範圍內激發,它允許記錄激發光譜探索新染料的光譜特性,尤其是在原位。和它給自由調整激發離峰,如果這是需要的發射收集的原因或提高分離相鄰的染料。

WLL-Figure-2_01

圖 2:采用的聲光可調諧濾波器,提取了一係列的各種顏色的bandlets的超連續譜源的白色發光。可調諧這些bandlets是在顏色和強度。同時使用了一些bandlets需要並行乘法染色樣品的激發。

聲光分束(AOBS)可以做的工作

WLL-Figure-3

圖 3:隻自由可調諧分束裝置可有效地作為依賴於波長的激發和發射閥,用於當使用一個可調諧源。聲光的分束器,可以無級調節,同時適應任何給定的一係列激發顏色。

 

激發顏色自由可調性方麵非常有利的啟動一個新的挑戰:什麽樣的設備可以喂飽無級調諧到入射的光的熒光顯微鏡的光路中的光?最簡單的方法是使用一個灰色的分束器,但這將是:總是失去態激發能的目標部分的犧牲 盡管這是較小的問題。這種方法的嚴重缺點是寶貴的發射光的損失。即使使用灰分離器80/20(這將浪費的激光能量的4/5)的排放量的五分之一將被犧牲掉。

一個單一的分色鏡,即使有多個頻段,顯然不可能支持一個可調光源的好處。一個單一的排放慢調諧的一種方法,已經商業化的非連續光源。該係統采用了約序列。10二向色反射鏡,將用於在其工作頻率 給隻有10種,滿分為200的範圍內 而它們也可用於指定的波長的兩側。這使得一共有30種顏色,但明顯低於完美的表現。

這種困境的一個完美的補救辦法是使用聲光。聲光可調諧光束分離器(AOBS)是一種裝置,允許的光路與超過95%的效率,而頻譜的其餘部分被引導到不同的方向,被送入一係列的顏色bandlets。在一個多扁帶的可調諧激光器的情況下,如操作AOBS使得激發的顏色傳遞順序作為激發光束路徑的進入。 

將被有效地傳遞到檢測路徑的完整的發射光譜。線程化所需的在樣品上的激發扁帶的透射光譜中的空隙的扁帶本身(因為它們所產生的相同的技術)相同的尺寸,同時可控製在它們的位置:隻要一個曲調的激發顏色,適當的平行的電子調諧相應的間隙。無需任何操作者的操作是必需的。

的聲光可調諧分束器,因此最終的耦合裝置,用於可調諧多色激發。

激發和發射光譜的強度和熒光壽命

光譜檢測儀(SP)是專為帶寬和完全控製中心檢測到的發射譜帶顏色。這可以保證最高的吞吐量(傳動效率高)和最佳分離。作為一個副作用,SP檢測器允許記錄的發射光譜,以及 5個通道)可以同時或依次(多達400個),或這兩種方法以混合模式。在過去,被綁定到安裝在係統中的激光器所發出的幾行的發光顏色。隨著白光激光器(WLL),情況已經完全改變:顏色1nm的精度可調,順利激發譜是整個可見光譜。在與SP的檢測器,它能夠適應伺服控製的激發波長的組合,這種測量是完全自動進行。它是合理可行的實施聲光分束器引導激發和發射光。

有一個可調的激發和一個可調諧發射,下一個步驟是創建一個二維的強度相關的地圖[。這拉姆達方地圖是特別有用的複雜混合物的熒光染料時,需要分開。這也是一般價值熒光染料時,需要的特點-要麽是因為他們的新發現或設計,或者是因為由於微環境條件下,感興趣的頻譜改變。

特點是熒光發射強度和熒光壽命。要確切衡量壽命,脈衝光源是必需的。幸運的是,白色光的激光是一種脈衝源,脈衝頻率適合的典型的熒光壽命(0.5 ... 5納秒的範圍內)的需要。如果需要更長的脈衝間隔,脈衝選擇器降低脈衝頻率。當然,白色光可調諧激光直接呈現終身激發光譜,包括下一個合乎邏輯的後果:一個二維激發發射終身地圖。

Fig4_zusammen

圖 4:記錄,可將6個不同顏色的有孔​​玻璃珠。左:假色由一個激發發射λ-方掃描記錄,可在有孔玻璃珠的凸起。右:偽三維視圖的激發發光的地圖(熒光橫向)。人們可以很容易地找到六種不同的熒光染料(箭頭)的峰值。

光門 全色電子屏障過濾器

最後一件事啟用了最新的技術。混合探測器(HyDs)非常敏感,快速,覆蓋一個大的動態範圍。他們提供了一個門控操作模式。在脈衝白光激光的結合,它是現在可以隻在光脈衝之間的時間間隔來檢測熒光發射 隻是由門混合檢測器的收集沒有在激光脈衝的信號。然後,檢測到的信號是純熒光,並且不包含任何反射光。這一做法,剩餘反射的顏色對抗輕鬆拿下。有沒有必要限製排放留出了足夠的空間,以激發顏色集合。它甚至有可能激發下方直接測量 和超越,然後允許反斯托克斯發射特性。

脈衝和光譜可調白光激光光源,結合聲光可調分束器,可調SP探測器和門控混合探測器是一個巧妙結合最新的技術。而且,雖然這句話聽起來可能有點穿,它適合在這裏:它革命性的概念和操作共聚焦顯微鏡。

Fig_5_02

圖 5:通過門控檢測,也能夠非常有效地,純粹隻記錄從樣品中的熒光。混合探測器(HyDs)作為完美的傳感器在這方麵。在收集數據期間被分配的激發脈衝,並因此隻有發射的熒光收集。左圖:錄製的綠色熒光激發後,在492 nm處。排放收集490-600納米。主信號的反射光作為激發波長為的集發射頻帶內。右圖:相同的激發波長和發射集合帶,但光門。沒有反射光被記錄下來。純的和明確的熒光發射,,不管發射帶。



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