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尼康顯微鏡:EPI-熒光照明光路

2013-10-16  發布者:admin 

直到最近,熒光照明是一個選項僅適用於配備專門的高數值孔徑物鏡的研究級複合顯微鏡。這一技術在立體顯微鏡的需要不斷升級與引進的編碼基因和生物特異性熒光蛋白GFP(綠色熒光蛋白)等。

stereo fluorescence figure1

體視顯微鏡的應用GFP觀察現在是如此普遍,立體聲熒光照明,更經常被稱為GFP照明,即使他們可以利用許多其他應用在生命科學和電子製造業。大幼蟲,線蟲,斑馬魚,卵母細胞和成熟的昆蟲標本,如可以方便地選擇和操作時,他們GFP標記的照亮熒光技巧。熒光照明揭示生物體產生熒光蛋白耦合到一個大領域的視野和充足的工作距離和立體視覺,使觀察員進行實驗,用鉗子,移液器,或顯微操作。其他更傳統的標本也很容易觀察和記錄使用立體顯微鏡熒光照明。

 

落射熒光照明功能的方式是類似上采用更複雜的複合顯微鏡體視顯微鏡上。通常情況下,在熒光照明器由包含在經由中間管(或垂直照明,其安裝到顯微鏡外部燈箱的氙燈或汞弧燈,見圖12)之間的的顯微鏡放大本體和觀察管定位。目前僅限於這種類型的照明采用共同的主要物鏡CMO)立體顯微鏡的應用,因為它不是可以使用的市售的零件,以適應一個的格裏諾或聚光型體視顯微鏡熒光照明。

 

弧燈產生的光被引導通過一個可調節的聚光透鏡的組合過濾器塊(圖2和圖3中示出),它允許唯一的光具有特定波長範圍內(或帶通),通過容納在激發濾光片。過濾的光,然後通過顯微鏡成像的下部的顯微鏡(放大的身體和客觀的在體視顯微鏡)的路徑和到標本偏轉,也調諧到選擇性地過濾由二色鏡,反射,和/或發送一個特定的波長區域設置。的術語二色性(或二色性)是指過濾器或反射鏡的能力來區分兩種顏色的範圍,超過該限製反射特定波長極限以下的顏色,而這些波長發送。

stereo fluorescence figure2

聚焦的激發光通過顯微鏡放大主體和物鏡,在那裏形成一個倒錐形的照明,沐浴試樣,令人興奮的任何存在的熒光基團,並且有對應的激發波長的帶通範圍內的吸收帶的。二次熒光發射(通常比的激發光更長的波長)從試樣發出的捕捉體視顯微鏡的常見的主要物鏡,並通過放大機構和阻擋濾波器直接回,塊激發波長,並隻允許一個選定的區域發射波長通過。在圖1和圖2中的顯微鏡體管構成,波長較長的熒光發射光通過左側和右側的放大光信道傳遞到達落射熒光照明器之前獨立地集中。光從左邊的通道直接穿過屏障過濾器前觀察管或直接進入到相機端口。與此相反,右聲道的光從第一行駛回然後通過二色鏡的屏障過濾器和目鏡。此燈不到相機端口的途徑,隻能用於觀察標本。

 

列於圖23的熒光過濾器的組合塊的結構細節。每個塊包含一個單一的激發濾光器,兩個屏障過濾器和一個二色鏡。汞弧燈產生的光通過激發濾光片進入塊,如上所討論的,圖3中所示的二色性反射鏡的表麵被反射。次級熒光發射通過阻擋過濾器。激發光濾光片,二色鏡,用於左聲道的屏障過濾器粘到的地方,但是,用於右聲道的屏障過濾器被安裝在一個小的幀可以通過擰鬆固定螺釘的一組從塊中刪除。卸下屏障過濾器框架允許訪問定位在過濾器內的塊的二色鏡。當粘合成塊,更換過濾器小心,不要蔓延到過濾器表麵的膠水和不持有的過濾器或雙色鏡用沒戴手套的手,以避免汙染的表麵油膩指紋。

 

熒光垂直照明可以容納三濾的塊和一個直徑過濾虛擬塊(沒有過濾器),使正常的明場觀察。過濾器塊被安裝在滑動架中,並且可以被插入到光路中,是用來控製齒條位置的杆通過。每個塊都有一個附帶的識別板,其可插入順序排列,以使操作者能夠容易地選擇適當的塊,用於熒光觀察的照明裝置的外部殼體上的插槽。

stereo fluorescence figure3

目前,尼康提供一個適度的過濾器組合的陣容,這是表1中列出。這些過濾器涵蓋了廣泛的熒光激發和發射條件,應該是有用的許多普遍使用的熒光探針在生物學研究。該過濾器的組合,也適用於工業應用,如熒光照片汙染集成電路晶片檢查抗蝕劑聚合物。激發波長介於380510納米熒光探針,可以用來選擇合適的激發/發射過濾器組合(見表1)。該過濾器的組合也是非常有用的研究,采用各種綠色熒光蛋白的突變體,包括青色和藍色的版本。

 

在活的細胞培養物,具有熒光蛋白標簽,可以顯著提高的信號強度,過濾器的組合時,是嚴格匹配的熒光激發和發射的檔案。例如,在DS-紅信號,視覺和圖像傳感器檢測到的紅色熒光的情況下,可以顯著提高的紅色信號通過轉移更多的橙色發射。此外,專為植物標本具有強烈的自體熒光背景葉綠素排放的過濾器組合往往受益於仔細和精確的選擇過濾器的規格,就到相應的信號發射。顯微鏡工程師采取許多這些設計標準時考慮到他們正在優化波長帶通過濾器組合體視顯微鏡地區。

 

體視顯微鏡熒光濾光片組合

設置過濾器

激發
波長範圍

二向色鏡

發射
波長範圍

藍綠色熒光蛋白/ DAPI

379-401納米

420納米(DCLP

435-485納米

青色(EGFPGFP

426-446納米

455DCLP

460-500納米

賦予GFP帶通

HQ 450-490納米

Q 495LP

500-550納米

賦予GFP長通

HQ 450-490納米

Q 495LP

500納米(LP

TRITC(紅色熒光蛋白)

HQ 530-560納米

Q 570LP

590-650納米

黃綠色熒光帶通濾波器

HQ 490-510納米

Q 515LP

520-550納米

1

 

組合塊過濾器和其它敏感的幹涉濾光片,將隨時間而變質時暴露在高強度的光,紫外線的波長。作為帶通頻率和傳輸值的特性,例如,如果過濾器被暴露於高濕度條件下也可能受到影響。為了增加這些過濾器的使用壽命,他們應該被儲存在幹燥器中或含有幹燥劑的密封容器中。另外,還可減少光通過過濾器的保持照明快門關閉標本時不被直接觀察或用數碼或膠卷的照相機係統成像的時間量。該過濾器隻應用幹燥空氣清潔從耳氣球,軟駝刷,或無油的加壓氣瓶。不要試圖擦拭鏡頭紙過濾器,以避免劃傷或擦傷,軟幹擾塗層的表麵。

 

尼康SMZ1500如用立體顯微鏡,廣泛的標本,可以在熒光照射下成像。物鏡的放大倍率為0.5倍至15倍的1.6倍的變焦跨度,在顯微鏡能夠540X,考慮到的一個經典的化合物顯微鏡體視顯微鏡觀察範圍內,共提供4倍的倍率廣度。這種廣泛的緯度使顯微鏡的放大倍率形象都大活標本和熒光標記的薄切片在顯微鏡玻片上安裝微小的細節上。熒光觀察的高倍率範圍內的一個例子示出在圖4中的三重標記的小鼠腎組織的粗節。標記的Alexa Fluor 488WGA,用DAPIAlexa Fluor 568(得自Molecular Probes公司的Alexa Fluor探針和試樣)試樣,並使用三個過濾器的組合列於表1藍綠色熒光蛋白/ DAPI,成像賦予GFP的帶通濾波器,和TRITC DsRed。此圖片清楚地說明了高倍率能力原本準備複合顯微鏡觀察標本的熒光體視顯微鏡。

stereo fluorescence figure4

其他體視顯微鏡製造商提供替代照明策略,激發和觀察。最流行的配置,如圖5所示,熒光激發,不利用顯微鏡的成像光學係統包括一個外部通路。照明從電弧燈箱的第一通過激發濾光片,然後通過管定位在主顯微鏡主體的後部。管的下部配備的透鏡係統,引導到樣品上的激發光波長。此配置可確保光線被直接引導到標本在所有倍率變焦位置,提供所有倍率同樣強烈的熒光照明均勻暗背景。

 

從被捕獲的標記的試樣中熒光發射通過的共同的主要物鏡(圖5),並通過變焦頻道和屏障過濾器定位在顯微鏡頭成一組。從那裏時,光被引導到目鏡直接觀察或成數字成像或顯微攝影攝像管。此配置中的主要好處是缺乏的二色性反射鏡的一個要求,和獨立於預先配置的過濾器的組合塊,這使得研究者有所更自由地進行過濾器的選擇。但是,配置也可能導致錯誤,缺乏經驗的運營商試圖觀察標本不正確的過濾器組合。

stereo fluorescence figure5

強烈的紫外線輻射所產生的汞弧燈作為光源,在熒光顯微鏡利用觀察者的眼睛的視網膜,可以造成損壞。為了避免這種情況,許多顯微鏡製造商包括保護裝置在顯微鏡體,可過濾紫外線光洗澡標本在顯微鏡舞台上。其他的安全預防措施,包括紫外線阻隔過濾器觀察路徑和雜散光保護周圍的燈箱。此外,假人過濾運營商往往是空置過濾器的位置插入熒光幹擾過濾器滑塊和旋轉框架設計。

 

熒光體視顯微鏡通常配備停止定位介於汞燈箱和阻擋有害紫外線輻射的垂直照明從燈標本時不被觀察或成像光。此停止應始終被插入光路時,不進行觀測。

反射,或熱點可以發生在使用複消色差物鏡更高的放大倍率(1.6倍至2.0倍)的標本,在熒光立體顯微鏡觀察時的視場的下部。此神器通常是唯一可見的變焦比率較低時,往往消失的變焦倍數增加。在大多數情況下,反射問題不發生較低倍物鏡(0.5X1.0X),無論光學校正因子,通常缺席下校正(消色差透鏡和計劃消色差透鏡)的高倍率物鏡

 

存在範圍廣泛的應用程序熒光調查,利用體視顯微鏡,列於表2。受益於這種觀察模式標本的數量是相當大的,涵蓋廣泛的學科,包括那些從生物領域到工業製造商不等。

熒光立體顯微鏡的應用

領域

應用

生物學

基因表達,細胞分選,解剖,發育過程,眼睛和肌肉調查

植物學

植物細胞,組織自體熒光,土壤樣品和寄生蟲

藥理

毛細管流量,藥物,ELI觀察

水文學

水質,細胞結構,濾膜分析

農學

種子觀察,基因的表達,並Transgenetics

電子

錫膏,環氧樹脂分析,監控塗料,聚合物鑄件集成電路

半導體

抵製汙染,雜質顆粒,過程錯誤

聚合物

外來顆粒,空洞,珠分析,非聚合區

金工

裂縫和表麵缺陷,汙染,焊接控製,斷裂分析

物料

裂紋,焊接,粘接碳,骨折,取向研究

造紙

光纖塗料和夾雜物

取證

紡織纖維,體液,指紋,銀行票據,偽造

2

熒光觀察在立體顯微鏡提供的獨特的屬性的三維觀察時相比,提出的一個古典化合物顯微鏡的視圖。此外,更大的工作距離和景深立體技術所提供的啟用更寬的全景視圖字段和更強烈的熒光。這些功能是巨大的利益,調查人員正試圖處理大量的生物標本和材料的技術人員正在開展準備工作,如嵌入,電子檢查,或切割。作為更清楚地定義的過濾器組合成為可用於專門的應用程序,利用熒光立體顯微鏡繼續攀升。



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