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新聞資訊

奧林巴斯顯微鏡:熒光壽命成像顯微術(FLIM)

2013-10-16  發布者:admin 

觀察生物材料(如蛋白質,脂質,核酸,和離子)的分布的組織和細胞的研究領域中,積極地使用多顏色用熒光染料染色。熒光觀察的檢測技術已經發展到一個單一的熒光染料分子的水平下最好的情況下,可以檢測到。本節回顧熒光壽命成像顯微鏡(FLIM),一個新的熒光顯微鏡技術的幾個重要方麵。此外多色染色,還可以利用熒光壽命成像可視化的因素的影響,也就是說,在分子周圍的環境的狀態的染料分子的熒光壽命特性。

波長光譜

傳統的熒光顯微鏡利用熒光染料,也就是標識基於熒光染料的光譜特性之間的差異的顏色屬性。利用這種技術,可以同時使用五個或六個染料在從紫外光到近紅外的波長範圍內,在顯微鏡下沒有顏色之間的混淆。

壽命譜

每一個熒光染料,有自己的生命周期,處於興奮狀態。通過檢測壽命的差異,這是可以區分具有相同的熒光色,以及識別自體熒光的染料。此外,使用具有很長的使用壽命比通常使用的熒光染料的探針,可以通過以下方式獲得高的信號噪聲的圖像。例如,鉑糞卟啉有一生的毫秒量級,而普通的熒光染料的壽命是納秒級。這種相對長壽命的熒光染料將很快被用作探針的DNA芯片上檢測。

熒光壽命成像也使得有可能獲得分子的信息,同時觀察活細胞。熒光壽命的影響因素包括當兩種蛋白質彼此接近時,離子強度,憎水性能,氧濃度,分子結合,能量轉移和分子間的相互作用。然而,終生是獨立的染料濃度,光漂白,光散射和激發光的強度。因此,熒光壽命成像,使AG亚游集团能夠進行精確的離子濃度測量和熒光共振能量轉移(FRET)分析。

熒光壽命成像的方法有兩種:時域方法和頻域方法。

· 時域FLIM -通過脈衝激光激發後的延遲在某些情況下,熒光圖像可以通過以下方式獲得的圖像增強器的門控操作。通過激光,脈衝持續時間為幾百皮秒和納秒級快門的激發態的壽命,因為通常是120納秒,以納秒為單位計量的壽命。一個高速柵極圖像增強市售濱鬆光子學株式會社(日本濱鬆市)。在每個像素處的熒光壽命測量而不同的延遲時間,直到一個門打開,也可以通過以下方式獲得。根據他們的一生中偽彩色的熒光壽命的圖像顯示。

· 頻域FLIM -熒光壽命的計算通過測量熒光的相移和在其幅度的減少使用的檢測器的增益調製器調製的激光作為激發光源時(為1200兆赫茲)。測量可以由激光掃描(光電倍增管)或使用的電荷耦合器件(CCD)。

flim figure1

應用

探頭的周圍環境檢測到的事實,熒光壽命為敏感的氫離子濃度(pH),氧,和鈣離子濃度的基礎上。的綁定或分子之間的相互作用也可以結合測量FRET

鈣離子濃度成像

當鈣離子結合的Fura-2的熒光探針,例如,氟-3或鈣綠,熒光壽命的熒光強度的變化。離子濃度測定用常規方法集中在強度上的變化。據的變化的鈣離子濃度,染料之間的結合與非結合鈣離子的變化的比率,這隨後導致在試樣中的測量點的熒光壽命的變化。除了鈣離子探針,這種技術也適用於測量溶液pH和其他離子如鈉離子和鎂離子。

熒光共振能量轉移(FRET

目前正在研究將進行FRET的綠色熒光蛋白(GFP)的變體(GFP用不同的熒光彩色)。熒光共振能量轉移,使得它可以測量的熒光染料標記的一對兩個蛋白之間的相互作用(關聯或解離)。一個捐助熒光染料激發/發射波長較短的提供能量的到受體熒光染料的。激發態的供體染料的生存期是可變的,取決於受體(染料接收的能量)是否存在。基於生命周期的測量,因為這是沒有必要考慮重疊的熒光在檢測過程中,允許更好的定量。

臨床影像

作為某些組織和cytodiagnostic標本有很強的自體熒光的探針,使用具有長壽命(以毫秒為單位)已嚐試。長壽命的探針也可用於熒光原位雜交(FISH),可以同時使用的顏色的數量是有限的,因為使用該技術。血液中的氫離子濃度,以及氧和二氧化碳的壓力,已經被測量熒光壽命的基礎上,,雖然這樣測量的仍然是不可能的,在顯微鏡下。



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