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徠卡顯微鏡:活細胞成像技術

2013-10-16  發布者:admin 

複雜和/或快速的細胞動力學的理解是探索生物過程的一個重要步驟。因此,今天的生命科學研究越來越注重動態過程,如細 ​​胞遷移,細胞,器官或整體動物形態學變化和生理(如細胞內的離子成分的變化)事件實時的活標本。解決這些具有挑戰性的需求的方法之一是采用若幹統稱活細胞成像的光學方法。活細胞成像活細胞的動力學過程,而不是給細胞的當前狀態的一個“快照” -允許調查將改編成電影的快照。活細胞成像提供了空間和時間信息的動態事件在單細胞,細胞網絡(原位),甚至整個生物體(體內)。這些特點使活 ​​細胞成像技術,為細胞生物學,癌症研究,發育生物學和神經科學的解決問題的必要條件。

近年來,在電子,光學和分子生物學取得了重大進展,活細胞成像輕鬆訪問科學家。

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活細胞成像采用的方法

顯微技術應用於活細胞成像的範圍也極其廣泛。通常情況下,細胞的生長,細胞的聚集體或細胞的運動,觀察到隨著時間的推移,使用複合顯微鏡和對比相襯和微分幹涉相差(DIC)的方法,如。此外,時間推移成像較大的標本,如開發的斑馬魚胚胎,廣泛進行,通常是用立體顯微鏡或macroscopes的。高級熒光技術在過去的幾十年中已成為越來越重要的。生物調查從平麵到第三個維度共聚焦顯微鏡的應用的快速增長已經改變了觀點。下麵是一個簡短的概述常用的應用技術。

離子成像 - 離子濃度的變化觀察

通常執行的方法是鈣,氯,鎂離子成像()可以使用熒光染料或蛋白質,尤其是鈣離子結合後,旨在改變其排放行為。這使研究人員能夠觀察到細胞中的離子濃度的動態變化。由於離子組成細胞的細胞質中確定許多重要功能的細胞,如神經細胞的興奮性,基因轉錄和細胞運動(隻是僅舉幾例)調節細胞內離子在空間和時間方麵是生命科學的重大利益研究。另外,成像細胞內pH值水平或電壓可以用特殊的熒光染料。一個特殊的成像技術離子濃​​度,pH值或電壓變化比例成像方法。這些可以進行精確的測定,例如細胞內鈣濃度的相對變化,而不是監測,因為它是在非比例的方法。

FRET - 量化的蛋白質 - 蛋白質相互作用

要動態檢測蛋白質相互作用FRET(福斯特共振能量轉移)和生物發光共振能量轉移(BRET)事件可以在活細胞實驗成像。FRET量化分子動力學,如蛋白質 - 蛋白質相互作用,蛋白質-DNA相互作用,蛋白質構象變化是一個有用的工具。FRET成像通常使用GFP(綠色熒光蛋白)的衍生物,特別是CFP和YFP(青色和黃色熒光蛋白,分別),這是每一個連接到感興趣的蛋白質,使用分子生物學方法。CFP分子被激發熒光燈。盡快感興趣的蛋白質緊密的空間接近(小於20 nm)的CFP將作為供體和轉移的能量以光的形式發射到YFP的,作為受體。研究人員將觀察轉變,從從CFP發出藍色熒光YFP發出的黃色熒光。在BRET的情況下,捐贈者是一個發光的分子(如熒光素衍生物)作為捐贈者,像熒光共振能量轉移(FRET),GFP衍生物作為受體。

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 1:活細胞共聚焦圖像擬南芥; endoplasmatic網:GFP標記的自體熒光綠色,紅色,藍色傳輸葉綠體。基於這樣的圖像,例如FRET或FRAP分析可以做到。

 

FRAP - 監控蛋白和囊泡販運

適用於監控蛋白或囊泡運輸的方法往往是光漂白(FRAP)後熒光恢複。在這裏,熒光蛋白(GFP)的感興趣的蛋白(即一種蛋白質,其運動是要監視)。一般情況下,整個小區是初步熒光蛋白可能在整個細胞豐富。目標區域的細胞,通常在神經細胞的軸突或樹突細胞的過程,例如,暴露在高強度的光(通常為激光),並在該特定區域的熒光被破壞(漂白)。感興趣的蛋白質是移動的,其他部位的細胞蛋白reinvade漂白區域以一定的速度,並在漂白區域的熒光恢複。這可以給研究人員深入到細胞內運輸動力學。

TIRF - 觀察過程接近到細胞膜

觀察位於或接近一個細胞的質膜的事件的一個特殊的技術是全內反射熒光顯微鏡(全內反射)。通過使用熒光染料的激發僅穿透細胞的60-250納米的漸逝場中,全內反射熒光顯微鏡提供一個無與倫比的z軸分辨率,使中發生的事件或接近到質膜(例如分子運輸到質膜)的成像,而不熒光分子在細胞內的相形見絀。

TIRF圖像:半乳糖凝集素-3接近沿著肌動蛋白絲膜囊泡運輸。

TIRFa_02  TIRFb_02

 2A:概述螢光圖像,                                                           圖 2B:概述圖像與TIRF在C所示,標記的部分,

 

TIRF部分的時間序列
 2C:TIRF部分的時間序列,時間定在幾秒鍾內。首先沿著肌動蛋白絲(從底部向上)運輸à半乳糖凝集素-3的囊泡(標YFP)膜(箭頭),切換到另一個燈絲(88),移動到左側(109),再次運送到右側,再次切換燈絲,然後被輸送向上(246次)。
YFP:紅色; CFP:綠色;圖像概覽:20微米;截麵:6微米,穿透深度TIRF:110納米的尺度。Courtesy of Ralf Jacob, University of Marburg, Germany

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

光敏 - 監測基因表達和蛋白質運輸

最近開發的方法,稱為光敏選擇性地標記在一個單元格或整個機體的某些地區或感興趣的領域。對於使用光活化,尤其是設計的染料或熒光蛋白,如綠色熒光蛋白(paGFP)光活化的或楓。這些熒光熒光在其正常狀態。然而,某些波長的光照射之後,這些熒光可以激活熒光像傳統熒光。在許多情況下,這些蛋白質的基因融合到某些感興趣的蛋白質的表達或傳輸然後,可以監測。然後可以應用如FRAP或粒子跟蹤的方法,感興趣的蛋白質,以進一步調查。

MPE - 深入調查過程中

現代生物學研究的要求真正在體內的調查,以配合“準體內”,在細胞培養實驗。但它是很難,調查像鼠標生物體內部發生的進程。多光子激發顯微鏡(MPE)可更深入地滲透到組織中,因為近紅外激發光的,具有較長的波長,相比,單光子激發的短波長的光用於減分散。MPE技術的非線性性質,限製了光漂白和光毒性在聚焦的區域。長期調查,這是極其有利的,因為無論是熒光蛋白和生物體遭受這些問題。使用適當的準備和微觀設置,成像到幾毫米到組織的報告。使得它適合用於光子操縱以及激發的精確定位。這種方法已經發現在神經生物學的廣泛應用。

STED - 細胞動力學研究納米尺度

受激發射損耗(STED)顯微鏡可以讓科學家們調查超越光學分辨率極限的結構。這種技術使用熒光染料,被刺激的排放,以消除探測信號的財產。下降到50-70納米的細胞結構已經成功地成像。提高分辨率是非常重要的為調查小細胞結構。特別是對那些誰想要看看共存事件,分辨率的提高可以產生更逼真的效果。隨機STED的獨立性,使成像速度非常快,相​​比其他的超分辨率技術。視頻率STED收購已經實現,它允許實時細胞動力學研究。

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 3:STED活細胞成像單元標簽技術:Vero細胞結構:EB3,瞬時轉染;標簽:俄勒岡綠488。

FLIM - 活細胞的空間測量

熒光壽命成像的優點在於,該數據是不依賴於信號強度。因此,它不是常見的文物,如漂白濃度變化的影響。使用時間相關單光子計數,FLIM的重建圖像數據的單分子檢測。在子納秒熒光壽命的變化最小,可以注冊和分析。該方法具有通用性外和細胞內環境改變,從而導致熒光壽命改變任何種類的調查。FLIM的FRET分析的發射強度是不敏感的,從而增加量化數據的精度。

CARS和SRS - 無標記方法振動對比

幾乎所有活細胞的熒光成像方法基於熒光蛋白的基因表達。這涉及大量的技術工作和可觀的費用。此外,外部基因的表達有可能發生變化的微環境,從而導致從生理的現實的變化的數據。相幹反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微鏡和共焦方法是非線性的,這是不依賴於熒光染料的受激拉曼散射(SRS)顯微鏡。這些標簽免費的方法圖像樣本中的特定化學鍵的振動狀態。的積累,在活的生物體中的特定化學鍵,如在軸突周圍的髓磷脂的脂質,可以成像在高分辨率和出色的信號與噪聲的質量,而不需要任何染色。

未來是定量

生物研究已經離開了年齡的描述性調查,並進入了一個時代的定量分析。新的活細胞成像技術發展的方向,更高的分辨率,無論是在空間和時間。技術的發展,現在集中在納米範圍內的單分子和分子反應為幾皮秒的定量研究。

 



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