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奧林巴斯顯微鏡:什麽是熒光?

2013-10-16  發布者:admin 

當試樣,活的或非活的,有機或無機,吸收和後來重新煥發燈,這個過程描述為光致發光如果光的發射,激發能量(光)後,便不再持續幾秒鍾,該現象被稱為磷光熒光,在另一方麵,描述了光發射的激發光的吸收僅在繼續。激發光的吸收和再輻射光熒光發射的時間間隔是異常持續時間短,一般不超過百萬分之一秒。

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熒光的現象是19世紀所產生。英國科學家Sir George G. Stokes首先觀察礦物螢石具有熒光,用紫外光照射時,他創造了這個詞“熒光”。斯托克斯觀察熒光光具有更長的波長比激發光,已經成為一種現象,被稱為斯托克斯位移在圖1中,一個光子的紫外線輻射(紫)在一個簡單的原子,令人興奮的電子碰撞,並提升到一個更高的能量水平的電子。隨後,被激發的電子放鬆到一個較低的水平,並在可見光區域的低能量光子(紅色)的形式發射光。圖2是可見光範圍內的電磁輻射,其中包括約400〜700納米的波長範圍內的圖解表示。周邊的可見區域高的紫外線能量和較低的能量的紅外光。

fluo roover view figure2

熒光顯微術是一個極好的方法,可以發出熒光,可以在它的自然形態(稱為原發性自體熒光)或用能夠熒光(稱為次級熒光)的化學品處理時的研究材料熒光顯微鏡卡爾·賴克特8月科勒,和海因裏希·萊曼在二十世紀早期的一部分,製定,等等。然而,此儀器的潛力沒有實現了幾十年,和熒光顯微鏡現在是一個重要(也許是不可缺少的)工具中的細胞生物學。

早期的調查顯示,許多標本,包括相關微量礦物質元素,晶體,樹脂,生藥,黃油,葉綠素,維生素,和無機化合物,用紫外線光照射時表現出的自體熒光。然而,它不是直到1930年,奧地利研究者最大Haitinger和其他科學家開發的技術,它采用二次熒光熒光染色標記特定的組織成分,細菌和其他的病原體,不自體熒光。標簽特定的生化指標,在這些熒光染料的汙漬,促使人們使用熒光顯微鏡。該儀器的價值顯著增強,由1950年的組織中,用熒光素標記的抗體反應,當阿爾伯特浣熊和彌敦道卡普蘭顯示本地化的抗原。

 

熒光顯微鏡的基本任務是允許激發光照射試樣,然後單獨遠遠弱於從明亮的激勵光發射的熒光。因此,隻有從檢體的發射光到達眼睛或其它檢測器(通常是一個數字或傳統的膠片相機)。黑暗的背景下產生的熒光的領域再鑄輝煌足夠的對比度,這樣可以檢測。越暗的背景後麵的非熒光材料,儀器的效率就越高。

圖3表示用熒光顯微鏡觀察熒光的標本時,出現的圖形表示。通過光從紫外線發射源通過勵磁機過濾器所產生的紫外線(UV)光的特定波長或波長組。過濾的紫外線光照射的試樣,在這種情況下,氟石的晶體,這反過來又通過紫外線光照射時發射熒光的光。從檢體在圖3中,紅色,發出的可見光通過屏障過濾器不允許通過反射紫外光,然後過濾。應當指出,這是唯一的模式,其中顯微鏡標本,激發後,產生自己的光。所發出的光在所有方向上(在一個360度的角度),激發光的方向無關的再輻射球。

熒光顯微鏡是一個迅速擴大的調查和寶貴的工具。其優點是根據屬性不那麽容易可以在其他光學顯微鏡技術。熒光染料的使用使得有可能具有高度的特異性熒光材料之中,以確定細胞和亞微觀細胞成分和其他實體。更重要的是,在熒光顯微鏡可以揭示與精致的靈敏度熒光材料的存在。一個非常小的熒光分子數(50每立方微米的分子數)可以被檢測到。在一個給定的樣本中,通過使用多個染色,不同的探針將揭示單個目標分子的存在。雖然在熒光顯微鏡不能提供的各試樣的衍射極限以下的空間分辨率,低於該範圍內的熒光分子的存在下顯著可見。

fluo roover view figure3

熒光顯微鏡的技術可以應用到有機材料,以前住(生物)材料,或有生命的物質(與使用在體外在體內的熒光染料)或無機材料(尤其是在半導體晶片上的汙染物的調查) 。也有許多研究使用熒光探針監測快速變化的生理濃度的離子,如鈣和鎂,和在活細胞中的pH值。

許多植物和動物組織中,以及材料和試樣,固有熒光照射時更短的波長的光(主或自體熒光)。自體熒光植物研究,煤岩,沉積岩岩石,在半導體工業中已發現有用的。自體熒光在動物組織或病原體的研究,往往是極其微弱的,或如非特異性自發熒光用處很小。的更大的價值等標本,通過照射光,被激發和發射的光的最終產率是力度更大的外在熒光染料(也稱為熒光團)。這樣的熒光被稱為次級熒光。

熒光染料漬,有點類似較知名的可見光吸收組織汙漬,重視自己可見或亞可見的有機物。這些熒光染料,能夠吸收,然後再照射光,往往是高度特異性的,在他們的附件定位在吸收發射比(稱為量子產率的概念,並有顯著的產率這使得熒光染料極其寶貴的生物應用。使用熒光顯微鏡的增長,數以百計的熒光染料與已知強度激發曲線(吸收)和排放和理解生物結構目標的發展是緊密相連的。

圖4中所示的兩個最常用的熒光染料,在熒光顯微鏡。流行的核酸染色,4',6 -二脒-2 -苯基吲哚(DAPI),在圖4中左邊的分子,是具有兩個親核性很強的脒基部分,這是有用的熒光標記核酸的吲哚衍生物,並具有被廣泛地應用於病原體的快速鑒定的熒光分析。最初作為一個潛在的抗錐蟲劑的合成,DAPI結合腺苷和胸苷(AT)堿基對的DNA區域中被激發的最大吸收波長為355納米的紫外線。在可見光光譜的藍色區域中的染料發出熒光。DAPI分子的右側(圖4)是另一種熒光染料,德克薩斯紅,熒光共軛物中的屬性已經過深入研究。此熒光染料被開發用於在應用程序中的雙標記被稱為流式細胞儀,但廣泛地用於在熒光顯微鏡中用於抗體檢測的羅丹明(另一種常用的熒光染料)。

在許多情況下,組合使用得克薩斯紅用DAPI和異硫氰酸熒光素(FITC)的乘法,由於紅色,藍色,和綠色的熒光染料,可以觀察到染色標本。當決定哪些標簽使用熒光顯微鏡,它必須牢記,選擇應具有較高的熒光激發光吸收的可能性,並應保持連接到目標分子。還應該能夠提供令人滿意的產率發射的熒光的熒光。

fluo roover view figure4

熒光顯微鏡的最重要的應用之一是在免疫熒光字段活的動物製造無數的使用,配合白血細胞,以消除任何進入異物,如病毒,細菌,外源蛋白,其中含有或產生抗原的抗體。抗原-抗體反應是高度特異性的,常示意性地比作鎖和鑰匙的關係。免疫熒光顯微鏡的敏感性和高度的特異性免疫展出之間的婚姻將其成功歸功於。

在直接免疫熒光法中,被標記的特異性抗體,通過化學附加熒光色素的形成,什麽是已知的作為共軛物含有懷疑存在已知的一個特定的抗原刺激抗體的生產顯微鏡載片上,然後將其傳播。如果抗原存在時,標記的抗體結合物與抗原結合,並結合到所述試樣被洗滌之後。當被激發的熒光在其激發峰,隨後在不同波長的發光強度可以被目視觀察或捕獲的檢測器係統(數字或傳統相機)的化學附著的熒光共軛物和抗原的存在下證明。

另一種常用的技術被稱為間接免疫熒光法,其中可能含有未標記的抗體及其相關的,但已知的血清,抗原一起孵育。甲熒光標記的抗人抗體(如果被測試的試樣是人類),然後放置在幻燈片上含有的未標記的抗體-抗原。如果確實出現了抗原-抗體反應,熒光素標記的抗人抗體附著形成的複合物的抗原和抗體。隨後,抗原,抗體,和熒光染料標記的抗人抗體的標記的分組在該熒光強度的峰值波長激發,觀察到任何因此而產生的排放。間接免疫熒光技術,降低庫存大量標記抗體的必要性,也通常會導致更大的熒光強度。

à相當麵積的熒光調查與細胞化學和組織化學染色。熒光染料已被用於識別染色體DNA含量,蛋白質,細胞結構,激素和維生素。熒光顯微鏡是一個功能強大的工具,在這些研究中,因為所選熒光染料精湛的靈敏度和他們極微量標本中特異性。事實上,雖然在熒光顯微鏡是有限的,其空間分辨率受數值孔徑衍射極限,熒光探針的一般規則,可以通過發射光,揭示存在的熒光材料,這種材料可見,即使目前在隻能分分辨率的數量時(例如幾個分子)。

涉及了一批新興的應用熒光顯微鏡熒光探針(熒光染料)生活物資,無論是在體外(玻璃)和體內(在生活中)的應用這些探頭,因為可能的毒性限製繁殖困難。此外,相當數量的重視,必須支付的時間間隔,因為不斷變化的性質的生命過程和細胞內結構的運動。熒光調查已經應用到重要的生物離子,如氫(pH值),鈣,鎂離子濃度的變化,綁定和非綁定,。

其中最有名的是研究細胞內鈣離子熒光探針采用了時下流行的Fura-2 對於這種染料,雙激發波長為約340納米和380納米(使用光斬波器和雙激發濾光片或單色儀)可以監測在一個單一的發射波長,這是衡量獨立地為每個激發帶。一台主機控製顯微鏡是用來計算的比率(被稱為熒光成像過程)綁定到細胞內遊離鈣熒光強度的變化所揭示的。的比的方法的優點是,基本上所有的因素,除了雙近紫外光的激發波長,其中每個產生在可見光譜的綠色部分中的排放保持恒定。用探針被稱為印度1比成像進行類似的類型對於該熒光染料,綁定和非綁定的細胞內鈣的測定,也可用於一個單一的激發波長,但發射的測量是在兩個波長區分綁定未結合的鈣。



滬公網安備 31011202003519號