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徠卡顯微鏡:熒光相關光譜

2013-10-16  發布者:admin 

熒光相關光譜(FCS)的測量的熒光強度的波動,在一個子femtolitre卷來檢測這樣的參數,擴散時間,熒光標記的分子的分子或暗的狀態數。在20世紀70年代初,該技術是自主研發的瓦特·韋伯和魯道夫Rigler。的術語FCS鑄造,由韋伯實驗室。這項突破性的技術是引進共焦光學Rigler和同事,在20世紀90年代初增加其靈敏度單分子水平隨著更高的靈敏度與激光掃描共聚焦顯微鏡FCS儀表的可用性乘以其效用生物學。應用包括分子大小,聚集狀態,綁定和生化反應動力學,無論是在體外在體內的測定

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FCS - 的方法

FCS是一個光譜的方法。在這種情況下,“比色皿”是受衍射限製的點(圖1)。因此,使用顯微鏡的原因,是具有高數值孔徑的透鏡將光束聚焦到一個femtoliter大小的光斑。一個可喜的副作用有顯微鏡能夠采取的樣品圖像引用和定位測量點(ROI)。在FCS小學讀出​​熒光強度隨時間(熒光的跟蹤或強度跟蹤)。的熒光的波動隱式編碼的粒子數(即振幅波動)和粒子的停留時間(即頻率的波動),見圖2。一個進行自相關分析,(“自相似性”試驗)和曲線擬合,定量地獲得這些參數(圖3和4)。共聚焦點的激發和檢測的光的幾何形狀大致如下一個三維的正態分布。近似​​高斯函數,人們可以找到FCS自相關函數的分析模型。它的參數和它們的物理意義總結於表1。

36-1_2_02

 1(左):觀察量和重要的參數。擴散時間τ<SUB> D </副>表示分子觀察量內花費的時間,即需要多長時間橫向擴散。的橫向延伸(光束束腰),瓦特<SUB> 0 </次>,和軸向延伸部分和z <SUB> 0 </ sub>的觀察量(右側)。他們比Ž<SUB> 0 </ SUB> /瓦特<SUB> 0 </ SUB>是偏心率或結構參數,κ。
圖。2(右):熒光強度跟蹤。流入和流出的觀察量(上排)的分子的運動導致的熒光強度的隨機波動。

 

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 3(左):自相關原理。熒光跟蹤乘以本身被複製,並總結出的結果。這樣做是為了多次,每次移增量設定的第二數據τ<SUB> </ sub>的(滯後時間)。小的滯後時間後,數據仍然是自相似的,產生一筆較大(紅色)。更長的轉變意味著更小的數字(綠色和藍色)。這種技術通過觀察量的分子擴散的頻率分析中的基本信息。
圖。4(右):自相關函數G(τ)被繪製在滯後時間t。從圖3(紅,綠,藍點),G(τ<SUB> </ sub>的)代表不同的滯後時間定性繪製。在G(0)的振幅,編碼的粒子數N的時間在半最大振幅(INFL撓度點)產生的逆擴散時間τ<SUB> D </ sub>的,也被稱為為相關時間。從這些數字中,AG亚游集团可以得到的濃度c和擴散係數D使用適當的校準。

 

詳細“解剖”的FCS曲線,即過程的觀察在什麽時間域,以及一般介紹的主題,請參閱佩特拉Schwille和埃爾克·斯特因一篇網上文章  

 

3D高斯三聯模型

GT-Equation

 

參數

意義

ρ

電流幅度

G(0)振幅貢獻的分子種

τ ð

擴散時間

V EFF內花費時間分子

τ Ť

三胞胎時間

在黑暗狀態下度過時間分子

Ť

三聯分數

在黑暗狀態下的分子分數

κ

結構參數

的V EFF的偏心率,κ= Z 0 / W 0

表1:三維高斯三重模型數據擬合一個分子物種和正常擴散3D參數。

 

校準 - 從相對絕對數字,

FCS測量感興趣的是兩個主要的參數的擴散係數,τ ð,分子的數目,N.他們直接相關的擴散係數D,和濃度角分別。然而,無論τ ð和N,是由每個單獨的儀器和一些實驗參數的影響的相對數。取得的絕對編號D和c是儀器校準的目的。

有效體積

這兩個參數,擴散時間和數目的分子,這取決於觀察量的大小。應當這裏所指的有效容積,V EFF校準是確定的V EFF的大小

校準策略

三種方法確定V 效率的文獻中描述:

  1. 共焦量用熒光珠在3D及裝修的一個三維高斯函數的測量。
  2. 準備濃度係列和N作為繪製c的函數。斜率產生V EFF
  3. 已知的染料與已知的D.曲線擬合產量測量τ ð和κ,其中V 效率可以計算出來。

每種方法都有其缺點和優點。對於實施例1。共焦量,給出了一個確切的描述細節以及3D高斯近似持有。這是不測量在水溶液中的實際測量一樣。第二種方法是modelfree的,V EFF或擴散模型的幾何形狀作出任何假設因此,它含有沒有關於它的形狀,它是費力,而且可能遭受黑暗的狀態,如果無科幻擬合曲線被用來估計N,但它工作在一個大的濃度範圍內。最後一種方法的條件下,非常接近實際FCS測量,包含了一些信息的幾何形狀的V EFF可以輕鬆實現。在下麵,AG亚游集团將研究這一戰略一步一步。所有三種方法進行了詳細的比較

通過曲線擬合得到的有效容積

由於這種方法是基於曲線擬合的結果,質量非常強烈的依賴,對如何做好模型描述了現實。最強的假設是一個三維高斯幾何形狀的V EFF,通常做在FCS分析。因此係統的錯位將導致違反了這一假設。此外,一個很好的信號-噪聲比的自相關是必需的,因為τ ð和κ都確定擬合相同的數據集。這是最好的滿足明亮,光穩定的染料在水中的濃度範圍從0.1納米到10納米[1] 的有效體積,然後給出在方程1。

36-Equation-1
 

 

公式1:有效容積。觀察體積的大小有關的FCS測量與瓦特<SUB> 0 </子>的橫向和z <SUB> 0 </ SUB>的軸向延伸。這兩個參數依賴於τ<SUB> D </次>和κ得到的曲線擬合的校準測量。請注意,這V <SUB>有效</ sub>的是大於2 ^(3/2)〜2.8的一個因素在文獻中通常被稱為共焦體積。



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