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徠卡顯微鏡:熒光簡介

2013-10-16  發布者:admin 

熒光是由喬治·加布裏埃爾·斯托克斯在1852年首次被發現。他指出,螢石開始發光後,用紫外光照射。熒光是一種形式的,它描述了由輻射產生的光子的材料被光照射後的光致發光。所發射的光具有比激發光的波長較長的。這種效應被稱為斯托克斯位移(Stokes shift)。

 Application

 

作為一種工具,熒光顯微鏡

被廣泛用於熒光顯微鏡觀察特定的分子的分布的一個重要工具。大多數細胞中的分子不發出熒光。因此,他們被稱為熒光染料的熒光分子標記。可以直接標記的感興趣的分子(例如DNA用DAPI),或者它們可以被耦合到特異性抗體的免疫染色的熒光染料。通常是固定的細胞所必需的免疫染色。

熒光顯微鏡也允許時間推移成像活細胞或組織。為了這個目的可以被標記蛋白質的利益,如GFP(綠色熒光的蛋白)基因編碼的熒光分子。感興趣的分子(例如鈣2 +),也可以使用可逆地結合合成染料(例如,呋喃-2)或遺傳修飾的天然存在的蛋白質(如GFP的衍生物)標簽。

電子的能量狀態的變化導致發光

發光描述一個電子從激發態到較低的能量的狀態下的變化所造成的發光效應的發生。電子可以存在於不同的能量狀態。電子的基態是一個非常穩定的狀態,並具有最低的能量水平。如果電子吸收能量時,它們可以被提升到一個更高的能量水平,提供一個激發態。由於更高的能量比基態激發態,能量被釋放時返回它的基態電子。這種能量可以釋放的形式發射光子。

有幾種形式不同的方式,係統被激發,例如,在電致發光係統通過電流激發發光,化學發光的發生是由於發生化學反應而從通過光子激發的光致發光的結果。

可以進一步分成兩個小組,熒光和磷光的光致發光。熒光和磷光之間的主要區別是其發光的持續時間。熒光照明停止時立即結束。與此相反,磷光可以持續幾個小時後的激發已經結束。

Basics-Fluorescence

 1:當使用一定波長的光(激發波長)的光子被吸收的分子的電子擊中的分子(例如熒光團)。然後,電子被從它們的基態(S 0)提升到一個更高的能量水平,激發態(S 1 ')。這個過程被稱為激勵(1)。激發態壽命很短(通常為10 -9 -10 -8秒),在這段時間(2)的電子的能量損失。當電子離開(1激發態返回到基態(3),他們失去了在激勵過程中采取了剩餘的能量。在熒光基團的情況下,能量被發射的光(熒光發射)的較長波長比激發光(並因此使用更少的能源)。這種現象被稱為斯托克斯移位。

熒光的機理

熒光染料的熒光是當它們存在對應的波長的光照射。的波長取決於熒光團的吸收光譜,它必須確保合適數量的能量被傳遞到提升到激發態的電子。後電子被激發,它們可以駐留在這種高能量的狀態下,隻有很短的時間。當電子放寬到基態或其他國家具有較低的能量水平,釋放能量,作為一個光子。在此過程中由於一些能量丟失,增加的波長和能量較低的光由熒光染料相比,所吸收的光的發射。

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 2:COS 7細胞,綠色:未知的蛋白,綠色熒光蛋白,紅色:α-微管蛋白,CY3,藍:細胞核,DAPI。禮貌的卞偉教授,細胞研究中心研究院生物化學與細胞生物學研究所,上海生命科學研究院,中科院,上海,中國

 

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 3:小鼠成纖維細胞,綠色:F-肌動蛋白,FITC紅:微管蛋白,CY5,藍核,DAPI。由君特·吉斯博士,醫學研究的馬克斯普朗克研究所,海德堡,德國

 

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 4:小鼠海馬神經元,藍標記的轉染細胞,綠色:肌動蛋白,TRITC,紅色:紅色,灰色,德州GluA AMPA受體單元:突觸囊泡蛋白,CY 5

 

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 5:果蠅幼蟲,綠色:RNA結合蛋白,Alexa的488

 

磷光的機理

由於磷光的分子可以更長的時間比熒光染料的發光,就必須有一個不同的方式中,它們存儲激發能量。這種差異的基礎上,發現在兩種形式的激勵水平,單線激發態和激發三重態,這是基於對不同自旋對齊。

自旋電子的屬性。以簡化的術語的自旋描述的電子通過其旋轉造成的角動量。一個電子的自旋的方向可以是正的(1/2)或負(-1 / 2)。自旋對較高的能量水平可以是在它們的方向彼此平行或反平行。在反平行自旋對個別的角動量相互補償,總自旋得到的值為零。這被稱為自旋排列單線態。兩個平行的旋轉不補償,並得到一個非零的值。在這種情況下,自旋被說成是在三重狀態。

熒光發生當電子從單線激發態回到基態。但在某些分子,被激發的電子的自旋可以切換到在這個過程被稱為係統間橫穿三重態。這些電子失去能量,直到他們在三重態。此狀態是更高的能量比基態,但也比單線激發態能量較低。因此,電子無法切換回單狀態,也不是他們可以輕鬆地返回到基態,總自旋允許值為零,由於量子力學。因此,這些分子都被困在他們的能量狀態。 

但是,來自三重態到基態的一些變化是可能的時間。這些變化會引起輻射產生的光子和磷光。由於隻有少數事件是可能的時間,三重態呈現一種能源水庫,使磷光可能在一個較長的時間段。

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 6:果蠅幼蟲體育場,綠色:Feb211陽性神經元和軸突,Alexa的488,紅色的纖維部分:中樞神經係統(即所有軸突),CY3,藍核,DAPI。禮貌,德國克裏斯托夫Melcher先生,博士研究所卡爾斯魯厄,毒物學和遺傳學研究所,Eggenstein-Leopoldshafen
 
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 7:鼠標腎部分,綠色:腎小球和曲小管,Alexa的488 WGA:F-肌動蛋白(多見於腎小球和刷狀緣),紅,藍:細胞核,DAPI
 
 
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 8:新生兒心肌細胞,黃色:DNA,的DAPI,綠:Myomesin,Cy3的紅色:鈣粘蛋白,德州紅,藍:肌動蛋白,Alexa的633
 
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 9:中期蔓延FISH - 收購染色染色體熒光體視顯微鏡。的蘇托由美子博士,人類演化實驗室,前沿科學研究生院,東京大學提供
 

熒光顯微鏡

顯微鏡,熒光發光是最有用的一種。可以很容易地與他們的特定波長通過特定的光源(例如燈和過濾係統或激光)可區別於所發射的光的激發光的波長(斯托克斯移位)激發熒光染料。

使用熒光成像,實驗者可以表征分子在細胞內的量和本地化。熒光顯微鏡的另一個優點是,可以同時使用多個熒光染料。的熒光染料隻需要在他們的激發和發射波長變化。因此,可以同時觀察到不同的目標分子,允許一個巨大的各種試驗,例如,以進行共定位研究。



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