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尼康顯微鏡:共聚焦成像模式

2013-10-16  發布者:admin 

共聚焦顯微鏡的主要應用是在厚的部分的各種各樣的標本類型的改進的成像。共焦的方法的結果的能力,通過試樣序列在高分辨率圖像的各個光學部分的優點。一些使用不同的成像方式,全部依靠的光學部分,其基本形象單位。

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單光學部分

光學部分是圖像的基本單位,在激光共聚焦顯微鏡方法。數據可以收集固定和染色標本的單,雙,三,或多個波長的照明模式,並從多個標記的標本采集的圖像將在注冊與對方(如果有足夠的校正色差物鏡像差被使用)。輕微的登記錯誤,通常可以使用數字圖像處理方法來校正。大多數激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCMs)以約1秒獲得一個單一的光學部分,雖然有幾個收購通常是由軟件來提高信號噪聲比的平均值。采集圖像的時間當然會發生變化,與以像素為單位的圖像和係統的計算機的速度的大小。在保存時,一個典型的8 -比特圖像的768×512個像素的大小,將需要約0.3 Mb的存儲空間。

圖1中顯示的是同時收集在三個不同的激發波長(488,568,和647納米),用一個單一的氪/氬激光的光學部分。的標本是果蠅三齡翼成蟲磁盤標記三種基因,涉及圖案翼。三個基因成像和他們各自的熒光染料標記(一)退化的(熒光素 - 496納米);(二)無翅(麗絲胺羅丹明 - 572納米),(三)CID(花青5 - 649納米)。合並後的複合材料的三個空間翼構圖基因表達域顯示在右下方的(圖像(四))。

時間的推移和活細胞成像

時間推移活細胞研究加強與激光掃描共聚焦顯微鏡成像分辨率的提高。細胞的運動進行的早期研究,使用16毫米電影膠片連接到相機上了發條定時曝光,以及最近使用時間推移視頻盒式錄音機,光存儲硬盤錄像機,視頻采集卡。現在,可以使用激光掃描共聚焦顯微鏡,收集在預先設定的時間間隔單一的光學部分。

用激光掃描共聚焦顯微鏡的成像生物體組織比固定的標本成像極為困難的,並且並不總是一個實際的選擇,因為試樣所涉及的條件,可能不能耐受。表1列出了一些要考慮的因素與激光掃描共聚焦顯微鏡成像活細胞和固定細胞。有些標本根本不會爽利的顯微鏡的舞台上,它們不能維持生命在舞台上觀察。的現象或結構還可能無法訪問到物鏡的視場。例如,飛翼成蟲盤的水果太深發展進行成像的幼蟲,解剖出時,他們不能在培養基中培養。因此,目前可用的唯一的方法,在這種類型的組織圖像基因表達是解剖,修複和染色采取成蟲磁盤的從不同的試樣在不同的發展階段。

固定和活細胞成像與物流及供應鏈管理應用技術研發中心

標準 固定細胞 活細胞
照明限額 淡出熒光 染料的光毒性和衰落
抗淬滅試劑 苯二胺等。 沒有!
封固 甘油(1.51  水(N = 1.33)
最高NA鏡頭 1.4 1.2
每幅圖像的時間 無限
感光度標本有限公司速度的現象;
信號平均 沒有
決議 波動光學 光子統計

表1

成功的活細胞成像顯微鏡舞台上需要格外小心,整個成像過程中應采取保持容忍的條件。通過多次掃描,所以應保持在最低限度的必要,以獲取圖像暴露於激光束照射激光束的光損傷可累計。抗氧化劑如抗壞血酸通常加入到培養基中的氧氣量減少,會釋放出熒光分子的激發,導致自由基形成和殺死細胞。廣泛開展初步控製實驗光照射熒光標記的細胞的影響進行評估,保持詳細的注釋,對所有的成像參數通常是必要的,無論他們被認為是相關或不。成像測試,持續經營能力的活標本應進行評估。胚胎,例如,應繼續其正常發育後,成像過程中,應確定由成像或所使用的熒光染料的任何異常引起。時間推移成像圖2給出了一個活生生的果蠅胚胎注射鈣綠色。的一係列的圖像顯示的熒光探針的分布隨著時間的推移的變化。

生活的特殊要求,必須滿足不同的細胞類型,是將被成像。某些細胞如昆蟲細胞,通常可以在室溫下保持在適當的介質中的一個足夠大的體積。然而,大多數類型的細胞需要一個階段的加熱裝置,並可能在適當的二氧化碳平衡時,他們是在顯微鏡載物台期間可以保持灌注室。選擇的細胞類型,是更適合於在激光掃描共聚焦顯微鏡的成像條件,可避免許多實驗的問題。現代共聚焦儀器的改善,潛在的問題都得到了顯著降低。增加光子的效率,更高的數值孔徑物鏡(亮),減光毒性染料標記活細胞共聚焦分析一個實際的選擇。最好的辦法是用最少的激光功率,使成像,並盡快收集圖像。如果針孔孔徑比非生物固定,以加快圖像采集標本的開度較大,成像後的卷積有時可以依靠恢複丟失的圖像質量。

confocal2 figure2

許多生理過程和事件發生的速度比他們可以捕捉由的大多數LSCMs,有圖像采集率通常在每秒一幀的順序。使用LSCMs聲 - 光器件和狹縫掃描速度比的檢流計驅動的點掃描係統,更實用的生理研究。這些更快的設計結合了良好的空間分辨率,時間分辨率好,這可能是每秒30幀的全屏幕分辨率,或接近視頻率。較慢的點掃描顯微鏡係統可達到最佳的時間分辨率,隻通過掃描在試樣上大大減少區域。如果需要完整的空間分辨率,幀必須被收集較少,失去一些時間分辨率。共聚焦係統也能夠使用磁盤掃描振鏡掃描方式成像快速生理或其他瞬態事件。

Z係列和三維成像

甲的z係列是一個序列的收集在不同的高度的光學部分垂直於光軸(z軸)內的標本。Z係列收集協調微調對焦的顯微鏡圖像采集順序在每個步驟的一步一步的變化。焦點中的步驟,通常是通過由計算機控製的步進電機,按預定的增量改變焦點。在計算機中可以使用宏程序,以獲取和保存的圖像,通過編程改變對焦距離在試樣采集和保存第二個圖像,再次改變焦點,所以直到編程的圖像數量已經收集。

從z係列通過一個地區的利益采取一些圖像可能被提取,並在圖像處理程序合並,突出感興趣的細胞。的z係列也可以作為一個蒙太奇圖像,如在圖3中所示的顯示。這種類型的圖像組合和顯示,以及許多其他的圖像操作,是目前大多數商業圖像采集和處理軟件的標準功能。圖中所選擇的圖像(圖3)是表示沿z軸的增量更小的更大範圍內的一係列的代表。綠色發光汙垢定位外周神經係統的被標記為與指定的抗體22C10果蠅胚胎。

confocal2 figure3

它可以是概念上是困難的複雜的相互連接的結構從幾百光學部分用激光掃描共聚焦顯微鏡的試樣的體積,通過采取了一係列的可視化。一旦收集,然而,Z-係列是理想的進一步加工成的標本使用量可視化技術的三維表示。這種方法是目前常用的澄清的結構和功能之間的關係,在生物和醫學研究的組織。重要的是,圖像被收集在一個適當的z電機的步長改變焦點,使試樣的實​​際深度反映在圖像中。隻要試樣本身不移動的圖像采集過程中,在激光掃描共聚焦顯微鏡產生的z係列將是完美的寄存器,並保存在數字格式,它們被相對容易地加工成一個三維表示的試樣。圖4給出了一個單一的光學與z係列的凸台(b)條的(a)部分的比較,並且示出的值,該值在此技術中,在可視化的果蠅染色,外周神經係統的抗體22C10。

所采取的步進電機的步長大小,並設置由顯微鏡操作員,是關係到光學部分的厚度,但他們可能不具有相同的值。光學部分的厚度是指通過顯微鏡成像的樣品的部分的厚度,和取決於物鏡和所用的針孔的直徑。聚焦步長和光學部分的厚度在某些情況下具有相同的值,但是,這可能是一個混亂的根源。

以下收購的Z係列文件,它通常是出口到計算機專為處理共聚焦圖像三維重建程序。這種軟件程序在圖形工作站上以極高的速度運行,或當前速度更快的處理器和大量的RAM,可以相當有效地運行在個人電腦上或工作站共聚焦顯微鏡。的三維軟件程序包可以被用來產生一個三維表示的試樣或電影序列的試樣不同的意見,可產生的效果,旋轉或其它空間變換的增強試樣的讚賞編製立體字。該軟件允許各種長度,深度和體積的測量值進行,和的圖像的特定參數,如不透明度可以交互地改變,以顯示在試樣中的不同層次的結構還。

confocal2 figure4

中,串聯的光學部分從時間推移序列可能被利用的另一種方法是對數據進行處理,使時間的z軸成三維表示。這是一個有用的方法,可視化有機體發展過程中的生理變化。這種方法已經被使用的一個例子,其中在澄清鈣動力學在顯影海膽胚胎。顏色編碼的在不同深度的光學部分是顯示三維信息的一個簡單的方法。在實踐中的顏色(通常為紅色,綠色,或藍色)被分配給每個得到的光學部分在不同的試樣中的深度,然後在彩色圖像被合並,且操縱的顏色,使用圖像處理程序,以達到預期的效果。

四維成像

活體組織製劑或其他標本表現出動態的現象提出利用激光掃描共聚焦顯微鏡三維數據收集時間推移序列提交時間作為第四維的可能性。Z係列數據收集的時間間隔,會產生隨時間的4維的數據集,三個空間維度ÝŽ)作為第四維數,這可以被視為使用4D瀏覽器程序。這種方案允許立體聲對以建造在每個時間點,並作為一場電影,或,或者,每個時間點的三維重建回放可以被處理和顯示的電影或一蒙太奇。

XZ成像

如果所需的試樣,如上皮細胞層的垂直切片,xz部分的縱斷麵圖,可以產生以下兩種方式之一。的檔案中,可以通過掃描的試樣(x -軸)的一個單一的線橫跨在不同的z軸的深度由步進電機控製的焦點發生變化,則顯示一係列作為一個合並的圖像構造另一種方法是使用一個三維重建程序中提取的檔案中,從現有的z係列光學部分的剖切麵選項。在建設蝴蝶翅膀上皮細胞在圖5中的圖像進行掃描,激光通過單一的線(水平黑線在左手的圖像)在不同的z軸位置,或深度,進展成試樣。共焦成像係統就建立起來了,並顯示在圖5中的的xz圖像的呈現。翼上皮由兩個上皮細胞層,但作為熒光強度下降更大的深度中的試樣,隻有上層是清晰可見的。

反射光成像

反射或後向散射光成像,所有的早期的共聚焦顯微鏡中使用的攝像模式。許多標本可以在激光共聚焦顯微鏡觀察未染色狀態,利用反射光,或試樣可以用探針就是高度反光,如免疫膠體金或銀顆粒標記。的反射光的方法,特別是對活組織樣本的一個優點是,光漂白是沒有問題的。某些類型的探頭,衰減激光束,另一個潛在的問題是,在某些顯微鏡,可能會發生內部反射從光路中的光學元件。在狹縫的多波束版本的激光共聚焦顯微鏡的反射問題是不存在的,工具很是麻煩的情況下,使用的偏振器或成像相差的工件並可以減輕它離開光軸。

confocal2 figure5

透射光成像

不僅可以用在激光掃描共聚焦顯微鏡,包括相襯,微分幹涉相差(DIC),暗場,或偏振光的透射光的成像模式中通常采用顯微鏡。甲透射光檢測器是用來收集試樣的光通過,一個光纖導光發送信號的光電倍增管的顯微鏡係統的掃描頭中的一個。透射光圖像和共聚焦螢光圖像可以被收購,同時使用相同的照明光束,確保所有的圖像都登記。當圖像組合或合並使用圖像處理軟件,標記的細胞組織內的精確位置可以被映射。在一些研究中的一個的信息的方法是與一種或多種共聚焦熒光標記的細胞的圖像在同一試樣的透射光圖像的檢體,非共結合。使用這種方法將允許的,例如,確定的空間和時間方麵的一段時間的小時或什至數年的未標記細胞的人口內的標記的細胞的遷移的一個子集。

彩色透射光檢測器現已實施,收集發送的信號中的紅色,綠色和藍色(RGB)顏色通道來創建一個實際的彩色圖像的方式,是類似的一些數字彩色攝像機。這種探測器是特別有用的病理學家,他們習慣於觀看真麵目組織在透射光熒光數據覆蓋這些圖像。



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