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徠卡顯微鏡:熒光顯微鏡介紹

2013-10-16  發布者:admin 

熒光顯微鏡的光學顯微鏡是一種特殊形式。它使用目標波長的光激發後發射光的熒光染料的能力。蛋白質的利益可以通過抗體染色或熒光蛋白標記的熒光染料標記的。它允許一個單一分子物種的分布的測定,其量和其在細胞內的本地化。此外,可以進行共定位和相互作用的研究,觀察到的離子濃度,使用可逆地結合染料,如Ca 2 +和呋喃-2和內吞作用和胞外分泌的細胞過程,如觀察。今天,它甚至可以將圖象分的幫助下,熒光顯微鏡的分辨率的顆粒

斯托克斯位移

熒光的一個重要特點是斯托克斯位移。它描述了一個令人興奮和發射的光子的能量水平的差異。由熒光發射的光子是一個令人興奮的光子的波長比更大。這是由於被激發後的熒光染料,但在此之前發射的光子的能量釋放到周圍環境中。由此產生的波長偏移,使得它可以令人興奮的和出射光之間的區分。可以被看作是具體特征的分子物種的吸收和發射的能量。

熒光顯微鏡

直立或倒置熒光顯微鏡()是類似於一個普通的光學顯微鏡下,除了用激光為單色光或水銀燈或氙弧燈像一個充滿生機和強大的光源提供照明。此外,它還包含一個激勵濾波器和發射濾波器。激發濾光片傳輸隻能夠激發試樣,用其特定的染料的光。由樣品發射的光到達檢測器之前,通過發射濾光片。由樣品發射的光到。隻與一個不同的波長的光的透光性,例如由試樣發出的光的發射濾光片

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 1:通過熒光顯微鏡的光路

 

近年來,發光二極管(發光二極管)也被用作光源,用於熒光顯微鏡。由LED發射的光的波長取決於用於生產的材料。然而,在大多數情況下,需要的激發光濾光片,因為LED通常在一個相當寬的波長範圍內發射光。

大多數熒光顯微鏡落射熒光顯微鏡。照明器和物鏡被定位在試件的同一側,並通過試樣的光不通過。除了激發和發射濾光片,分色鏡,需要為這種熒光顯微鏡。甲二向色反射鏡,使目標波長的光通過,而其他波長的光被反射。過濾器和分色鏡經常一起插入在過濾器中的多維數據集。

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激發光通過激發光濾光片和分色鏡。這反映了對試樣的光通過物鏡。標本中的興奮和熒光染料發出的光子。這個發射光線通過客觀的分色鏡。所發射的光具有適當的波長,並且能夠通過。由試樣反射的激發光,無法通過二向色鏡,會被阻塞。如果激發光能夠通過分色鏡將被阻塞,當它到達發射濾光片。可以測量的檢測器的發射過濾器的光通過。 

在熒光顯微鏡中使用不同類型的過濾器。帶通,長傳和短通濾波器可以區分的。傳輸的頻帶的波長帶通濾波器,而具有更大或更小的波長的光將被阻止。長傳和短通濾波器邊緣過濾器。長通濾波器的長波長的光傳輸。與目標的截止值以上的波長的光將無法通過。相比之下,短通濾波器傳輸短的波長,並阻止長

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 3,綠色熒光蛋白轉基因小鼠胚胎

 

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 4:熒光原位雜交染色體。紅色:TRITC,藍色:CY5,綠色:FITC

 

在熒光顯微鏡中的不同的技術

熒光顯微鏡被廣泛使用,並提供了巨大的特異性。的各種技術使人們有可能以解決不同的問題,甚至規避,阿貝描述的衍射極限。

可確定的分子物種的本地化與助染色的細胞器,如細胞骨架或膜。共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM),使得它可以觀察到在該樣本中沒有信號從外部的焦平麵的區域,並允許光學切片。全內反射顯微鏡(TIRF)是一種技術,它允許接近到細胞表麵的薄區域的觀察。在這方麵的一個漸逝場激發的熒光染料。

觀察一個分子物種的動態變化的一種技術是熒光漂白後恢複(FRAP)。在一個受限製的區域的熒光染料的光漂白和未漂白的分子的擴散,進入此區域可以測量。熒光能量轉移(FRET)的顯微鏡,可以進行交互研究。一個興奮的捐助生色團的能量轉移到受體熒光激發它。如果兩者都匯集了非常密切的,這是唯一可能。如果這些染料被耦合到不同的蛋白質,它們隻能夠傳遞能量,發出熒光的蛋白質,如果彼此交互。  

技術,使受激發射損耗(STED)顯微鏡,地麵狀態消耗(GSD)顯微鏡,單分子和基態耗盡顯微鏡由單個分子的回報(GSDIM),光敏定位顯微鏡(PALM)和隨機子高分辨率圖像光學重建顯微鏡(STORM)。子顯微鏡用於這些技術也被稱為作為nanoscopes,因為他們解決在納米尺度的圖像。

Application

 5:Pukinje的細胞,矢狀節三重標記小鼠小腦皮質。紅色:anti-calbindin-D28k/Cy3,綠色環保:,藍色anti-GFAP/Cy5:赫斯特33258

 

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 6:鼠標組織切片,自發熒光,熒光壽命microcsopy(FLIM)



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