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徠卡顯微鏡:明亮的熒光共振掃描

2013-10-16  發布者:admin 

觀察的快速生物過程需要高速成像係統。共聚焦掃描顯微鏡有一個固有的障礙:串行記錄的圖像元素。因此,基於攝像頭的係統,或其它的方法(不是真正的共焦掃描方法)被應用。

對於真正的共聚焦掃描係統,隻有更高的掃描速度可以提高時間分辨率。因此,諧振掃描係統已允許行頻率最高為16千赫(非共振掃描儀相比,3千赫)。信號噪聲的討論帶來了意想不到的好處共振掃描:,熒光亮和熒光染料照片預應力。

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真正的激光共聚焦掃描照明模式

真正的共焦成像需要一次在單個點的照明和觀察。為了創建一個二維圖像,這點需要掃描的區域,該區域將被成像。掃描通常是由兩個反射鏡,可以指向在x方向和y方向的斑點。像在其他的掃描係統(例如光柵電子顯微鏡或 20 世紀的電視管),光點掃描線由左到右(x方向)和從頂部到底部的幀(y方向)。

樣品中的某個位置(例如一個熒光的位置),經曆了一個光脈衝,每次束移到那個位置。現貨理想艾裏形。照明的持續時間,即τ p通過的位置,依賴於波長和NA 的時候,樣品中的實際的掃描速度和衍射圖案交叉的位置時的高度。衍射圖案通常遠大於熒光染料(150 ... 1000海裏與2 ... 20納米)。

對任意圖像進行掃描,會體驗到一種熒光染料,如在圖1中所示的照明脈衝模式。燈飾由於過采樣之間的時間間隔的1 / f L,f L表示該線路頻率。真正的共聚焦顯微鏡的典型線路頻率躺在1千赫左右,但可能範圍從10 Hz〜2 kHz的。

記錄,可對每個圖像,的flourochrome會遇到如上述的照明脈衝圖形。脈衝模式之間的時間是由圖像重複時間的1 /女F,無論是有限的掃描速度(通常簡稱為幀每秒“幀)或故意延長,這是典型的延時實驗生理學。F F 表示“幀頻”。

(注釋:對於仿真,可以假設,隻穿過一次,每幀的矩形脈衝,後者的假設是與過采樣(奈奎斯特 - 香農)的要求相矛盾,但並不主要幹擾的影響,三重峰積累)。

Figure-1

 1:受衍射限製的點掃描的圖像的過程的。被照亮的特征(比較小的衍射光斑延長)多次,這裏表示的線K,L和m。每一次,衍射圖案是不同的,根據模式和掃描線的距離的幾何形狀。

 

 

 

低劑量率:更少的三重態

脈衝掃描圖像中的照明和熒光過程,涉及三重態(這是最常見的標準熒光染料)的概念,AG亚游集团現在可以了解真正的共焦掃描係統具有快速(相比較低的高速掃描儀)的結果建議一個更好的熒光信號和漂白時,用人共振掃描係統。

如果沒有三胞胎本,照度的量子產率的熒光團的熒光光子的量將取決於。的照明接通時,排放量將增加(增加的速度取決於熒光壽命),並保持在一個恒定的水平。隻要AG亚游集团允許有些激動分子搬離到三重態,他們不再是可產生熒光光子。因此,排放量將減少。AG亚游集团甚至可以假設所有的分子都在三重態的情況下,隻有非常偶然,三重態鬆弛到基態時,熒光機械工作很短的時刻,冒出一些光子,並盡快停止分子進行係統間的過渡和保持暗三重態。這種極端的情況是一個現代化的超分辨率技術:地麵狀態耗盡(GSD)的基礎。但是,即使在極端條件下少,三重態減少的金額準備發射的熒光染料。和從T到G的鬆弛慢(取決於分子的量子參數)。

如果AG亚游集团停止照明,熒光顯示實際的熒光衰減時間將減少。漸漸的,速度卻慢得多,三重態分子也將返回到基態,當他們準備再次產生熒光。顯然,很重要,無論AG亚游集团試圖得到的排放,在一個單一的,長的照明(三重態強度降低),或在一對夫婦的小劑量用一些時間來放鬆之間(仍然假設總照射劑量是恒定的!)在後者的情況下如果該場所是在三重鬆弛(R)或更長的時間的範圍內,AG亚游集团將收集更多的光子,在末端。這是明亮的成像在同等照度劑量相同。

避免三重態有一個額外的好處:的樣本將漂白少。作為指出,很大一部分是由於漂白激發三重態。如果AG亚游集团能夠避免這些國家的積累,分子光化學解體的風險較小。

  1. 低線頻率增加照明脈衝之間的恢複時間,但也增加的照明脈衝時間,更慢點動過樣品。一般,這種較慢的運動增加了三重峰濃度。隻有非常低的強度,可避免這種效果。
  2. 高線頻率縮短照明脈衝之間的時間,從而增加了三重積累。另一方麵,每脈衝的光照時間是較短的,因此較少的三胞胎被累積。
  3. 如果相同劑量的光施加在小劑量乘以頻率的n倍,累積或平均n次,將增加,如果總的熒光衰減時間顯著長於脈衝之間的渡假。在這裏,共振掃描儀是最有益的。
  4. 如果三重峰衰減慢於行頻,隔行掃描的過采樣將提高信號。在這裏,後續幀收集信息,否則重疊線。例如先掃描每5 ,2 掃描,每5  + 1行...等等。在這種情況下,照明脈衝之間的三重恢複允許的時間幀頻率f F統治
  5. 在任何情況下,最好是使用短的照明脈衝,即快線頻率。共振掃描係統(目前,振鏡光學掃描設備提供高達20 kHz),因此提高了信號 - 噪音和減少漂白和光毒性一般選項。

Figure-3_07

 3:分裂熒光照射劑量。在左側,單劑量應用。熒光強度顯示為綠色。由於三重峰積累(紅色曲線)時,熒光強度降低。總收率類似綠色曲線下方的麵積。在右邊,相同劑量應用分成兩半。在休息時間,三重積累消失(紅色曲線)和熒光再像以前一樣強烈。這裏的兩個區域和大的產率相比,在單脈衝實驗。

三重態,熒光暗態

適當的色彩與光(光子能量)照明時,熒光染料可以吸收從地麵狀態G,光子和過境到激發態E.在分子中,這些狀態顯示了一係列的子狀態(振動狀態)。當興奮到這些振動狀態,分子很快會放鬆到最低的子狀態(在低溫下,如室溫)。從激發態,分子將返回到基態。典型的剩餘時間在激發態取決於分子中的電子係統中,被稱為“熒光”。激發態衰變到地麵狀態指數。在適當的條件下,衰減其他光子觸發。這種現象被稱為受激發射(見STED超高分辨率顯微鏡)。過渡到基態時,能量被釋放通過發射一個光子。在共同的熒光過程(自發輻射),所發射的光子的能量是由振動能量差小於激發光子的能量。因此,有一個更短的波長(激發),以較長的波長(發射)的斯托克斯位移(Stokes shift)。

根據分子上,也有可能被耗盡後,激發態的其他途徑。最突出的非熒光的方法之一是一個所謂的“係統之間的十字路口”,ISC。在這裏,的分子進入狀態,大力E和G.之間對於量子力學的原因,這種狀態被稱為“三重態的”T,從這裏到地麵狀態的衰減很慢。因此,分子是“關閉”假設三重態的時間。還有其他一些國家,其中一個熒光非熒光,尤其是最重要的熒光蛋白顯示各種“黑暗狀態”,不一定三重態。這裏發現熒光產量報告也將適用於非三重黑暗狀態。不可逆的熒光破壞(漂白),可能需要不同的論證。

三重態的討論用於漂白的主要來源之一。尤其是激發三重態傾向於與分子化學中斷。在模擬中為了簡單起見,可以假設所有熒光染料三重態吸收額外的光子將被不可逆地破壞(漂白)。

Figure-2

 2:雅布隆斯基圖熒光激發,發射和三重轉換。可能被激發熒光(防爆)從地麵狀態G到激發態E.該係統將很快放鬆在熱亞(虛線,適用於所有過渡)最低。從興奮狀態,係統可以返回到基態(EM)所釋放出的能量作為發射光子。興奮狀態,也可以輸入一個三重態T係統間穿越過程(ISC)。從這裏,它可能慢慢返回到基態(R)。或者,特別是在吸收進一步的能量,分子化學分解,因此結束漂白的(BL)。

 



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