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新聞資訊

徠卡顯微鏡:多波長在熒光顯微鏡落射照明

2013-10-16  發布者:admin 

 

熒光是一個過程,其中已吸收的光(光子)後的物質emitts的輻射的波長(顏色),其中長於吸收光,這個排放停止後立即停止激發。這種現象是熒光顯微鏡及其應用的基本元素。

除此之外,古典在光學顯微鏡下的熒光激發,有可能兩個或多個光子具有較長wavengths比發射的激發激光共聚焦掃描顯微鏡通過現代技術來獲得相同的發光效果。

 

熒光作為autofluorescenc的生物和/或無機結構或所謂的次級熒光的特殊染料(熒光染料,熒光標記物)的處理後的檢體發生。要執行熒光顯微鏡,必須滿足以下要求:強大的能量源(高壓汞弧燈,鹵燈等),選擇的激發光發出的輻射完美的足夠的透射濾光器的係統(filterblocks)的,,最後但並非最不重要的是,適用於熒光,即集電極鏡頭,照明,分光鏡,物鏡,管鏡頭和目鏡光學零件和服裝。

 

 

與今天的情況相比,在第一次施加透射光場和暗場顯微鏡的使用熒光顯微鏡。這是由於其有限的護林員在那些日子裏的應用。但隨著組織學,細胞學,分子生物學和免疫診斷其重要性日益增加的需求,從根本上改善照明和觀測技術來越來越多。這是入射光熒光顯微鏡誕生的時刻。

在其近40年的應用和發展的過程中,這種技術成為常規和科研工作,在生物學,醫學,科學和工業的基本工具之一。入射光熒光顯微鏡的進步,尤其是由研究工作Ploem的他的功能引領趨勢也正向萊茨RESP戰略決定。韋茨拉爾徠卡光學儀器發展需要。

這個發展過程中是按時間順序描述在目前的貢獻。à提要熒光顯微鏡技術使顯微鏡,物鏡,熒光染料,光源和過濾係統有關的應用領域,並指這方法的相關信息。

 

熒光

熒光是一種分子的現象,其中一種物質的光吸收(激發)和輻射光的較長的波長(發射),在很短的一段時間內。當熒光染料吸收光能量的光子的形式,導致的電子激發到較高的能態。光子吸收的過程中,非常迅速,後麵緊跟著一個返回較低的能量狀態,然後,伴隨著輻射產生的光子,如果在視覺範圍內的光發射,可以觀察到。

這短短的時間(納秒),使其區別於其他形式的如磷光發光。在激發和發射峰的波長之間的差異被稱為斯托克斯位移(Stokes shift)。具有較大的斯托克斯位移的熒光染料很容易激發和熒光顯微鏡觀察其排放。透射光照明下,小斯托克斯位移可能使其無法照亮熒光激發峰和,觀察熒光色在其發射峰。

 

共焦激光掃描熒光顯微鏡使比所發射的光的波長越長的光子與雙光子激發。然後使電子激發態所需要的能量的一半的兩個光子同時到達。在大多數情況下,結束了在同樣興奮的狀態,與正常的單光子激發電子之前下降到基態。同樣地,發射的熒光發出了由正常的單光子激發的是類似的。

 

熒光染料

許多分子,非有機和有機,顯示熒光,尤其是使用高能輻射激發。當植物或動物組織的興奮與UV光很多時候,觀察到一個藍色的熒光發射,這被稱為初級熒光,或自體熒光。天然存在的物質通常有很寬的激發光譜和發射光譜。隨著分子生物學的發展,研究已集中在特殊染料與明亮的熒光,以區別於可能自發熒光。用於選擇性地染色重要的生物分子的染料被稱為熒光染料。當共軛的抗體或核酸,它們被稱為作為熒光標記物或探針。今天,熒光染料可與峰值發射在紫,藍,綠,橙,紅和近紅外光譜區。用橙色和紅色的光來激發熒光染料和檢測的紅光和紅外光的熒光用光電倍增管或CCD相機的可能性已擴展的可視範圍以外的熒光顯微鏡。熒光的激發和發射的可能轉向細胞環境的變化。某些染料,尤其是選擇,因為它們的激發或發射光譜移出後,在細胞內的介質(如鈣,鈉,pH值)中的一些離子的濃度變化。

 

落射熒光顯微鏡的早期發展

對於熒光顯微鏡的曆史評論的讀者被稱為卡斯滕EPI照明(垂直入射激發光)已經PolicardPaillot。一些工具由徠茲(徠卡),博士倫博士倫,賴克特和蔡司,其中部分建議的基礎上的Ellinger和希爾特,歌手:梅勒和匹克。一個早期的萊茨(徠卡)熒光落射照明係統由Haitinger描述。欲了解更多詳細信息,落射熒光顯微鏡的演變,讀者可以參考羅斯特和入射光熒光顯微鏡早期應用豪瑟

落射熒光顯微鏡中的一個主要貢獻是事故照明引進雙色鏡UV光由布倫伯格和Krylova。具有一定的落射照明光的優點,因為不像透射照明,聚光鏡和物鏡物鏡有獨立的光軸必須完全一致。的物鏡函數作為聚光鏡作為聚光的物鏡,避免了所有的對齊的問題。分離自激發光的熒光發射,使用分色beamspitter,容易得多與transmittted光熒光顯微鏡,這些可能性沒有,但是,不會導致常規熒光顯微鏡落射照明工業顯微鏡製造商普遍接受。這種情況的主要原因可能已經透射光的暗視野紫外光的激發熒光顯微鏡在大多數應用中,給已經很優秀的結果。其更換紫外落射照明不會有顯著的優勢。使用暗場聚光鏡的透射光的使用仍是行業標準,直到60年代後期。

分子生物學的興趣迅速增長,但是,導致許多抗體(單抗)的發展的重要的大分子在細胞檢測。要研究具體的幾個大分子細胞器的形態位置,用不同顏色的熒光標記物被越來越多地使用。紫外光激發 傳統熒光顯微鏡的使用 不是最適合同時檢測多種熒光染料,在一個單元格。

1962 Ploem左右開始工作,與Schott合作的發展分色beamspitters的藍色和綠色的光反射熒光顯微鏡落射照明。當時他的第一個通信[1965]和落射照明出版物窄帶的藍色和綠色的光,他是不知道的紫外光激發分色分光器的開發與入射光布倫伯格和Krylova。也不是徠茲公司,而他獲得的的“Opak”落射照明用中性分光鏡。此照明燈進行修改,以在入射光路包含四個分色分束器包含一個滑塊,分別為紫外線,紫色,藍色和綠色激發光。此裝置,在阿姆斯特丹大學的發展,允許不同的分色分束器輕鬆地交換入射光路(圖1a)。的激發光的波長,因此可以很容易地和迅速地改變。

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圖 1a的:熒光多wavelenghts的落射照明器與四個二色光束分離器安裝在一個滑塊上,用紫外線入射照明,紫色,藍色和綠色的激發光的。建在阿姆斯特丹大學(Ploem1965)。

 

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圖 1b中:萊茨原型(沒有商業化的)與4個二向色分束器安裝在一個滑塊(Ploem1967)的多波長的落射照明。

 

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圖 1C:萊茨落射照明器與四個可交換濾光塊(塊)(卡夫,1972)。

 

不久與窄帶藍色和綠色的光激發它變得清晰,廣泛應用於免疫熒光異硫氰酸酯(FITC)和異硫氰酸四甲(TRITC)標簽檢測開辟了最佳的可能性。使用的藍色和綠色的激發也最小化的自體熒光的組織成分,與傳統的透射照明用UV光遇到不期望的效果。FITC現在可以興奮與窄帶藍色光(使用濾除帶外幹擾的半寬度為16nm),在490 nm處(長波長藍色)的最大激發,清楚地觀察到綠色熒光發射峰在520納米。最小化組織成分的自體熒光(圖2ab),在一個高的圖像對比度。激發FITC接近其最大激發啟用,即使是高壓汞弧燈,有沒有強烈的排放峰值在藍色波長範圍內,可以用這樣一個高效的激勵。此外,落射照明用的第一次啟動,激發富爾根副薔薇苯胺的強汞(圖3ab)在546 nm處的發射譜線的綠色反射分色鏡。

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圖 2A:照亮寬波段紫外線激發與immunolabelFITC)標記的組織細胞。注意藍色自發熒光的組織結構。

 

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圖 2B:相同的組織和相同的免疫染色FITC標記落射照明使用窄帶藍色(490 nm)的光照亮。請注意,增加圖像的對比度(Ploem1967)。

 

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圖 3A:肝組織。細胞核染色進行DNA Feulgen反應pararosanilin的,可視化與傳輸綠燈。這汙點被稱為吸收汙漬,不知道是熒光。在晶核上亮起,導致事件窄帶綠光(546 nm)的紅色熒光。

 

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圖 3B:肝組織。核Feulgen反應副玫瑰苯胺染色的DNA。落射照明與窄帶綠光(546納米)和二色分光鏡反射綠燈。大概顯微鏡用綠光激發(Ploem1965)的第一個例子。注意:大的圖像對比度。

 

Bildschirmfoto在他的第二次出版的多波長落射照明器,描述一個的萊茨原型與四分色光束spittters(圖1b),Ploem 承認布倫伯格和Krylova的貢獻。俄羅斯在這一段時間的研究,沒有任何主要的工業發展在俄羅斯或東德落射熒光顯微鏡的交通不便是萊茨沒有意識到這樣的發展早的原因。引進外延照明,紫外線,雖然有用的幾個應用程序,沒有被萊茨一個新的技術發展的動機,因為他們已經出色的傳輸暗場紫外光激發的可能性。增加世界廣泛使用的常規熒光顯微鏡在醫療診斷和分子生物學研究,然而,利潤落射照明使用窄帶激發新的可能性,用藍色和綠色的光。由於可以使用標準的高壓汞弧燈,這似乎是一個實際的建議。

隨後,徠茲分別紫外線,紫色,藍色和綠色的光開發了一種新穎多波長熒光epiilluminator的四個旋轉分色分光鏡(徠茲PLOEMOPAK) 。萊茨照明(包含四個分色分光鏡)屏障過濾器和旋轉炮塔激發濾光片在連續幾代增加了。最後一個優雅的落射照明,構建了卡夫含有多組的激發濾光器,二向色分束器和一個阻擋或發射濾波器的組合,一起安裝在過濾器中的多維數據集,也稱為過濾器塊(圖4)。由於此照明燈迅速變成光路允許過濾立方體,多波長照明同款組織成為一個實用的命題。此外,四個過濾器的照明器中的多維數據集可被交換由用戶(圖1c)。兩套不同的四個濾光塊進行組裝,選擇從許多濾光塊,包含組合的激發,阻隔過濾和分色分束器,為不同的應用程序開發。經過建議Ploem,利時也產生了一個倒置的顯微鏡落射照明(圖5ab)。多波長熒光顯微鏡的的萊茨PLOEMOPAK照明的審查,被稱為讀者評論普盧塔

 

左:圖。4:完成萊茨(徠卡)過濾器的立方體(塊)含有熒光顯微鏡:激發濾光片,分色分束器和發射濾波器(壘)。

 

 

 

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圖 5A:徠卡倒置熒光顯微鏡,多波長落射照明。

 

 

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圖 5B:寺崎®塑料托盤與人類淋巴細胞移植研究後熒光細胞毒性試驗。倒置顯微鏡落射照明。

 

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圖 5C:徠茲(徠卡)機動落射照明器與八個濾光塊(塊)。

 

徠茲(徠卡)濾波器立方體係統是如此的高效,現在,39年後,相似類型的過濾器立方體仍然使用多波長熒光顯微鏡最顯微鏡製造商。這種發展最終導致在徠卡的發展,自動化的多波長熒光落射照明器,可容納8個濾光塊不同的波長範圍(圖5c)。當過濾立方體,電腦顯示器上的像素移位避免或保持在低於35 mm膠片由於0像素移位技術的分辨能力之間切換。此照明燈是現在使用的熒光原位雜交方法(FISH)染色體的研究。

Ploem  ,範德Ploeg Ploem和奈恩和Ploem [ 進一步探索過濾器的組合,許多醫學領域的應用也得到了發展。這樣做是與肖特和Leitz合作。Rygaard和奧爾森等人開發了一種新型的短波通高傳輸幹擾濾波器具有非常高的傳輸和尖銳切斷對波長大於490納米的藍色光。

Ploem 結合SP濾波器與1毫米GG 455過濾器,阻止紫外線激發,肖特和建議的綠色光激發和激發一個過濾器Balzers公司開發的類似的過濾器(SP 560 = KP 560)紫光(LP 425 = KP 425)。後者過濾器適用於神經遞質調查。在圖6ab中得到的藍色熒光可以觀察到。

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圖 6a的藍色熒光腎上腺素(加利福尼亞州)的神經叢和黃色熒光肥大細胞(5-HT)所包圍的小血管的大鼠腸係膜。甲醛誘導的神經遞質的CA5-HT的熒光基團的熒光。

 

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圖 6B:相同的組織和染色圖。6AEPI-窄帶紫色激發光照明(LP 3毫米GG 400SPKP425幹擾過濾器),分色分束器495納米,反映了紫光和屏障過濾器LP 460納米。該過濾器立方體permittted的第一次觀察藍色熒光腎上腺素能神經纖維,明顯不同的從黃色熒光肥大細胞(Ploem1971)。

 

從眼鏡行業方麵,早對這些發展中的貢獻和評論寫卡夫,沃爾特,特拉普和赫爾佐格

落射熒光顯微鏡中使用的過濾器中定義的主類(一)主要激發濾光片LP(長傳)和SP(短傳) -德國文學被稱為KP過濾-及(b)二級過濾器作為屏障過濾器和發射濾波器等。後者也被稱為熒光選擇過濾器,例如用於限製FITC熒光峰值在520 nm處觀察到這些。熒光顯微鏡的過濾器已被賦予由賴希曼最近的一項廣泛的審查。

Cormane 首次證明,窄帶藍色光落射熒光標記FITC免疫人體皮膚疾病的研究中得到最佳的對比度。透射光激發紫外線燈,用來引起如此強烈的自體熒光在皮膚的彈性纖維,使可視化熒光抗體嚴重阻礙。

在七十年代的開創性工作萊茨落射熒光顯微鏡恰逢一個世界性的增加免疫和其他分子生物學方法,像魚在醫學診斷和研究中的應用。hijmans等。首次證明萊茨新的多波長激發落射照明的實用性,對於某些類別的免疫球蛋白細胞的選擇性檢測,使用綠色熒光FITC和紅色熒光TRITC抗體共軛。他們應用的兩個波長的激發方法,使用藍色和綠色的光的選擇由一個發射濾光器在520nm處(圖7)的FITC熒光峰值。brandtzaeg Klein等。有類似的發現,識別免疫重要的細胞類型,使用雙波長激發萊茨epiilluminator的。在染色血玫瑰花結的形成,使用UV和綠色的光的兩個波長的激發方法,可以顯示紅細胞周圍的單核細胞(圖8)。

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圖 7:骨髓細胞的抗-κBTRITC共軛的抗-IgG FITC共軛染色。的EPI-illmination窄帶綠色和藍色光,導致TRITC和綠色熒光的細胞含有FITC標記的細胞中含有的紅色熒光。一些細胞中含有FITCTRITC

 

Bildschirmfoto

圖 8:人體血液細胞,花環的形成。藍色熒光染色芪使用外延照明用紫外光紅細胞染色。淋巴細胞激發後的綠色光(1965)與橙紅色的染色曙紅染色。

EPI照明

 

Bildschirmfoto在落射照明,二向色分束器,用於對試樣的入射光偏轉。已經設計了這樣一種方式,隻有所需的激發波長的向下偏轉,通過物鏡到標本,而不需要的波長的傳輸由分色鏡,在光收集器收集後麵的分色鏡的光譜特性二向色鏡。消除這種不必要的激發光結果在顯著減少雜散光,從而提高圖像對比度。二色鏡偏轉所需位置(短波長)的激發光通過物鏡到樣品上,但較長的熒光波長是透明的。抑製濾波器(屏障過濾器)吸收(或反射)從試樣和物鏡的透鏡表麵反射的激發光,但是高度透明的熒光,從而可以達到目鏡。落射照明的效率是與一個物鏡的數值孔徑(NA)的四次方,在落射照明第一服務作為聚光鏡,然後作為一個聚光透鏡觀察。在營銷的時候第一個多波長外延照明高功率的物鏡(X70X100)提供高NA0.951.30)。繼Ploem建議萊茨,是世界上第一家生產中等功率的物鏡,如油浸X40物鏡NA1.30(圖9)。這種新型的設計物鏡,尤其是落射熒光顯微鏡,導致常規熒光顯微允許短的曝光時間在非常明亮的圖像。

 

右:圖。9:徠茲(徠卡)早期(1967年)的原型(“Versuchs”)油浸物鏡X40NA 1.30熒光落射照明技術開發的中試實驗。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

最優填充的入射光瞳(光圈)的物鏡

落射熒光顯微術中的一個問題一直是最佳的光源的圖像中的物鏡的入射光瞳填充。約8倍的光源是典型的中等倍率。這是相關的不同的各種高壓汞和氙氣燈的電弧大小。此外,高考學生的物鏡有很大的不同,例如,3.6毫米的X100NA 0.90物鏡和12毫米的10倍,NA 0.30物鏡。此外,如果隻有一部分的圓弧可以進入的入射光瞳,得到的熒光強度將會減弱。最近Schönenborn報道在一個完全創新的事件在Leica DM RHCS)顯微鏡的光路。落射照明的路徑現在已經被設計為允許個人適應用於不同的應用的具體光源的照明光的路徑。假設科勒照明入射光路徑,就是將圖像的照明光學係統的組合和集電極中的光源的入射光瞳的物鏡。對於一個給定的物鏡,光源的放大率的選擇直接取決於其幾何尺寸。鹵素燈應該很清楚地調整,由於線圈燈絲燈絲失調引起的極端敏感性。然後建議相對較低的放大倍率。

在一些應用中,可以在熒光強度增加了1.8倍,並在紫外線範圍內的工業應用中,即使由係數為3.5,在DM RHCS)顯微鏡。在紫外範圍內的增加已經得到了一個新的色校正6透鏡的特殊的高傳輸玻璃類型的集電極。在Leica DM RHCS)的顯微鏡係統的兩個模塊,現已:與HC F模塊的照明光學係統的倍率為11.5,和為HC射頻模塊倍率為4.8。此外,在Lei​​ca DM RHCS)落射照明支架HC F模塊,產生非常高的熒光強度和良好的均勻性為25毫米的視圖中的一個領域,有一個額外的照明透鏡的組合。用戶誰需要特別良好的均勻性,甚至有可能脫離的HC F模塊的照明透鏡,隻是稍微降低的熒光強度。物鏡瞳孔中的光源的圖像規模為從11.5減少到約9.5的值,從而增加了約20%的有用的視場中。為了進一步提高均勻性,光擴散磁盤可以插入模塊。有趣的是,已經觀察到最舒適的觀看熒光圖像的印象時,得到的圖像強度不完全是恒定的,而是稍微下降到圖像的邊緣。這種效果是由於眼睛的生理(所謂的橫向相位差)。相反,視頻圖像分析技術要求非常恒定的照度。這可以通過在HC RF模塊的光擴散盤切換到視頻模式,從而導致更多的同質性在中央領域約16毫米(對應於所覆蓋的區域由一個1/2“攝像機與電視的適配器x0 .5)。

徠卡也進一步改善的物鏡為熒光顯微鏡。光學眼鏡具有低自發熒光性能的選擇,在增強圖像的對比度。

熒光顯微鏡中的一個問題是可以得到比較厚的標本,沒有銳利的圖像。前焦距和後焦點的平麵的不必要的貢獻,這是由於 使用具有高數值孔徑的物鏡 到最後的顯微鏡圖像。這將導致在更短的良好定義的圖像。徠卡光譜共焦顯微鏡然而獲得清晰的圖像在高分辨率幾個焦平麵內的樣品在高橫向和縱向分辨率。

標本中分離的多個熒光染料的顏色得到了進一步的提高頻譜分析。計算機輔助光譜共焦掃描顯微鏡也因此成為熒光顯微鏡在生物醫學和材料研究的終極工具。

 

為各種應用在分子生物學篩選立方體

在過去十年中的分子生物學應用的爆炸已經導致許多過濾器的各種應用組合的發展。現在,這些套過濾器安裝在一個大的變化濾光塊(塊)。熒光外延照明使2-8濾光塊手工操作或機動交換交換,例如熒光雜交研究所需。本文的目的不是眾多的應用程序啟用各種過濾立方體給予了全麵而詳細的討論。而不是隻具有過濾器的多維數據集和關鍵字給出的示意性概述,表示可能的應用(表1)。

 

1:實施例的熒光顯微鏡的應用

當他們在這裏列出被引用的論文中提到的光學部件和熒光染料。在此表中的用語和術語限製在文中所引用的論文中使用的術語。過濾器名稱術語在德國上市斜體。作者可能被稱為帶外幹擾濾波器(BP)的半值寬度為要麽如00/00納米,表示的中心波長和半功率帶寬(例如,BP 525/20)或短期和長期的波半功率點(如BP 450-490)。確定短期和長期通濾波器由字母SPLP和邊緣納米波長(如SPLP 520 490> 520納米)。如果該參考文獻的作者的光學部件製造商,讀者可以參考所引用的文獻。

顯微鏡, 物鏡, 高分子
參考文獻

氟-

光源

激發濾光片

二色分光鏡激發塊

發射濾波器

激光掃描顯微鏡 (LSC) x20
表麵標誌

DNA 染色法

Körnemann et al.: Cytometry 41: 172–177 (2000)

FITC
PI

Argon laser
blue 488 nm*

 

530 + 30 nm&
BP green
625 + 28 nm&
BP red

Inverted fluorescence microscope x40
Fluorescence lifetime imaging
Murata et al.: Cytometry 41: 178–185 (2000)

Ho
7-AAD

DCM laser
UV 335 nm*

FT 395%
(DM, DBS)

450 + 33 nm&
BP violet

Digital fluorescence microscopy x100/0.60–1.32, SP (KP) 630 in front of CCD camera to block far red and infrared light
PNA FISH
de Pauw et al.: Cytometry 32: 163–167 (1998)

CY3
DAPI

green 515–560&
UV 340–380& nm BP

 

LP 580 red#
LP 430 blue#

Confocal fluorescence microscopy x60/1.4
Photobleaching studies
van Oostveldt et al.: Cytometry 32: 137–146 (1998)

FITC

Ar+-ion line
blue 488 nm*
BHS&

 

LP OG 530#
yellow

Digital fluorescence microscopy x63/1.4
Excitation filter wheel
Chromosome studies
Poon et al.: Cytometry 36: 267–278 (1999)

DAPI
Cy3

Hybrid/xenon mercury lamp
405* nm violet
546* nm green
DAPI/Cy3 filter set

 

 

Fluorescence microscopy
Intratumor heterogeneity of chromosomes
da Vinci et al.: Cytometry 37: 369–375 (1999)

TRITC
FITC
DAPI

Triple-bandpass filter* (MBP)

FM%

(Emission)

Fluorescence microscope x100/1.35
Daunorubicin sequestration
Bour-Dill et al.: Cytometry 39: 16–25 (2000)

LB
Daunorubicin
NBD
DiOC

Mercury 100 W
BP 330–385&
BP 460–449&
BP 460–490&


DM 410%
DM 570%
DM 510%

(Emission)
BP 430–460$
LP 590#
BP 510–550$

Fluorescence microscope
Automated comet assay
Böcker et al.: Cytometry 35: 134–144 (1999)



PI

Mercury 100 W
SP 580^



E2@

(Emission)
LP 590#

Motorized epi-illuminator x100/1.3
Chromosome studies with multicolor
FISH
Kuzobek et al.: Cytometry 36: 279–293 (1999)


DAPI
FITC
Texas-red

Mercury 100 W
UV
blue
green

Four filter cubes@(FC)

(Emission)
BP 425@ blue
BP 525@ green
BP 615@ red

Inverted fluorescence microscope, CCD
Three-color imaging of chromosomes
Coco-Martin et al.: Cytometry 32: 327–336 (1998)

DAPI

FITC
TRITC

UV
BP 365/12&
BP 450–490&
BP 546/12&

 

Emission
>379# nm
>520# nm
>593# nm

Digital fluorescence microscope and (CCD) x40/0.75
Image analysis of granulocytes
Szecs et al.: Cytometry 33: 19–31 (1998)



R 123
EB

Multi-band pass filter (MBP)
490~ nm blue
570~ nm green

Triple-band (polychroic) beamsplitter (PBS)%~

Triple-band emission filter
520~ nm
580~ nm

Fluorescence microscope with motorized epi-illuminator, delayed luminescence imaging and CCD, x63/1.32
FISH Karyotyping
Tanke et al.: Cytometry 33: 453–459 (1998)

cascade bl
F
LR
Cy5
Cy7
Platinum coproporphyrin

Mercury 100 W





BP& 500–560 nm

A@
HQ-FITC@
HQ-TRITC@
HQ-Cy5@
HQ-Cy7@
DBS 580@ nm







BP$ 600–700 nm

Fluorescence microscope with motorized filter changer and CCD camera
Two colour ratio method in FISH
Morrison and Legator: Cytometry 27: 314–326 (1997)

DNA probes:
1 green
2 orange
(1) WCP
(2) CEP

 
  
 

BP& 510/20 nm
BP& 572/18 nm

Triple-band (polychroic) beamsplitter (PBS)%~

Triple band-pass emission filter:
MBP~ 535 nm
MBP~ 606 nm

Fluorescence microscope with CCD camera
Comparative genomic hybridization
Bornfleth et al.: Cytometry 24: 1–13 (1996)


DAPI
FITC
Texas red

Mercury 50 W
Triple band-pass excitation filter

 

Triple band-pass emission filter

Fluorescence microscope and CCD camera, x20/0.75
Segmentation of nuclear images
Price et al.: Cytometry 25: 303–316 (1996)


DAPI

Mercury 100 W
BP& 365/10


DM% 400 nm


none

Microscope with CCD camera x30/0.5
Multiparameter fluorescence imaging of lymphocytes using labelled monoclonal antibodies
Galbraith et al: New Technologies in Cytometry, in: Proc. of the SPIE 1063 (1989)


FITC
PE
Cy5
Cy3

Manual, six position slider for fluorescence filters

 

 

Special optical system for epi-illumination microscopy with wavelength switching using a polychroic beam-splitter
Heiden and Tribukait: Cytometry 20: 95–101 (1995)


DAPI
TRITC

Mercury 100 W
BP& 365/33 nm
BP& 546/23 nm

Polychroic PBS%
365 reflection
546 reflection


BP$ 435–500 nm
BP$ 500–750 nm

*排放或激光線。
^短傳SPKP)激發濾光片窄帶通(BP)激發濾光片。多帶通濾波器(MBP)。 %分色分束器(DBS)或分色鏡(DM)%〜 PolychroicspitterPBS)中。#屏障過濾器(LP)。發射帶通(BP)的幹涉濾光器,和發射多個帶通濾波器(MBP)。@篩選立方體,塊(FC)。

反射顯微鏡(RCM

徠卡落射照明顯微鏡的發展已經導致了進一步的發展:反射顯微鏡。反射顯微鏡標本染色與常規的吸收免疫學指標如過氧化物酶-DAB,免疫金銀和免疫磷酸酶(圖10和圖11)提供了強有力的信號。由於強烈的信號
,可以得到-圖像對比度高的圖像並沒有惡化前和交的焦點圖像-薄切片,RCM滿足所有的理論光的最佳光顯微鏡的分辨率標準。可以被定義為高清晰度的圖像的光的結果。

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圖 10:反射顯微鏡(RCM)。小鼠腹腔巨噬細胞秉承蓋玻片和表麵抗原的單克隆抗體染色。免疫組化染色。絲狀偽足的薄膜的擴展,這是不明視野顯微鏡visisble,是可見的強relfectionDABox產品bccause的。

 

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圖 11:超薄切片(約35 nm)的腎組織過氧化物酶DAB染色。反射顯微鏡觀察到腎小球的線性染色模式呈現往往比用熒光顯微鏡更清晰的圖像。

 

 

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圖 12:過濾器的立方體(塊),用於反射顯微鏡,含有偏振片(50%),中性束器和分析儀。該過濾器的多維數據集(塊)可以被插入到一個熒光顯微鏡落射照明的Leica的位置。

 

大多數免疫組化染色的強反射,提供了這樣一個高對比度,這種染色可以結合很多經典的(吸收)為重要的大分子,顯示出適度的強反射的組織化學染色。後者的汙漬常常可以直接使用,提供良好的形態取向和在許多情況下,比單獨使用熒光標記物來實現更精確的位置的immunomarker。此外,這樣的光顯微鏡觀察,可以確認通過電子顯微鏡通過檢查下一個超薄切片(具有相同的免疫染色)與EM

在共聚焦激光掃描顯微鏡中,RCM可以進行,沒有特殊的或其他的雜散光減少光措施,由於消除雜散光被照明透過針孔。最吸引人的免疫染色得到一個非常強大的激光的反射和顯示非常有限褪色。他們往往允許一個小針孔的大小(例如10微米),這是小於約五到十倍可用於大多數熒光染料共聚焦熒光激光掃描技術顯微鏡的使用。因此,反射免疫學指標的使用可以導致在光學分辨率的一個非常顯著的增加。標本雙染既具有熒光和徠卡光譜共焦激光掃描顯微鏡提供了新的可能性多個標記可以很容易地檢查反射immunomarker

RCM使用熒光顯微鏡支架,落射照明器和高壓燈。一個額外的偏振器濾塊,包含偏振器,反射板,和分析器的熒光落射照明,必須插入(圖12)。另外一個反射對比度(RC)膜片模塊(包含中央停止係統)必須使入射光路。中央車站和/或光圈隔膜,這RC隔膜模塊適應滑動套。此外,反射顯微鏡開發的一個特殊的物鏡,配備徠卡RC M-PLAN油浸x100/1.25 RCM物鏡的λ/ 4波片在鏡頭前,應加一套物鏡(熒光顯微鏡)上炮塔物鏡的左輪手槍。

 

在反射光顯微鏡,對比是基於不同的反射強度(反射率)。在這種類型的顯微鏡,它應該提醒的是,在每一個光學邊界發生光的反射,即當的折射率和/或吸收指數的變化。對於生物標本示出反射率小於1%,並主要是小於0.2%,這幾乎是不可能取得的反射光圖像,用常規的顯微鏡,由於顯微鏡管內的不必要的反射。在反射顯微鏡,使用兩種方法的組合,以減少眩光,由於散射光。入射光被製作成一個由一個中心站(與中央站提供,創建環形光闌的孔徑光闌)的入射光路徑與後焦距(光圈)的平麵共軛的平麵插入的光錐ringshaped的物鏡。作為第二方法,不想要的散射反射光減少所使用的抗折的的方法。通過使用正交偏光顯微鏡內部的反射的光被抑製,其結果,從檢體被傳遞到眼睛反射的光。該物鏡設置有一個物鏡的四分之一波片,在前麵的物鏡鏡頭。通過的光通過λ/ 4板(向下的試樣從試樣反射後向上)改變光的偏振方向,用2×45°= 90°



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