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徠卡顯微鏡:打開光門改進熒光共聚焦和STED超分辨率

2013-10-16  發布者:admin 

真正的共聚焦顯微鏡照明係統提供單點,單點檢 ​​測該方法被稱為“光學切片”,因為生成的圖像隻包含信息的焦平麵。串行檢測提供高效,低噪音的傳感器信號轉換。雖然非平行檢測不利於高速成像,現代掃描的概念允許的幀速率每秒400幀在合理的噪聲水平之上。這是遠遠不夠的大多數應用,包括物質生活的快速離子輸送現象的監測。

 

光電子倍增管(PMT)

到今天為止,最常用的傳感器,激光共聚焦顯微鏡的光電子倍增管(PMT),提供低噪音電子信號,在大範圍的照明強度。光電倍增管的主要缺點是相對較低的量子效率〜30% - 在最好的情況下,經典的光陰和為砷化镓分層光陰不超過45%。由於後者引入非常高的不穩定性,使這些設備容易受到損壞,有嚴重的缺點,因為這些設備的成本高。

如果光子被吸收通過光電陰極,如果光子的能量足夠的遊離的電子從陰極材料,該電子加速電勢向正電極。在光電倍增管中,在正電極的順序排列的一係列的倍增電極。在每個步驟中的典型的電勢差是100伏。最後在陽極收集的電信號。加速電子入射時,倍增極發行的電子數,即,乘以吸收電子。的乘法因子依賴於倍增極之間的電位差。(陰極與陽極)的總電壓是可調的最多約。1000伏。倍增電極的數目通常是6 ... 12,電壓倍增電極的數目除以。

在陽極收集和集成的模擬信號的另一種測量模式是光子計數。這裏,由一個比較器電路的信號進行分析。較單一的二次電子引起的單個光子的峰值識別和計數。,雖然光電倍增管的第一個裝置,讓光子計數,他們缺乏高頻特性,這意味著它們隻適用於光子計數非常低光水平(單位時間內的光子很少)。

 

Figure-1 
1:左:的PMT的示意圖。與光子的相互作用時,被釋放的光電子從陰極和中等電壓的第1倍增電極加速。這裏有幾個次級電子被釋放並加速到下一個倍增電極。最後,該信號被收集在陽極上。右:示意圖的路政署
TM與光子的相互作用時,被釋放的光電子從陰極和高電壓的半導體靶加速。這裏的動能被耗散在一次,此外,電荷被放大的倍增層(雪崩效應)。最後,該信號被從陽極收集。
 

混合探測器(路政署™)

 傳感器技術的最新發展提出的嵌合體真空技術(如光電倍增管)和矽技術(如雪崩光電二極管,雪崩光電二極管)。這些雜交在激光共聚焦顯微鏡徠卡顯微係統,將它們命名為“路政署”(pron.:highdees)。路政署傳感器配有一個砷化镓光電陰極,但隻使用一個加速度的步驟,而不是一個序列的倍增電極。所施加的電壓是約。8000伏。這種設計減少了傳感器的脆弱性和損壞的風險減少一些數量級 - 雖然量子效率高達45%。

被加速的電子的動能完全被消耗矽靶上,並立即給出了一個約。1500倍放大。與經典的倍增電極,最好允許的3〜5倍的擴增(和需要被測序出於這個原因),這是不可能的。乘法層,它轉換成一個雪崩二極管,矽組件終於無需外部(噪聲)放大電路放大信號,可測量的強度。

LightGate

其中的諸多優點的的路政署傳感器是高截止頻率,這使得路政署在光子計數模式操作,即使在相對較高的強度水平 - 無論如何是典型的在生物醫學研究和常規的標準熒光燈樣品的強度。這一事實打開門控模塊,用於將檢測信號。

為了獲得從門檢測,照明光源有脈衝。這是一個固有功能的白光激光共聚焦顯微鏡係統推出徠卡顯微係統於2007年由(WLL) 此源設有八個獨立排放bandlets的,這兩種顏色(目前為470 ... 670納米)和強度都獨立可調。源脈衝頻率為80 MHz -這是一個良好的開端激發可調FLIM測量以及。

  • Figure-2a
  • Figure-2b

 2:影響抑製反射光門。左邊的圖像顯示一個配置文件(XZ)熒光標記的細胞部分。收集的光在發射帶和激發帶。滑動麵的反射和蓋玻片是顯而易見(強大的水平線)。右圖:不改變發射帶,光閘完全抑製這些反射。

 

選通所述檢測信號允許信號采集期間,僅在激勵脈衝之間的熒光發射時間。不包括脈衝,由激發光產生的背景被有效地抑製,並且獨立於任何分束或阻擋過濾。這LightGate是一種新的建築塊在“白焦”的概念,指的是完全可調,無濾波器的頻譜光學切片設備。

Figure-3_09


 3:門控策略。左:激勵脈衝後,唯一的排放物LightGate收集光子。這有效地抑製了獨立的波長的反射光。右:封閉式STED隻收集下旬發射光子的熒光壽命長的照明模式,並暗示進一步提高分辨率的中心事件,以確保限製。

 
Figure-4
 4:甜甜圈型的的STED強度導致排放終身依賴。的中心(STED強度為零)表示最大生存期,從而降低與離中心的距離。最終的壽命不再相關,作為激發是零,由於衍射極限的激勵模式。

封閉式超分辨率STED

第二個領域HyDs實益門控模式實現STED超高分辨率成像。受激發射損耗的基礎上受衍射限製的斑點與熒光團的激發波長,同時照明的環狀區域的波長,導致去勵磁(受激輻射)的照明。這樣的安排,使得隻有一個子衍射區域處於興奮狀態,因此允許更高的分辨率比衍射極限的探測。

在本質上,兩個光質競爭的激發和去激發。如果有沒有激勵光,在激發圓的疊加和受激發射損耗環的中心,熒光基團發出熒光特征熒光壽命τ後,單純依賴的熒光量子特性的影響和環境的影響。中心外的第二條路徑的激發態返回:受激發射。因此,特性的壽命縮短。縮短取決於受激發射損耗的強度,因此增加,直到達到最大強度,但是這是已經在激發區域的邊緣)的距離從中心(。

其結果,特性的熒光壽命是半徑依賴性中的受激發射損耗集中在中心的最長的壽命。通過刪除早期的光子,這最有可能從外部中心發射,觀察麵積進一步減小-這是與更高的分辨率相同

 
Figure-5

 5:門控STED(從左至右)的影響。76 nm的間隔熒光DNA折紙不能分開用標準的共聚焦成像。在CW STED,分辨率足以分開76納米。當收集的排放量隻有0.5納米激勵脈衝後的分離進一步提高(提高分辨率)。後來的集合,這裏從3.0納米,單產額外的分辨率提高。

 
STED_CW_Conf_Comparison2
 6:雙色共聚焦和雙彩色STED形象:綠色,組蛋白3紅,微管。雙方可視做Chromeo 505和BD地平線的V500,分別在HeLa細胞。

 



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