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新聞資訊

徠卡顯微鏡:膜片鉗技術

2013-10-16  發布者:admin 

特別是在神經科學,生理的離子通道一直感興趣的主要話題。膜片鉗技術的發展,20世紀70年代中後期,電生理學家新的前景。它允許高精度電流錄音不僅整個細胞,同時也切除蜂窩補丁。即使單通道開幕活動進行調查。然而,由於其複雜的技術,物理和生物的背景中,需要高靈敏度的設備和實驗者所需量龐大的技能,電仍然是在實驗室的日常工作​​中最具挑戰性的方法之一。

 

 

 

Fig_2_Neuron_with_a_patch_pipette

 

 2:使用相位對比圖像的補丁吸管連接到一個培養的小鼠海馬神經元的細胞膜。德國波鴻魯爾大學,阿瓜多Ainhara博士的禮貌

 

 

 

配置

根據不同的研究興趣,不同的配置都可以使用。細胞貼附模式膜修補程序保持不變(圖3)。的修改的細胞連接模式是鬆散的膜片在這種情況下,移液管沒有緊密地密封的膜,但僅鬆散地連接到它。此模式通常用於記錄神經細胞的動作電位的。它的優點是不影響組合物的細胞質。然而,另一方麵,不能被控製的細 ​​胞內環境。

成孔劑(通常是抗生素)應用通過補丁吸管的查詢結果中的穿孔膜片保證離子的連續性,但是,保證電極內液,細胞內的蛋白質,不洗滌。最常用的膜片鉗模式是全細胞模式(圖3)。要實現這一模式,膜修補程序被打亂通過短暫申請吸力強勁。的移液管的內部,成為連續的細胞質中。這個方法是用來記錄從整個細胞的電勢和電流。全細胞測量的研究人員可以選擇兩種配置之間的電壓鉗位電壓保持恒定和電流記錄模式,在該模式下,或其中電流被保持恒定的電流鉗模式和中膜電位的變化可以得到遵守。

此外,它也可以隻從一個小的補丁,而不是整個細胞記錄電流。這就提出了一個記錄單一渠道的機會。補丁可定向補丁吸管內的兩個不同的方向。為了實現內到外的配置的補丁吸管連接到細胞膜和,然後縮回折斷一小片膜(圖3)。在這種情況下,胞漿膜表麵的露出。這通常被用來進行調查的暴露於細胞內表麵的介質的優點是,可以進行修改,單個信道的活動。

如果物鏡是研究線索,如神經遞質的影響外,配置(圖3)應選擇。在這種情況下的移液管在全細胞配置縮回,導致膜的斷裂和重排。在此配置中,細胞外表麵暴露,從而可以很容易地應用於細胞外線索。

 

 
Figure-3b
 3:四個膜片鉗記錄方法:細胞貼附:當吸液管是在最接近細胞膜,溫和的吸力被施加到獲得移液管和膜之間的緊密的密封。全細胞:通過應用另一個簡短,但吸力強勁,細胞膜破裂和吸管進入到細胞質。內到外的:在細胞貼附模式,移液管收縮和修補程序是分開的膜的其餘部分,並暴露在空氣中的。的細胞質的膜表麵被暴露。外:在全細胞模式,導致兩小塊膜重新連接並形成一個小泡狀結構與細胞質麵朝內液吸管縮回。
 
 
 
 

要求

膜片鉗實驗可以進行培養細胞,急性分離細胞或急性vibratome的片,它允許在自然環境中細胞的電生理特性的調查。感興趣的離子通道也可以在一個共同的細胞係(如HEK293,CHO,LNCaP細胞)進行分離和異質性表達。

根據樣品的,無論是一個倒置的(培養細胞)或需要一個直立的固定載物台的顯微鏡(片)與一個穩定的平台。如果急性切片的細胞​​進行了研究,紅外DIC建議可視化膜。應放置在顯微鏡上防振表可能是致命的,因為任何移動的移液管和膜之間的密封。

顯微需要精確移液管。形成很細的移液管,通過加熱和拉小的玻璃或石英毛細管。吸液管尖端的直徑為1微米左右,封閉膜修補程序,其中包含隻有少數或者甚至隻是一個離子通道。移液管的尖端熱拋光獲得的高電阻膜的密封件壓在微段。充滿了一個解決方案,或者類似的細胞外溶液或細胞質中,根據在記錄模式下的移液管。吸移管被安裝在顯微向細胞膜,以允許精確的動作。

使用氯化銀線的電流的電導。將染液的電極,這也是一種氯化銀焊絲,設定的電流值為零。一個低噪聲晶體管差分放大器連接到計算機進行數據采集和數字化。可以購買特定的軟件來控製的放大器和分析數據。一個示波器也可以用於監視的電流。如果需要,可以添加灌注係統的設置。物質可以被應用通過灌注鉛筆或通過使用一個POC(灌注開式和閉式)室。

應用

膜片鉗實驗中被用來接近生理問題,種類繁多的,不僅在神經科學。在過去的二十年期間,膜片鉗記錄也變得越來越重要,在非興奮細胞離子通道的調查。這也是一個很重要的方法在醫學研究中,因為許多疾病都與確定的離子通道的故障。藥理研究,自動化膜片鉗是用來篩選烈性物質的離子通道修改。

膜片鉗記錄,也可以結合如Ca 2 +成像與活細胞成像方法在這種情況下的Ca 2 +敏感的熒光染料被施加到通過補丁吸管細胞。同時記錄膜電流的熒光變化。pH值或Cl -敏感的染料,可以進行類似的實驗

曆史背景

路易吉·伽伐尼的開拓性工作的18 世紀和工作的埃米爾·杜Bois-REYMOND的,約翰內斯·彼得·米勒和赫爾曼·馮·亥姆霍茲的19 世紀開始,細胞膜和細胞興奮始終重大利益進行研究,對神經的係統。艾倫·勞埃德·霍奇金淋巴瘤和安德魯·赫胥黎於1952年揭示了離子通道的動作電位的事件,使用的電壓鉗技術,並於1963年被授予諾貝爾生理學和醫學獎的傑出工作。 

在這個時候,隻能施加的電壓鉗位到相當大的細胞,作為尖銳的微電極,需要穿透細胞膜。在20世紀70年代後期,伯特索克曼和埃爾溫·內爾精致的電壓鉗技術,並第一次跨越的青蛙骨骼肌膜補丁解決了單個通道電流。他們還榮獲了諾貝爾生理學和醫學獎(1991年)。下一個突破是發明於1980年由恩斯特索克曼千兆密封,極大地提高了信號噪聲比,並允許更小的電流記錄。

電,率先在特殊的生物物理實驗室,現在已經擴大到基本的生物學和醫學研究,並成為在神經係統中的單個細胞或整個蜂窩網絡的行為進行調查的最重要的工具之一。

基本原理

膜片鉗技術允許一小甚至單離子通道的調查。因此,它是特殊的興奮細胞,如神經細胞,心肌細胞和肌肉纖維的研究興趣。

單離子通道進行每秒約10億離子。然而,電流隻有幾皮安。記錄在這個量級的電流是相當具有挑戰性,不僅為研究員​​,同時也為設備。原則上,薄板玻璃或石英一鈍頭的移液管被密封到膜(圖2,3)。

吸入被施加到輔助密封在千兆歐姆範圍內的高電阻的發展。這種緊密的密封電隔離膜補丁,表示所有助熔劑膜補丁的移液管流入的離子,並記錄由氯化銀電極連接到一個高度敏感的電子放大器。浴電極是用來設置為零電平。

為了防止在膜電位的改變,類似於通過膜流動的電流所產生的機製(圖1)作為一個負反饋放大器的補償電流。

細胞的膜電位的測量和相比,命令潛力。如果有命令潛力和測量之間的差異,將被注入的電流。這種補償電流將被記錄,並允許膜電導的結論。膜電位可以被操縱獨立的離子電流,這使得膜通道的電流 - 電壓關係的調查。

基本原理膜片鉗記錄

 1:基本原理膜片鉗記錄。含有電解液的玻璃移液管緊密地密封到細胞膜上,從而電隔離膜補丁。熔劑通過通道中的電流,因此,在此修補程序的移液管的流入,可記錄的電極,其連接到差分放大器的一個高度敏感的。在電壓鉗位配置中,電流被注入到細胞中,通過負反饋回路補償膜電位的變化。錄製該電流使膜電導的結論。


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