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尼康顯微鏡熒光蛋白簡介

2013-10-16  發布者:admin 

最終在20世紀60年代初發現了綠色熒光蛋白在細胞生物學預示著一個新的時代,使調查人員運用分子克隆方法,融合多種蛋白質和酶的目標熒光團部分,以在生物係統中監控細胞過程用光學顯微鏡和相關的方法。 當加上廣角熒光和共聚焦顯微鏡最近的技術進步,包括超快的低光數碼相機和激光控製係統multitracking,綠色熒光蛋白,它的顏色轉移的遺傳衍生工具已在成千上萬的活細胞成像實驗展示了寶貴的服務。

 

活細胞熒光蛋白標記

下村修和弗蘭克·約翰遜,在星期五港實驗室在華盛頓大學工作,1961年首次分離出一種鈣依賴性的,他們命名水母Aequorea victoria的水母生物發光蛋白。 在分離過程中,第二缺乏的藍色發光生物發光水母,但用紫外光照射時能產生綠色熒光蛋白觀察。 由於這個屬性,該蛋白最終粗魯的名字命名的綠色熒光蛋白(GFP)。 在接下來的二十年裏,研究人員確定了水母綠色熒光蛋白一起工作的水母的發光器官鈣誘導發光信號轉換成綠色熒光特性的品種。

雖然在1992年第一隻克隆綠色熒光蛋白基因,分子探針的重大潛力沒有實現,直到若幹年後,當融合的產品被用於跟蹤細菌和線蟲的基因表達。 由於這些早期的研究中,經過精心設計,產生大量各種顏色的突變體,融合蛋白,生物傳感器,被廣泛稱為熒光蛋白綠色熒光蛋白。 最近,來自其他物種的熒光蛋白已被識別和分離,從而進一步擴大的調色板。 隨著熒光蛋白技術的迅速發展,該實用程序的廣泛的應用超越了簡單的跟蹤標記生物分子在活細胞中的這種基因編碼的熒光現在變得完全理解。

圖1中所示的兩個例子,在活細胞的融合產物,亞細胞(細胞器)的位置針對多個熒光蛋白標記。 負鼠腎皮質近曲小管上皮細胞(OK線),在圖1(a)轉染熒光蛋白變種雞尾酒融合肽信號介導運輸的核(增強型青色熒光蛋白ECFP),線粒體(DsRed熒光蛋白; DsRed2FP),或微管網(增強型綠色熒光蛋白, 綠色熒光蛋白 )。 人宮頸腺癌上皮細胞(HeLa細胞線)組成的類似的試樣是描繪在圖1(b)。 青色(mTurquoise)和黃色熒光蛋白編碼序列(高爾基複合體和細胞核,分別),以及“水果”蛋白質,mCherry(mVenus)融合的亞細胞定位載體共轉染HeLa細胞,目標線粒體網絡。

藍色,青色和黃色熒光蛋白,綠色熒光蛋白,其突變的等位基因形式,用於構造可以表示活細胞,組織,整個生物體,與工程的載體轉染後的熒光嵌合蛋白質。 其他種類,包括珊瑚生物,已分離出紅色熒光蛋白,同樣是有用的。 熒光蛋白技術避免了淨化裝置的問題的,標記,並引入到表麵或內部抗原產生特異性抗體的細胞或任務的被標記的蛋白質。

維多利亞水母的綠色熒光蛋白的性質和修改

綠色熒光蛋白欣賞其中最重要的方麵是,在整個27千道爾頓的天然肽結構是必不可少的開發和維護其熒光。 值得注意的是,原則上熒光基團是來自相鄰的三個一組的氨基酸:絲氨酸,酪氨酸,甘氨酸殘基,在位置65,66,和67(以下簡稱為Ser65,Tyr66,Gly67,參見圖2)。 雖然這種簡單的氨基酸基序在整個自然界中發現的常見,它一般不導致熒光。 這是獨特的熒光蛋白的這種肽的三重峰的位置位於中心的是一個穩定的桶11β-折疊片折疊成管狀結構組成的。

的綠色熒光蛋白在中心內的疏水環境中,會發生反應在Ser65和Gly67的氨基氮原子的羰基上的碳原子之間形成咪唑啉-5 - 酮的含氮雜環的環體係的結果(如在圖2中示出)。 在咪唑啉環的共軛與Tyr66和成熟的熒光物種的進一步氧化結果。 重要的是要注意的是本機的綠色熒光蛋白的熒光基團存在於兩種狀態。 質子化的形式,主要的狀態,在395納米,最大激發和一個普遍的,非質子化的形式,吸收約4​​75納米。 然而,無論在激發波長,熒光發射波長在507納米的最大峰值,雖然峰值是廣泛的,並沒有很好地定義。

綠色熒光蛋白的熒光變化

兩個主要功能的熒光蛋白的熒光作為探針,其效用具有重要的意義。 首先,作為熒光綠色熒光蛋白的光物理性質是相當複雜的,因此,這種分子可容納相當數量的修改。 許多研究都集中在微調固有綠色熒光蛋白的熒光分子探針提供了廣闊的範圍,但更重要的潛力和廣闊的用人為原料構建先進熒光蛋白質不能被低估。 綠色熒光蛋白的第二個重要特征是,熒光是高度依賴於周圍的三肽的熒光基團的分子結構。

破壞熒光綠色熒光蛋白變性,可以預料,周圍的三肽熒光殘留的突變可以顯著地改變熒光性質。 的氨基酸殘基 β桶內部的填充物是極其穩定的,這會導致一個非常高的熒光量子產率(高達80%)。 這種緊密的蛋白質結構也賦予抗熒光的變化,由於pH值,溫度,和變性劑如尿素波動。 高度穩定的綠色熒光蛋白的突變,一般以一種消極的方式改變擾動,從而導致熒光量子產率和更大的環境敏感性減少。 盡管有幾個額外的突變,可以克服這些缺陷,衍生熒光蛋白通常是更敏感的環境比原生的物種。 遺傳變異與設計實驗時,這些限製應該認真考慮。

為了適應在哺乳動物係統中使用的熒光蛋白,進行了野生型綠色熒光蛋白的一些基本的修改,現在發現在所有常用的變種。 第一個步驟是一個37度環境優化成熟的熒光。 成熟的野生型熒光團在28度是相當有效的,但將溫度提高到37度,大大降低了整體的成熟和熒光下降的結果。 亮氨酸導致改進的熒光的成熟,在37度,這是在28度觀察至少相當於64位的苯丙氨酸殘基(Phe64)突變。 這種突變是本來自Aequorea victoria的熒光蛋白在最流行 ​​的品種,但並不是唯一的突變,提高其他變體已經被發現在37度折疊。

除了改善在37度的成熟,也改善了優化的密碼子使用的哺乳動物表達綠色熒光蛋白在哺乳動物細胞中表達的整體亮度。 超過190個沉默突變,已被導入的編碼序列在人體組織中表達增強。甲Kozak的翻譯起始位點(含有的堿基序列A / GCCAT)也被引入第二個氨基酸為纈氨酸插入。 這些,以及與各種其他改進(下麵討論),導致在哺乳動物細胞的活細胞成像的一個非常有用的探針,共同所有目前使用的是來自於原來的水母蛋白的熒光探針。

熒光蛋白調色板

範圍廣泛的熒光蛋白基因的遺傳變異已開發出功能熒光光譜幾乎跨越了整個可見光光譜(見表1)。 Aequorea victoria的水母綠色熒光蛋白的誘變努力導致在新的熒光探針,該範圍的顏色由藍色變為黃色,有一些體內報告分子在生物學研究中最廣泛使用的。 更長波長的熒光蛋白,散發橙色和紅色光譜區域,已開發海洋海葵芨Discosoma,和珊瑚屬於類珊瑚蟲  還有其他物種已被開采產生類似的蛋白質,有青色,綠色,黃色,橙色和深紅色熒光。 發展的研究工作是不斷提升的亮度和穩定的熒光蛋白,從而提高他們的整體實用性。

熒光蛋白特性
蛋白質 
(縮寫)
激發 
最大 
(納米)
發射 
最大 
(納米)
磨牙 
滅絕 
係數
量子 
產量
體內 
結構
相對的 
亮度 
(EGFP%)
GFP(wt) 395/475 509 21,000 0.77 單體* 48
綠色熒光蛋白
EGFP 484 507 56,000 0.60 單體* 100
Emerld 487 509 57,500 0.68 單體* 116
Superfolder GFP 485 510 83,300 0.65 單體* 160
AZAMI Green 492 505 55,000 0.74 單體 121
mWasabi 493 509 70,000 0.80 單體 167
TagGFP 482 505 58,200 0.59 單體* 110
TurboGFP 482 502 70,000 0.53 二聚體 102
AcGFP 480 505 50,000 0.55 單體* 82
ZsGreen 493 505 43,000 0.91 四聚體 117
T-Sapphire 399 511 44,000 0.60 單體* 79
藍色熒光蛋白
EBFP 383 445 29,000 0.31 單體* 27
EBFP2 383 448 32,000 0.56 單體* 53
Azurite 384 450 26,200 0.55 單體* 43
mTagBFP 399 456 52,000 0.63 單體 98
青色熒光蛋白
ECFP 439 476 32,500 0.40 單體* 39
mECFP 433 475 32,500 0.40 單體 39
Cerulean 433 475 43,000 0.62 單體* 79
mTurquoise 434 474 30,000 0.84 單體* 75
CyPet 435 477 35,000 0.51 單體* 53
AmCyan1 458 489 44,000 0.24 四聚體 31
Midori-Ishi Cyan 472 495 27,300 0.90 二聚體 73
TagCFP 458 480 37,000 0.57 單體 63
mTFP1(Teal) 462 492 64,000 0.85 單體 162
黃色熒光蛋白
EYFP 514 527 83,400 0.61 單體* 151
Topaz 514 527 94,500 0.60 單體* 169
Venus 515 528 92,200 0.57 單體* 156
mCitrine 516 529 77,000 0.76 單體 174
YPET 517 530 104,000 0.77 單體* 238
TagYFP 508 524 64,000 0.60 單體 118
PhiYFP 525 537 124,000 0.39 單體* 144
ZsYellow1 529 539 20,200 0.42 四聚體 25
mBanana 540 553 6000 0.7 單體 13
橙色熒光蛋白
Kusabira Orange 548 559 51,600 0.60 單體 92
Kusabira Orange2 551 565 63,800 0.62 單體 118
mOrange 548 562 71,000 0.69 單體 146
mOrange2 549 565 58,000 0.60 單體 104
dTomato 554 581 69,000 0.69 二聚體 142
dTomato-Tandem 554 581 138,000 0.69 單體 283
TagRFP 555 584 100,000 0.48 單體 142
TagRFP-T 555 584 81,000 0.41 單體 99
DsRed 558 583 75,000 0.79 四聚體 176
DsRed2 563 582 43,800 0.55 四聚體 72
DsRed-Express(T1) 555 584 38,000 0.51 四聚體 58
DsRed-Monomer 556 586 35,000 0.10 單體 10
mTangerine 568 585 38,000 0.30 單體 34
紅色熒光蛋白
mRuby 558 605 112,000 0.35 單體 117
MAPPLE 568 592 75,000 0.49 單體 109
mStrawberry 574 596 90,000 0.29 單體 78
AsRed2 576 592 56,200 0.05 四聚體 8
mRFP1 584 607 50,000 0.25 單體 37
JRed 584 610 44,000 0.20 二聚體 26
mCherry 587 610 72,000 0.22 單體 47
HcRed1 588 618 20,000 0.015 二聚體 1
mRaspberry 598 625 86,000 0.15 單體 38
dKeima-Tandem 440 620 28,800 0.24 單體 21
HcRed-Tandem 590 637 160,000 0.04 單體 19
mPlum 590 649 41,000 0.10 單體 12
AQ143 595 655 90,000 0.04 四聚體 11
*弱二聚體
表1

表1給出的是一個匯編顯示一些最流行和最有用的熒光蛋白變種物業。 隨著每個熒光蛋白質的通用名稱和/或首字母縮寫,峰值吸收和發射波長(納米),摩爾消光係數,量子產率,相對亮度,和在體內的結構協會被列出。 是來自於該產品的摩爾消光係數和量子產率,EGFP的值除以計算出的亮度值。 創建此房產已被科學和商業的文獻資源,目的不是要全麵,而是代表熒光蛋白的衍生物,在文獻中得到相當的重視,可能證明是有價值的研究工作。 此外,在受控條件下的吸收光譜和熒光發射光譜中列出的表和圖所示的記錄,可進行歸一比較和顯示之用。 以實際的熒光顯微鏡調查,光譜和波長極大可能會發生變化,由於對環境的影響,如pH,離子濃度,溶劑的極性,以及局部探針濃度的波動。 因此,以下列表中的消光係數和熒光量子產率可能會有所不同,在實驗條件下實際觀察到的。

綠色熒光蛋白

雖然本機產生顯著的綠色熒光蛋白的熒光和極其穩定,紫外線範圍內的最大值是在關閉激發。由於紫外線燈需要特殊的光學考慮,可能會損壞的活細胞,它通常不是非常適合於用光學顯微鏡的活細胞成像。 幸運的是,的最大激發的綠色熒光蛋白很容易轉移到488納米(青色區域)通過引入單點突變改變成65位的絲氨酸蘇氨酸殘基(S65T)。 這種突變的特點是在最流行 ​​的綠色熒光蛋白的變種,稱為增強型綠色熒光蛋白(EGFP),這是在廣泛市售BD Biosesciences公司Clontech的熒光蛋白技術的領導者,所提供的載體。 此外,增強版可以使用常用的過濾器組設計用於熒光成像,並且是其中最亮的當前可用的熒光蛋白。 這些功能提供了增強的綠色熒光蛋白的一個最流行的探針和單標簽熒光蛋白實驗的最佳選擇。 EGFP使用唯一的缺點是輕微的敏感性pH值和弱的二聚化的傾向。

除了增強型綠色熒光蛋白,其他幾個變種目前正在使用活細胞成像。 這些最好的光穩定性和亮度方麵之一可能是翡翠的變種,但缺乏商業源限製了其使用。 幾個消息來源提供了人性化的綠色熒光蛋白的變種,熒光共振能量轉移(FRET)實驗中具有明顯的優勢。 苯丙氨酸殘基在位置64亮氨酸(F64L GFP2)的換人產生一個突變,保留了400納米的激發峰,並且可以加上增強的黃色熒光蛋白作為一種有效的夥伴。 S65C突變(通常代半胱氨酸絲氨酸)的激發峰在474納米的一個變種已經出台一個更合適的商業合作夥伴FRET增強藍色熒光蛋白質比紅移增強綠色版。 最後,一個礁珊瑚的蛋白,被稱為ZsGreen1具有發光峰在505納米,已被引入作為增強型綠色熒光蛋白的替代品。 在哺乳動物細胞中表達時,ZsGreen1相對EGFP是非常光明的,但效用有限生產融合突變,類似到其他礁珊瑚的蛋白質,有一種傾向,形成四聚體。

黃色熒光蛋白

黃色熒光蛋白家族的啟動後,綠色熒光蛋白的晶體結構的發現,蘇氨酸殘基203(Thr203)附近的生色。 本酪氨酸殘基的突變引入穩定的發色基團的激發態偶極矩導致20納米移位至較長的波長的激發和發射光譜。 精煉導致增強的黃色熒光蛋白(EYFP),這是一個最亮的和最廣泛使用的熒光蛋白的發展。 增強型黃色熒光蛋白的熒光發射光譜的亮度和一個出色的候選人的多色成像實驗在熒光顯微鏡相結合,使這種探頭。 增強型青色熒光蛋白(ECFP)GFP2搭配時,增強型黃色熒光蛋白也是有用的能量轉移實驗。 然而,黃色熒光蛋白提出了一些問題,這是很敏感的酸性pH和失去其熒光的大約50%的在pH 6.5。 此外,EYFP也被證明是氯離子和光漂白敏感,更容易比綠色熒光蛋白的。

常見的熒光蛋白光譜

黃色探頭發射黃色熒光蛋白結構的持續發展已經解決了一些問題。 黃水晶的變種黃色熒光蛋白EYFP相對是非常光明的,並已被證明是更耐漂白,酸性pH值等環境影響。 另一個衍生物,命名為金星 ,是最快的成熟和開發的亮黃色的變種之一。 珊瑚蛋白ZsYellow1,最初是從一個Zoanthus種原產於印度洋和太平洋的克隆,產生真正的黃色發射多色應用的理想選擇。 衍生像ZsGreen1,這是不是有用,創建EYFP融合,有一種傾向,形成四聚體。 許多更強大的黃色熒光蛋白變體在熒光共振能量轉移研究的定量結果是重要的,潛在有用的,以及其他調查。

如圖3中所示,對於許多常用市售的熒光蛋白,跨越從青色到遠紅可見光譜的吸收光譜和發射光​​譜。 來自Aequorea victoria的水母的變體,包括增強的青色,綠色,和黃色熒光蛋白,表現出峰值發射波長範圍從425至525納米。 來自珊瑚礁,DsRed2 HcRed1(見下文)的熒光蛋白,發出波長較長,但遭受從齊聚文物在哺乳動物細胞中。

藍色和青色熒光蛋白

的藍色和青色的綠色熒光蛋白變體由於在本機的熒光基團(參見圖2)的第66位(Tyr66)的酪氨酸殘基直接修改。 該氨基酸組氨酸的查詢結果在藍色發射具有在450納米波長的極大值的轉換,而轉換為色胺的查詢結果中的一大約480納米的熒光峰隨著肩膀,大約500納米的峰值。 這兩個探頭隻有弱熒光,需要增加二次突變折疊效率和整體亮度。 即使經過修改,這一類熒光蛋白(EBFPECFP)的增強版本,隻有約25%至40%,亮如增強型綠色熒光蛋白。此外,藍色和青色熒光蛋白的激發是不常用的,所以專門的過濾器組和激光源的光譜區域中最有效的。

盡管缺點,藍色和青色熒光蛋白,多色標記的廣泛興趣和FRET推廣他們的應用程序在多個調查。 增強型青色熒光蛋白,可興奮離峰的氬離子激光(使用457納米的譜線),是顯著更耐漂白比藍衍生物,這是特別真實。 對比其他熒光蛋白,有沒有高水平的興趣,為設計更好的探針的可見光光譜中的藍色區域,發展研究的大多數在這個類熒光團一直專注於青色的變種。

FRET熒光蛋白對變種的光譜

其中改進青色熒光蛋白相繼出台,AmCyan1和增強的青色變種稱為天藍顯示最有希望。 派生礁珊瑚,Anemonia majano的 ,AmCyan1熒光蛋白變體已經與人的密碼子優化,以產生一個相對高的亮度水平和抗光漂白相比,增強型青色熒光蛋白在哺乳動物表達。 在下行路上,類似於大多數其他礁珊瑚的蛋白質,這種探頭有一種傾向,形成四聚體。 天藍熒光探針是由增強型青色熒光蛋白的位點定向誘變,以產生較高的消光係數和改進的量子產率。 西魯林是至少2倍的亮度比增強型青色熒光蛋白,並已被證明加上黃色發射熒光的蛋白質,如金星(參見圖4)時,顯著增加了信號 - 噪聲比,在FRET調查。

紅色熒光蛋白

熒光蛋白開發的主要目標已經成為一個紅色發光衍生物等於或超過先進的性能增強型綠色熒光蛋白的建設。 在一個合適的紅色熒光蛋白的優點是潛在的兼容性與現有的共焦和廣角顯微鏡(和他們的過濾器設置),以及增加容量圖像整個動物,這是明顯更加透明紅燈。 由於施工從Aequorea victoria的水母綠色熒光蛋白的黃色光譜區以外的紅移突變已被證明基本上是不成功的,調查人員已經把他們的搜索熱帶珊瑚。

Discosoma芨來自第一的珊瑚源性熒光蛋白被廣泛地利用,並通常被稱為DsRed的  一旦完全成熟,紅色熒光蛋白的功能而有一個主要的激發光譜的峰值在558納米和500納米左右的小峰,峰值在583毫微米的熒光發射光譜。 幾個問題都與使用DsRed的,但是。 成熟的紅色熒光蛋白的熒光發生緩慢和收益熒光發射是在綠色區域時,通過一個時間段。 被稱為綠色狀態 ,與其他綠色熒光蛋白,因為光譜重疊的多個標記實驗已經證明了這件神器問題。 此外,紅色熒光蛋白是一種專四聚體,可以形成較大的蛋白質聚集體的活細胞。 雖然這些功能是無關緊要的DsRed的使用作為記者的基因表達,DsRed的表位標簽的有用性受到嚴重限製。 相反水母的熒光蛋白質,已成功地用於標記蛋白質的數百個,紅色熒光蛋白共軛物已被證明不太成功,通常是有毒的。

有幾個問題與紅色熒光蛋白的熒光蛋白已被克服,通過誘變。 第二代的紅色熒光蛋白,稱為DsRed2,包含在該肽的氨基末端,防止蛋白質聚集體的形成,並降低毒性的幾個突變。 此外,熒光基團的成熟時間減少這些修改。 DsRed2蛋白形成的四聚體,但它是更兼容的綠色熒光蛋白在多個標記實驗中,由於更快的成熟。 已經實現了進一步減少成熟時間與紅色熒光蛋白的突變體,這也顯示增加的亮度電平在峰值細胞熒光的第三代。 紅色熒光表達後一個小時內,可以觀察到紅色熒光蛋白快速相比,約6個小時DsRed2和11小時紅色熒光蛋白。 稱為紅星酵母優化變型中,已經開發出來,還具有改進的成熟率,並增加亮度。紅色熒光蛋白-Express和紅星綠色狀態的存在是看不出來的,這些熒光蛋白呈現橙紅色光譜區域多重標記實驗中的最佳選擇。因為這些探頭仍然預留四聚體,他們沒有標記蛋白的最佳選擇。

橙色和紅色單體熒光蛋白的光譜

礁珊瑚生物體已分離出了幾個附加的紅色熒光蛋白,示出了相當多的承諾。適於哺乳動物應用的第一HcRed1分離從皺Heteractis,現在是商業可用。HcRed1最初源自非熒光的吸收紅光的色蛋白,通過誘變,以產生弱熒光的的預留二聚體具有最大吸收波長為588納米和618納米的最大發射。雖然這種蛋白的熒光發射光譜從紅色熒光蛋白的分離是足夠的,它往往協合的紅色熒光蛋白和少得多明亮。一個有趣的HcRed構建含有兩個分子串聯已產生克服,在原則上,優先發生於串聯配對產生標簽的單體的二聚化。然而,由於這種雙蛋白的整體亮度尚未改善,這是不是一個好的選擇為常規應用在活細胞顯微鏡。

發展單體熒光蛋白變種

在其自然狀態,存在大多數熒光蛋白,二聚體,四聚體,或高階低聚物。同樣,Aequorea victoria的綠色熒光蛋白被認為參與在一個四聚體複合物與水母發光蛋白,但這種現象已經在非常高的蛋白濃度和水母的熒光蛋白的二聚化的傾向,隻觀察到通常是非常弱(具有解離常數大於100微摩爾)。熒光蛋白的二聚化,因而一般不被觀察到,當它們被表達在哺乳動物係統。然而,當熒光蛋白定位到特定的細胞區室,如質膜,本地化的蛋白質濃度理論上可以變得足夠高,以允許二聚化。這是一個特別值得關注的,在進行FRET實驗,它可以產生複雜的數據集二聚文物,很容易受到損害。

建設的單體紅色熒光蛋白變體已被證明是一項困難的任務。第一代單體紅色熒光蛋白(稱為RFP1)的創造需要超過30個氨基酸改變結構然而,該衍生物具有顯著降低的熒光發射的天然蛋白質和光漂白相比非常快,渲染不太有用的單體綠色和黃色熒光蛋白。突變的研究工作,包括新技術,如體細胞突變,將繼續在搜索黃色,橙色,紅色和深紅色熒光蛋白的變種,進一步降低的傾向,這些潛在有效的生物探針自聯營公司的同時推動最大發射朝更長的波長。

改進的單體熒光蛋白正在開發,增加了消光係數,量子產率,耐光性,雖然沒有一個單一的變種尚未優化的所有標準。此外,與專四聚體的紅色熒光蛋白的表達問題被克服生成單體的變種的努力,已經取得了的衍生物,更兼容的生物學功能。

也許在這方麵一直是最壯觀的發展引進新的收獲來自單體紅色熒光蛋白,通過定向誘變定位的Q66Y67殘留的熒光蛋白反映類似顏色的熒光發射光譜輪廓(見表1和圖5)水果命名,這支隊伍的單體熒光蛋白表現出極大值在560至610納米的波長範圍。通過反複的體細胞突變產生進一步擴展這個類熒光蛋白質發射波長650納米。這些新的蛋白質基本上填補之間的差距最紅移水母熒光蛋白(如金星),珊瑚紅色熒光蛋白。雖然這些新的熒光蛋白質缺乏必要的亮度和穩定性,許多成像實驗,它們的存在是令人鼓舞的,因為它表明不測明亮,穩定,單體熒光蛋白在整個可見光譜。

光學熒光筆

在熒光蛋白研究中最有趣的發展之一,一直是應用這些探針分子光熒光筆(見表2),它的結果的外部的光子刺激或時間的推移改變顏色或排放強度。作為一個例子,本機水母肽的單點突變創建一個綠色熒光蛋白(被稱為PA-GFP),使從紫外到藍色光轉化的激發峰在400納米範圍內的光被照明的光活化的版本未轉化的PA-GFP具有相似的配置文件(約395至400納米)與野生型蛋白的激發峰。激發峰在488納米光轉化後,增加了約100倍。此事件喚起PA-GFP的未轉化的和轉換池的非常高的對比度之間的差異,是有用的細胞內的分子亞群的動態跟蹤。圖6所示的(a)是含有PA-GFP的488納米氬離子激光激發成像前(圖圖6(a))和之後(圖圖6(d))的光轉化在細胞質中被轉染的哺乳動物細胞生活405納米的藍色激光二極管。

的選擇光學熒光筆的性質
蛋白質 
(縮寫)
激發 
最大 
(納米)
發射 
最大 
(納米)
磨牙 
滅絕 
係數 
量子 
產量
體內 
結構
相對的 
亮度 
(EGFP%)
PA-GFP(G) 504 517 17,400 0.79 單體 41
PS-CFP(C) 402 468 34,000 0.16 單體 16
PS-CFP(G) 490 511 27,000 0.19 單體 15
PA-mRFP1(R) 578 605 10,000 0.08 單體 3
CoralHue-TandemG) 508 518 98,800 0.88 四聚體 259
CoralHue-TandemR) 572 580 60,400 0.33 四聚體 59
wtKikGR(G) 507 517 53,700 0.70 四聚體 112
wtKikGR(R) 583 593 35,100 0.65 四聚體 68
mKikGR(G) 505 515 49,000 0.69 單體 101
mKikGR(R) 580 591 28,000 0.63 單體 53
dEosFP-Tandem(G) 506 516 84,000 0.66 單體 165
dEosFP-Tandem(R) 569 581 33,000 0.60 單體 59
mEos2FP(G) 506 519 56,000 0.84 單體 140
mEos2FP(R) 573 584 46,000 0.66 單體 90
Dendra2(G) 490 507 45,000 0.50 單體 67
Dendra2(R) 553 573 35,000 0.55 單體 57
CoralHue Dronpa(G) 503 518 95,000 0.85 單體 240
Kindling(KFP1) 580 600 59,000 0.07 四聚體 12
表2

光學熒光筆,也可以采用其他熒光蛋白。 三光子激發(小於760納米),紅色熒光蛋白的熒光蛋白是能夠將正常的紅色熒光綠色。 這種效應可能是由於紅色熒光蛋白,紅色的發色團,從綠色狀態中觀察到的熒光光漂白選擇性。 定時器紅色熒光蛋白變種幾個小時的過程中逐漸變成明亮的綠色(500納米排放),以鮮紅的(580納米排放)。 綠色到紅色熒光的相對比例可以被用來收集用於基因表達的調查的時間數據。

被稱為PS-CFP,來自綠色熒光蛋白變體的誘變,甲光開關的光學熒光筆,已觀察到過渡從青色到綠色熒光照明後,在405納米(注意在圖6(b)和6的中央細胞的光轉化(e)條)。 以作為單體時,該探頭是潛在有用的,在光漂白,光轉換和光活化的調查。 然而,從PS-CFP的熒光是約2.5倍的調光比PA-GFP和其他方麵的光轉化效率(熒光發射的光轉化的40納米移位小於觀察到相似的探針)熒光筆差。 熒光蛋白或相關的其他誘變,得到更有用的變體,在該波長區域有可能。

光學熒光筆熒光蛋白

從珊瑚和海葵物種克隆熒光蛋白光學熒光筆也被開發隔離的石珊瑚,photoconverts從綠色到紅色,在紫外線的存在,一種熒光蛋白。 與PA-GFP,熒光楓轉換發生從它的照明光譜上不同的光的吸收。 不幸的是,這種蛋白是一種專性的四聚體,使得它不太適合毛皮使用作為比PA-GFP的表位標簽。 另一個四聚體石珊瑚(Lobophyllia hemprichii)熒光蛋白的變種,稱為EosFP(見表2),發出明亮的綠色熒光,用紫外光照射時,在約390納米的橙紅色。 在這種情況下,光譜的移位所產生的光引起的變形例,相鄰的發色基團的肽主鏈中包含一個停頓。進一步誘變的“野生型”EosFP蛋白產生單體的衍生物,這可能是有用的構建融合蛋白。

第三非水母光熒光筆, 點燃熒光蛋白(KFP1)的已開發非熒光生色分離Anemonia蘇卡達,現在市售(Evrogen)。 點燃熒光蛋白不會出現排放,直到照亮綠燈。 在一個短暫的紅色​​熒光的低強度的光的結果,超過了幾分鍾的衰減(參見圖6(c)中的線粒體)。 照明用藍色光線立即點燃的熒光淬滅,允許嚴格控製熒光標記。 與此相反,高強度的照明導致不可逆的火種,並允許穩定的高亮顯示類似的PA-GFP(圖6(f)條)。 在擁擠的環境中追蹤粒子的運動時,能夠精確地控製熒光格外有用。 例如,這種方法已經成功用於跟蹤開發爪蟾胚胎和個人PC12細胞中線粒體的運動神經板細胞的命運。

由於光學熒光筆繼續發展,熒光蛋白,可用於光學標記應走向光明的發展,單體,可以很容易光轉換和顏色的發射,顯示了廣泛的變種。 加上這些進步,顯微鏡在細胞生物學實驗室,配備照明熒光觀察模式和區域標記之間的順利協調將變得司空見慣。 最終,這些創新有潛力做出顯著成績的信號轉導係統在空間和時間上的動態。

熒光蛋白載體和基因轉移

熒光蛋白是相當靈活的,並已成功地應用在幾乎每一個生物學科從微生物係統生理學。 用於基因表達研究,在培養的細胞和組織,以及活的動物,這些隨處可見的探針作為記者,是極其有用​​的。 熒光蛋白在活細胞中,最常用的蛋白質,細胞器,和其他細胞區室的定位和動態跟蹤。 已經開發了多種技術,構建熒光蛋白融合的產品和增強其表達在哺乳動物和其他係統中。 主要車輛引入到細胞中的熒光蛋白嵌合基因序列是基因工程細菌的質粒和病毒載體。

熒光蛋白基因的融合產物,可以被引入到哺乳動物細胞和其他細胞,使用適當的載體(通常是質粒或病毒)或瞬時或穩定。 在短暫的,或暫時的,基因轉移實驗(通常稱為“ 瞬時轉染),質粒或病毒DNA導入宿主生物體不一定整合到染色體,但可以在很短的一段時間內的細胞質中表達。 表達的基因的融合產物,容易使用一個過濾器組兼容的熒光蛋白質的熒光觀察監測中,通常會發生在一段轉染後的幾個小時,持續72至96小時後的質粒DNA引入哺乳動物細胞。 在許多情況下,質粒DNA可以被整合到基因組在一個永久的狀態,以形成穩定轉化的細胞係。 瞬時或穩定轉染的選擇取決於調查的目標。

EYFP內質網局部矢量圖

有用的熒光蛋白基因轉移實驗的基本的質粒載體配置有一些必要的組件。 必須包含該質粒的原核細菌的DNA複製起點和抗生素抗性基因的核苷酸序列編碼。 這些元素,通常被稱為班車序列,允許進行傳播和選擇的質粒哺乳動物轉染的載體,以產生足夠數量的細菌宿主內。 此外,該質粒必須包含一個或多個控製開始信使RNA的轉錄,哺乳動物的多聚腺苷酸化信號,一個內含子(可選),和在哺乳動物細胞中的基因的共同選擇的真核細胞的遺傳元件。 轉錄元件是必要的哺乳動物宿主,表達感興趣的基因融合產物,並選擇基因通常是一種抗生素,含有質粒的細胞賦予阻力。 這些一般功能根據質粒的設計而有所不同,和許多載體有廣泛的適合於特定的應用程序的附加組件。

成功的哺乳動物轉染實驗依賴於使用的高品質的質粒或病毒DNA載體,是相對自由的細菌內毒素。在原生狀態,環狀質粒DNA分子表現出三級超螺旋構象扭曲周圍的雙螺旋結構本身幾次。很多年了,超螺旋質粒和病毒DNA純化方法的選擇是在插層劑(如溴化3,8 -二氨基-5 -乙基-6 -苯基菲啶溴化或碘化丙啶等)的存在下氯化銫密度梯度離心法。該技術中,這是昂貴的設備和材料,偏析從線性染色體和缺口的環狀DNA超螺旋的DNA(質粒)根據浮力密度,使收集的高純度質粒DNA。最近的,簡化的離子交換柱色譜法(通常被稱為一個小量製備)在很大程度上取代了繁瑣和耗時的離心協議在一個相對短的時間內產生大量的無內毒素的質粒DNA。

已經開發了專門的細菌突變體,被稱為主管細胞,為方便和相對廉價的擴增的質粒載體。該細菌含有調色板的突變,使他們特別容易受到質粒複製,並且已經在一個過程稱為轉化穿過細胞膜和細胞壁的DNA的化學通透改造後的細菌生長至對數生長期的存在的選擇取決於質粒的抗生素。細菌培養,離心濃縮和裂解用堿性洗滌劑溶液中含有的酶降解汙染的RNA幹擾。的溶胞產物,然後過濾,並放置在離子交換柱。不需要的物質,包括RNA,DNA,蛋白質,從柱中徹底洗滌前使用高鹽緩衝液中洗脫的質粒DNA。醇(異丙醇)沉澱濃縮物,這是通過離心收集,洗滌,並再溶解在緩衝液中的洗脫質粒DNA。純化的質粒DNA轉染實驗上班做好準備。

在哺乳動物細胞中的脂質介導的轉染

用於轉染的哺乳動物細胞必須是在良好的生理條件下,生長於對數生長期,在手術過程中。寬譜已商業化開發的轉染試劑,優化培養細胞攝取質粒DNA。這些技術的範圍從簡單的磷酸鈣沉澱,螯合的質粒DNA在脂質囊泡,保險絲細胞膜和細胞質中提供的內容(如圖8所示)。統稱為脂質體轉染法,脂質為基礎的技術已經滿足了廣泛的接受,因為它的有效性,在大量流行的細胞係,它是目前大多數轉染實驗的首選方法。

最後,在熒光蛋白應用的巨大潛力,為工程的生物傳感器是剛才被實現。生物傳感器的構造的數量正在迅速增長。通過使用結構信息,這些探針的發展已導致提高了靈敏度,並且將繼續這樣做。當然這些努力的成功表明,幾乎所有的生物的參數將是可衡量的,使用適當的熒光蛋白為基礎的生物傳感器。



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