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貨真價實 坦誠無欺
新聞資訊

尼康顯微鏡,標本的準備和圖像

2013-10-28  發布者:admin 

大部分來自那些已經過多年開發與傳統的寬視場顯微鏡使用的程序準備和共聚焦顯微鏡成像標本。 在開發一個新協議標本共聚焦顯微鏡成像最好的辦法是開始與一個已知是適合傳統的顯微鏡,並根據需要修改它。

無論協議的試樣製備,共聚焦顯微鏡進行的方式所產生的一個主要好處是在圖像顯示和分析的結果,從多個圖像的同時采集到計算機中,以數字形式的靈活性。 這在下麵更詳細討論的,但一個優雅的例子在圖1中,一個三元組標記的果蠅胚上麵的蜂窩胚盤階段的圖像顯示的可能性。 該標本的免疫熒光抗體標記的三種不同的蛋白質。 後三個對應的圖像的紅色,綠色和藍色通道的共聚焦係統中,收集的圖像可以被重新排列,通過將它們複製到不同的通道。 通過評估從合並的三個,最有效的顏色示出的各種蛋白質結構域的信道分配產生的圖像被選擇。圖1給出了合並後的三通道圖像(組合紅色,綠色和藍色通道)。

已證明是成功的,在傳統的寬視場光學顯微鏡標本製備的一種方法,特別針對減少聚焦熒光的量,因為這將產生圖像中的喇叭形,大大降低了分辨率的功能還。 由於共焦方法所實現的光學切片,共聚焦顯微鏡相比,傳統的落射熒光顯微鏡undersamples在厚的樣品的熒光。 其結果是,樣品可能需要增加染色時間,著色劑的濃度進行共焦分析,如果在常規的顯微鏡評估,可能會超過被汙染的。

雖然在典型的激光掃描共聚焦係統中的照明似乎是極其明亮的,在任何給定的點在試樣上的平均照度相對溫和,由於這樣的事實,多點每秒掃描。 在一個典型的1.6微秒的每一個點的掃描速度,在任何給定的點的實際的照明一般小於在傳統的寬視場落射熒光顯微鏡。 它通常是最好用最低的實用的激光功率,為了保護熒光成像。 雖然許多協議包括antibleaching的代理,防止褪色的熒光物種,可能並不需要這樣的添加劑與許多更現代的共聚焦工具。

共聚焦顯微鏡的主要優點和應用更厚的試樣是在改進的成像能力,雖然成功試樣的特定屬性可以是有限的。 若幹試樣的最小物理要求適用,它必須適應上的顯微鏡載物台,和感興趣的區域必須是能夠被放置在所述物鏡的工作距離範圍內。 在某些情況下,分辨率可能受到損害,以容納一個標本,以避免損壞或物鏡。 例如,可以具有一個高分辨率的鏡頭,如60倍的數值孔徑為1.4的工作距離為170微米,而20倍(具有典型的數值孔徑為0.75),可以提供一個相對較大的660微米的工作距離,與能夠訪問更多的禁區的標本,沒有實物形態的幹擾。

的試樣,具有三維結構,該結構是用共聚焦顯微鏡研究,有可安裝在這樣一種方式,以保持結構。 某種形式的隔離物,如漁線或蓋玻片一塊,通常放在載玻片和蓋玻片之間,以避免變形的試樣。 當活體標本的研究,它通常是必要的,將它們安裝在一個腔室,可提供對生命的所有必要的要求,也將允許通過物鏡的圖像所需的區域的足夠的訪問。

物鏡參數和光學部分的厚度

客觀 針孔
放大 NA 封閉(1毫米) 打開(7毫米)
60X 1.40 0.4 1.9
40倍 1.30 0.6 3.3
40倍 0.55 1.4 4.3
25倍 0.80 1.4 7.8
4倍 0.20 20.0 100.0

表1

試樣屬性,會影響,如不透明度和濁度,透光性,可以極大地影響到試樣中的激光束的穿透深度,因此結構可以成像。 未定影的和未染色的眼睛的角膜上皮細胞,例如,是相對透明的激光束穿透到約200微米的深度。 與此相反,未定影的皮膚相對不透明的散射光,限製了激光穿透至約10微米。 許多固定的協議,旨在提高組織的透明度,包括某種形式的結算代理。

如果無法實現足夠的激光穿透整個安裝試樣,厚的部分可以用切片機切割。 通常使用固定的組織切片,但vibratome的組織(如活腦)中已經減少了,並成功地成像。 為了獲得部分安裝的部位較深,可以從幻燈片中取出試樣,反轉它,並重新安裝它,但是這通常不是很成功。從檢體的深部的圖像,可以通過以下方式獲得使用被激發的染料,在較長的波長(例如花青5),相對於那些需要更短的波長的激發。 然而,使用較長波長的照明,將略微減少相比,在更短的波長獲得的圖像,可以實現的最大分辨率。 出於類似的原因,多光子成像技術允許從更深的層次內的標本(由於采用紅光激發)收集的圖像。

物鏡

對於共焦顯微鏡的研究中,所使用的物鏡的選擇是極其重要的,作為聚光的能力的透鏡,作為其數值孔徑,測量的分辨率和光學部分的厚度的一個決定因素。 持有其他顯微鏡變量的常數,物鏡的數值孔徑越高,越薄的光學部分。 作為在一個特定的儀器,使用60倍的光學部分的厚度設定在1mm針孔的直徑是約0.4微米,並與16倍(0.5)透鏡的數值孔徑(數值孔徑為1.4)的目標,具有相同的1 - 毫米針孔,切片厚度為1.8毫米的順序。 通過打開較大直徑的針孔,光學部分的厚度可以增加。 表1給出了各種客觀鏡頭的光學部分的厚度值(微米),在兩個不同的針孔直徑為物流及供應鏈管理應用技術研發中心的一個模型。 圖像分辨率始終是較差的垂直比水平。 例如,使用60倍,1.4的數值孔徑,物鏡的水平分辨率是約0.2微米,約0.5微米的垂直分辨率。 場的平整度和色差物鏡選擇時要考慮額外的鏡頭特性。 色像差校正的程度是特別重要的成像時,在不同的波長的多標記標本。

物鏡分辨率最高的,有能力的,一般是那些具有最高的放大倍率和數值孔徑最高。 它們也是最昂貴的,所以往往是由掃描試樣的區域和該區域中,可以實現的最大分辨率之間的一個折衷辦法。 如果成像昆蟲的胚胎和成蟲磁盤的,例如,4倍的透鏡可能被用於定位試樣在幻燈片上,16倍(數值孔徑為0.5)鏡頭成像的整個胚胎,和40倍(數值孔徑為1.2)或60倍(數值孔徑為1.4)鏡頭為解決個別細胞核內胚胎或成蟲磁盤。 4倍的鏡頭對於成像較大的組織,如蝴蝶成蟲磁盤的,將有助於整個翼磁盤,和解決單個細胞的40倍或60倍的。 圖2(a)示出了使用了4倍的目標取得整個蝴蝶五齡翼成蟲盤的整體圖,和16倍的透鏡(圖2(b))所提供的額外核的細節。 可以結合高分辨率和大圖像視野的一種方式是從鄰近地區獲得許多圖像,並結合成蒙太奇數字。 有些顯微鏡自動化XY階段,可以設置走動標本和收集多個圖像到大麵積的蒙太奇。

大多數LSCMs有特征的更有用的功能之一是能夠進行放大的圖像,使用相同的物鏡,不喪失決議。 此功能是簡單地通過降低由激光掃描試樣的麵積,通過掃描鏡的控製,同時保持相同的圖像的顯示尺寸或存儲器存儲陣列大小,有效地增加放大倍率。 這樣,多個放大倍數不幹擾樣品或參考點的視場中的丟失的情況下實現與單透鏡。 然而,在可能的情況下,更高的數值孔徑的透鏡應可以使用,以達到最高的清晰度,而使用較低的數值孔徑的透鏡的變焦比。的能力的單透鏡(40倍)放大示出圖2中的(cf)。 的數字顯示麵板(C)40倍的目標(比16x的圖(b))提供額外的核細節。 麵板(d)到(f)是通過以下方式獲得相同的累進透鏡,通過減少在試樣上的掃描區域40倍變焦的圖像。

共聚焦儀器設計有一些限製聚焦的光到達檢測器的一個可調節的針孔。 打開較大直徑的針孔產生更厚的光學部分和降低分辨率,但往往是必要的,以包括更多的標本細節或增加撞擊檢測器的光。 由於針孔的關閉(縮徑),光學部分的厚度和亮度降低。 分辨率的提高,直至達到目標的最小的針孔直徑,超過該分辨率不增加,但亮度繼續減小。 在此條件下達到的針孔直徑為每個物鏡是不同的。

共聚焦成像探頭

共焦儀器的發展繼續影響力,又能受到新的熒光探針的合成,提高免疫定位。 熒光染料被引入,有更密切地相匹配的由激光器產生的波長與大多數商業LSCMs供給的激發和發射光譜。不斷發展改進的探頭,可以結合目前的研究興趣抗體。 的花青染料組作為一個例子,作為替代品其他曆史悠久染料的開發,作為一個美好的替代羅丹明菁3,找到越來越多地使用在三重品牌戰略菁5。

熒光原位雜交(FISH)探針檢測分辨率和靈敏度方麵具有優勢進一步增強時與激光掃描共聚焦顯微鏡,成像熒光標記的DNA和RNA序列在細胞中的分布是一個有價值的方法。 此外,明亮的熒光探針,目前可用於在兩個原子核和孤立的染色體總DNA的激光共聚焦顯微鏡成像。

大量熒光探針可結合在相對簡單的協議,當目標的細胞器和結構,特別是染色。 可用探針之間的過多的染料,的標簽細胞核,高爾基體,內質網和線粒體,染料如熒光標記的phalloidins,目標聚合的肌動蛋白在細胞中。 這種染料是非常有用的,在多個標簽的方法來定位感興趣的抗原在細胞中具有特定的隔間。 例如,圖3給出了就業相結合的鬼筆環肽和核染料(TOPRO)的蝴蝶蛹翼成蟲磁盤應用到整個坐騎在三重標簽計劃與相應的抗原。 圖3(a)所示,鬼筆可以用來強調在發展組織的細胞輪廓,與周邊肌動蛋白小梁被標記為明亮的熒光環。麵板(B)的數字說明了戲劇性的特異性核染料標記隻是一個細胞成分。 除了本細胞區室的標記策略,可以有益地包括已知的分布或功能的細胞(例如抗微管蛋白)的蛋白質的抗體在多標記研究。

如果活細胞成像,關鍵是要認識到係統中添加熒光染料的效果。 這些探頭可以活細胞毒性,尤其是當他們用激光激發。 毒性的影響降低到細胞培養基中添加抗壞血酸在一些準備協議。在成像過程中的特定的被標記的細胞成分,可能會影響細胞的生存能力。 例如,細胞核的汙漬通常有更多的有害影響比細胞質染色。 探頭可以區分活細胞和死細胞(其中,吖啶橙),在成像過程中,可用於檢測細胞活力。 大多數這樣的檢測方法是基於的前提時,死細胞的膜是可滲透的許多材料,如染料,這是不能穿透生活狀態。

螢光-3和RHOD-2已被合成,改變自己的某些離子,如鈣離子的存在下的熒光特性的染料的例子。 新的探針已被開發用於成像基因的表達,包括,例如,水母的綠色熒光蛋白(GFP),這使觀察體內的基因表達和蛋白質的定位。 GFP的使用,使基因表達的監測,在許多不同類型的細胞,包括起居室果蠅卵母細胞,哺乳動物細胞和植物(使用激光掃描共聚焦顯微鏡的激發激光的488nm的線)。 GFP用頻譜發生變化的突變體可用於在multilabeling實驗,並且這些人還發現了用於避免幹擾的在生物體組織的自體熒光。

自體熒光

在許多類型的細胞中自然發生的組織的自體熒光,並且可以在成像過程中的背景幹擾的主要來源之一。 例如,在酵母和植物細胞中的葉綠素熒光的紅色部分的光譜。 某些試劑如戊二醛固定劑,是源的自體熒光,這可以減少用硼氫化鈉處理。 有時可避免使用熒光基團,可以是天然的自體熒光的範圍內的波長被激發自體熒光。 花青5經常被選用,因為它是在較長波長處,避免了更短的波長的自發熒光激發。

雖然它是最經常考慮的一個問題,組織的自體熒光,可用於成像的整體細胞形態作為的multilabeling研究的一部分。 自發熒光的總熒光的貢獻可以評估通過查看未染色標本在不同的波長,並指出黑電平增益的激光功率和PMT設置。 往往可以自體熒光漂白,在高功率激光,或通過泛濫的標本汞燈的光從一個簡短的接觸。 包括使用更複雜的方法來處理自體熒光時間分辨成像,或利用數字圖像處理技術,如圖像減法去除。

收錄圖像

開始共聚焦顯微鏡的用戶可以在幾個方麵獲​​得經驗。 顯微鏡通常由製造商提供的手冊包含了一係列必要的程序簡單,入門。 大多數多用戶設施的主要負責人,操作儀器,可提供定向會議,或者設施經理可能需要有一定的專業水平獨奏使用儀器前進行短期培訓和示範。 應特別注意支付給該設施的內部規則。 顯微鏡公司進行的培訓課程,從顯微鏡的工作坊,也可以得到的信息和培訓,並從各種出版物。

與實驗標本工作之前,至關重要的是要熟悉所涉及的攝像係統的基本操作。 它通常是一個相對容易的標本,而不是一個更困難的實驗之一,有利於新手開始試成像。 一些更好的測試樣品包括紙浸在一個或更多的熒光染料或熒光珠的製備。 這兩種類型的試樣是明亮的熒光和共聚焦係統的圖像比較容易。 另一個出色的樣品表現出的自體熒光在許多不同波長的混合花粉的幻燈片。 這些可以容易地製備園林植物花粉,或可從商業供應商的生物樣本。 同時,相同的光電倍增管的黑電平,增益,和針孔的直徑設置在圖4中的花粉粒圖像采集,但揭示了三種類型的花粉,每個熒光在不同的激發波長。 這些標本作為測試對象是有價值的,因為他們不僅有一些有趣的表麵細節,還能保持其性能相對較好時,接觸到的激光束。 活體組織標本製備洋蔥上皮或水植物伊樂藻的試驗。 是可靠的,可以使用自體熒光或與染劑DiOC6染色。

聚焦儀器在嚐試成像之前,應設置盡可能最佳的性能。 這需要最優比對,特別是當一個正在使用的舊的共聚焦顯微鏡。 使用的校準程序,是非常具體的特定工具,通常是最好的人誰擁有全麵負責維護。 在任何情況下,應對準嚐試沒有適當的訓練,從顯微鏡的所有者和權限。用於嚐試對準的程序不當可導致完全喪失的光束,一些儀器的情況下,可以要求上門服務,以糾正。

共焦係統是基於傳統的光學儀器,光學顯微鏡的基本程序和慣例,在任何時候,應遵循。 這是非常重要的,在光路中的所有玻璃表麵清潔,因為灰塵,油汙,或潤滑脂,載玻片,蓋玻片,物鏡圖像不佳的主要原因。 在物鏡和標本之間的折射率必須是適合於所使用的鏡頭。 例如,正確的浸油,必須使用對於一個給定的物鏡的數值孔徑,試件必須被安裝成在透鏡的工作距離。 蓋玻片的厚度必須是正確的,所使用的透鏡,特別是對較高的功率目標,要求第1“或”否“,而不是第2號1.5蓋玻片。 蓋玻片必須密封,以使用合適的培養基中滑動,安裝在平坦的。 指甲油可用於固定的標本,如果采取審慎態度,以確保它是幹的前成像。 將凡士林,蜂蠟,羊毛脂,或一些其他的無毒密封材料,必須使用與活標本。 經過嚴格的基本清潔程序在樣品製備階段,可以節省大量的時間和精力。

在聚焦模式下成像的準備,一個地區的利益所在,無論是明場或使用傳統的熒光顯微鏡。 另外,優選使用的共聚焦係統的顯微鏡做這個調查,但對於新手來找到正確的焦平麵單獨使用共焦成像模式,它可以是非常困難的。 如果傳統的成像模式是不可用的共聚焦係統上,然後結構還可以使用一個單獨的熒光顯微鏡定位,它們的位置標使用的鑽石在顯微鏡上的標記,標記筆,或通過記錄的位置坐標從顯微鏡階段。 這是特別有用是能夠預覽與實際的共聚焦係統的顯微鏡標本,當試圖圖像一個罕見的現象,如在一個特定的發展階段表達的基因,在檢體可能包含數百個不同年齡的胚胎的。 大量的時間可以以這種方式保存,過有許多標本,使用共焦模式掃描。 共聚焦工具通常有一個低分辨率的快速掃描模式,使得初步掃描更高效。 ,但是,搜索很少發生的事件時,最好的方法是使用傳統的顯微鏡檢測模式,然後立即切換到共焦模式下,在相同的顯微鏡圖像收集掃描的幻燈片。

掌握的“秘密”依賴於成功的共焦成像的物鏡的數值孔徑,針孔的大小,圖像的亮度,並使用最低的激光功率可以達到最佳的圖像之間的相互作用。 新手用戶應該試驗用試樣和試件幾個不同的放大倍數和數值孔徑的物鏡來獲得,然後再嚐試成像實驗標本的顯微鏡的能力感改變這些參數。 應使用變焦功能與使用具有更高的數值孔徑的目標所得到的共聚焦係統的圖像獲得的比較。 特定的樣品和功能成像,將決定哪些鏡頭和方法是最合適的。 適合於激光共聚焦顯微鏡的許多目標的兩個例子示於圖5。 數字包括一個60x planapochromat的油浸鏡頭和20倍planfluorite的。 後一目標的調整軸環,它允許利用油,甘油,或水作為液浸介質。

特定的顯微鏡設置適當的試樣應設立相差的主要感興趣的區域,以避免在有價值區域的試樣的熒光物種的光漂白。 這通常需要設置光電倍增管檢測器的增益和黑電平與​​針孔的大小,以獲得可接受的分辨率和足夠的對比度之間的最佳平衡,使用最低的激光功率,以盡量減少光漂白。 許多儀器利用顏色查找表的設計,以幫助設置正確的動態範圍的圖像。 這樣的表的設計,使最暗的像素,亮度值在零附近,是任意顯示為綠色(例如),各路像素的亮度值在255附近在8位係統,會顯示為紅色。 該顯微鏡的參數,例如增益,黑電平,和針孔的直徑,調整,以便有隻有少數綠色和紅色的像素在圖像中,確保利用從0到255的全部動態範圍,但很少截止亮度範圍的任一端。 雖然這些調整,可通過肉眼,在極端的使用偽彩色成像係統的動態範圍,使調整變得較少主觀。 在某些情況下,圖像必須被收集以低於全動態範圍的係統,因為必須使用小於最佳激光功率或檢體有不均勻的熒光,導致掩蓋感興趣的幀中的調光區域的明亮區域。

在掃描過程中的檢體的圖像的平均例程,通常采用降低隨機噪聲的檢測係統,並加強固定(非隨機的)圖像中的特征。 一種圖像均衡算法可以應用於後采集的圖像縮放它們的全動態範圍的顯示。 應小心,要應用此不同的例程如果施加均衡例程之前,除非在控製圖像被包含在同一幀中作為實驗用圖像進行熒光強度的測量。 在使用任何類型的圖像處理程序,它是一個很好的策略,以節省任何處理的原始未處理的圖像。

圖像采集通常的策略是將圖像保存到共聚焦係統的計算機的硬盤上,以後將它們備份到其他大容量存儲設備。 一般來說,它始終是最好,顯微鏡會話期間盡可能收集盡可能多的圖像,並放棄不必要的,在以後的審查。 許多似乎是不必要的圖像,首先考慮進一步審查後,在以後的日子(尤其是與同儕)變得非常有價值。 如果它似乎浪費看似多餘的圖像,考慮它更難準備另一標本,更難重現精確的實驗條件,或什至完全複製的樣品製備協議。

成像開始之前,應製定的策略標記圖像文件信息的方式。 在成像過程中,許多票據應采取或隨著圖像添加到圖像文件中,如果這種能力是可以使用的係統。 應該做的測試,以確保訪問任何保存的信息是保存圖像後,牢記時,它隨後被轉移到NIH圖像或Adobe Photoshop的圖像編輯程序,如文本和圖像相關的其他信息,可能會丟失其他電腦。 一個組織良好的筆記本電腦或筆記本電腦上的文件可能會優於其他方式記錄成像會話的詳細信息,並應包括文件名,注釋和細節的目的和任何用於允許在稍後的日期計算比例尺的縮放因子。 ,大多數聚焦係統不自動記錄使用的物鏡,這個信息是非常重要的用於計算字段寬度和後出版的比例尺。 許多現代係統利用圖像數據庫的組織的文件的文件名和位置,通常會顯示圖像文件的縮略圖。 必須小心,按照圖像的命名係統所施加的限製,如允許在文件名中的字符和句點或空格字符,如是否可能被誤解的軟件。

故障排除

任何實驗學科,協議已經產生了良好的效果有時會莫名其妙地停止工作。 共聚焦成像實驗,當發生這種情況,有可能是初始反射怪的工具,而不是標本,但應進行測試,以確認該標本進行任何故障診斷儀器上開始之前沒有過錯。 一個很好的第一次測試是在傳統的落射熒光顯微鏡查看樣本。 如果某些熒光是肉眼可見的,功能正常的共聚焦係統的信號應該是非常光明的。 經確認,熒光標本中存在,然後做一些測試的共聚焦係統使用已知的試驗片,而不是實驗。 為便於參考,在共焦係統應該有一個數字文件訪問的用戶的顯微鏡,包括其收集的所有參數,如激光功率,針孔的直徑,物鏡和變焦值和增益的測試試樣的圖像,並黑電平檢測器。

如果初步測試不提供明確的解決方案,它是最好的專家誰可能遇到的問題以尋求幫助。 作為一項規則,如果用戶是不知道的東西,它是最好的,他們退後一步,並尋求幫助,然後再嚐試任何補救措施。 共聚焦顯微鏡的所有公司提供的熱線電話和提供額外的幫助,可以訪問網站。

被跟蹤的製備協議的問題,通常所造成的降解的試劑,並通過進行一係列的診斷測試,應檢查。它通常是最好的人做實驗,以彌補自己的試劑,或至少要取得他們的信任的同事。抗體應分配的冷凍小批量的股票,然後將其存儲在冷藏條件下,不應該被重複使用,除非絕對必要的。有時稀有或昂貴的試劑,這是不可避免的,通常不會出現問題。

出血在多標記標本的實驗中,通過從一個通道到另一個可以作為試樣本身,或由於顯微鏡的問題的性質的結果發生。在文獻中,應征詢發布評論流血通過和可能的補救措施的原因的詳細信息。一個很好的測試儀器本身涉及成像試驗樣品與已知的流血通過屬性,同時使用多個標簽和單標簽設置。在測試樣品的圖像應與所有相關的顯微鏡設置的記錄一起存儲,這樣,當問題發生時的試驗片可以重新與存儲的記錄,可被稱為當儀器相比具有相同的儀器條件和圖像成像最佳運行狀態。

當問題出現時,可以用其他的測試包括激光照明的顏色的激光的陽極電壓的檢查,目視檢查。如果,例如,氪/氬激光的光束掃描上的多個標簽設置時,呈藍色,而不是白色,那麽這可能表明紅線弱。在這種情況下,陽極電壓可能會過高,通常可以通過調整反射鏡的激光減少到可接受的水平。這種調整應該做的,或監督人負責維持共聚焦係統。如果電壓不能被帶入一個可接受的範圍內,可能需要替換為激光。

中可能遇到的另一個問題是,抗體探針可以具有降低或需要進行再純化,或以其他方式清洗。已準備了一段時間的試樣,有可能發展增加背景熒光和由分離的第二抗體的熒光染料擴散到周圍組織中引起滲色。 如果可能的話,影像應新鮮製備的標本。 有時候,改變濃度和/或熒光染料的分布,將有助於減輕問題。 作為一個例子,熒光素可能出血到若丹明通道,可以切換成使羅丹明上更強的信道。 這樣做的理由是,熒光激發光譜有一個尾,重疊和被激發在若丹明波長範圍。 在隨後的實驗中,輔助的濃度可以減少。

圖像處理和出版

共聚焦顯微鏡獲得的圖像通常保存為數字格式,使他們能夠使用共焦係統的一部分提供的專有軟件很容易被操縱的計算機中的文件。 的最顯著提高的當前LSCMs能力之一是它們的共聚焦圖像的顯示。 這是非常重要的,因為改進利用共聚焦顯微鏡成像的價值不大,如果有沒有辦法有效地顯示圖像硬拷貝或複製。

最近5年左右前大多數實驗室仍在使用傳統攝影暗房和化學處理的薄膜和紙張,其最終的硬拷貝圖像。 再現彩色圖像有特別的困難,因為他們通常由獨立的打印機通常很少有想法什麽構成正確的色彩平衡的顯微印刷和打印質量的成本很高。 要取得現在的硬拷貝圖像,圖像文件可以導出到一個幻燈片打印機,彩色激光打印機,或出版打印質量的染料升華打印機,直接控製被收購人保持圖像特征圖像。 可以直接打印照片或幻燈片,視頻監視器屏幕,可以在Web上發布和電影序列。

現在大多數期刊都能夠接受的數字圖像文件的發布,這導致發布的圖像質量顯著改善。由共聚焦成像係統的圖像質量達到現在可以在發表的文章中更忠實地再現。在某些情況下,期刊也使他們的文章可以用CD-ROM,這意味著讀者可以訪問發布的圖像,正是因為他們對那些做研究的共聚焦係統采集時出現。毫不奇怪,圖像采集,顯示和發布的技術進步現在可以準確地再現圖像的原始分辨率和色彩平衡,從理論上說,在低得多的成本向筆者特別有利的情況下,在該刊物上的彩色圖像。



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