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貨真價實 坦誠無欺
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尼康顯微鏡告訴你,什麽是相差顯微鏡?

2013-10-31  發布者:admin 

相差顯微鏡,在1934年首次描述由荷蘭物理學家釉澤尼克,對比度增強的光學技術,可以利用以產生高對比度的圖像的透明標本,如活細胞(通常在培養物),微生物,薄的組織切片,光刻圖案,纖維,膠乳分散體,玻璃碎片,和亞細胞顆粒(包括核和其它細胞器)。

實際上,相位對比技術采用了光學機構翻譯成相應的振幅的變化,它可以是可視化圖像的對比度差異的相位的微小變化。相差顯微鏡的主要優點之一是沒有先前被殺害,固定,染色,活細胞中可以檢查它們的自然狀態。其結果是,可以觀察和持續的生物學過程的動態記錄,可在高對比度的鮮明清晰分鍾標本細節。

圖1中顯示的是一個現代的直立相襯顯微鏡的剖開圖,包括相位對比光學列車的示意圖。部分相幹照明產生的鹵鎢燈被引導通過聚光透鏡集中在台下聚光前焦平麵定位在一個專門的環形帶(標記為聚光鏡的環形帶)。波前通過環照亮標本,通過不偏離或標本中存在的結構和相位梯度相衍射和智障。不偏離的偏析,由相差的後側焦點麵的衍射光由物鏡收集並聚焦在中間像平麵形成的最後階段在目鏡中觀察到的對比度的圖像。

本發明的相襯技術之前,透射明場照明的最常用的觀察模式,在光學顯微鏡,尤其是對於固定,染色標本或其他類型的可見光具有高的自然吸收的樣品之一。總的來說,的標本容易地成像與明照明被稱為振幅對象(或標本),因為照明的波陣麵的振幅或強度降低,當光穿過試樣。

可以采用一個標準的明視野顯微鏡相襯光學配件此外,作為一種技術來呈現一個讓人聯想到光學染色(參見圖2)在透明的標本對比度增強效果。光波衍射和標本(稱為相位對象的相移可以轉化相襯中的目鏡可觀察到振幅差異。大的,擴展的標本也容易可視化,由於衍射和散射的現象,發生在這些對象的邊緣的相位對比光學係統。現代相襯顯微鏡的性能做精,使標本中含有非常小的內部結構,甚至隻是一些蛋白質分子,被檢測到時電子增強和收購後的圖像處理技術被耦合到。

圖2給出了培養的活細胞,在明視場和相襯照明成像的比較。細胞生長的營養物的培養基中含有的氨基酸,維生素,礦物鹽,胎牛血清沐浴在單層培養的人膠質腦組織。明照明(圖圖2(a)),細胞出現半透明隻高折射區域,如膜,細胞核,而獨立的細胞(圓形或球形),可見。當觀察相襯光學配件,同一領域的觀點揭示顯著更多的結構細節(圖2(b))。蜂窩附件成為可辨別的一樣,大部分的內部結構。此外,顯著提高對比度的範圍。

澤尼克相襯光學理論的發展是一個很好的例子,如何從一個高度專業化的領域(在這種情況下,理論物理)的研究成果可以產生創新的新發展,在看似無關的學科,如生物學和醫學。在第二次世界大戰期間,在德國耶拿的蔡司光學工程是世界上第一家將實際相襯光學顯微鏡。生物研究的直接影響是顯著的,和該技術的廣泛應用,持續到目前的一天。現代相襯物鏡,尼康等光學製造商設計和生產的,是能夠結合輔助對比度增強技術,如微分幹涉對比,熒光,偏振光。這些物鏡是提供與內部相位板有不同的吸收和相位位移環繞(未衍射)照明水平,產生廣泛的標本對比度和背景強度的選擇相襯顯微鏡。

光波階段標本的相互作用

事件眼波目前在照明光束變成分為兩部分後,通過一個階段的標本。其主要組件是一個不偏離(非衍射的零階)的平麵波前 ​​,通常被稱為環繞S)波,通過和試樣周圍,但不與它進行交互。此外,也產生了偏離或衍射的球麵波前 ​​(D -波),也變成分散在很寬的弧(在許多不同的方向),通過全開光圈的物鏡。在離開試樣平麵,環繞聲和衍射的光波進入物鏡的前透鏡元件,其後集中他們通過幹涉相結合,以產生所得的粒子波(通常簡稱為P -波)在中間像平麵相襯顯微鏡中產生的各種光波之間的數學關係,可以簡單地描述為:

P = S +ð

取決於檢測的標本圖像的相對強度的差異,因此,在振幅上的粒子和環繞聲(PS波)。如果粒子和環繞波的振幅顯著不同的中間像平麵中,則檢體取得了相當數量的對比,並且很容易在顯微鏡目鏡可視化。否則,將試樣保持透明和普通明場條件下(在相襯或其它對比度增強技術的情況下),因為它會出現。

在檢體及其周圍介質中,該部分的入射光的波前穿過檢體(D -波),但不通過周圍介質(S -波)之間的光路變化,略有滯後。對於在相襯顯微鏡的參數,改變波通過的光路長度(實際上,相對相移)中的試樣的作用是非常重要的。在經典光學係統中,通過一個物體或空間的光路長度(OPL)的折射率(n)的和的厚度()的對象或中間介質中所描述的這種關係的商品

光學路徑長度(OPL)= N×T

當光從一種介質傳遞速度被改變成另一種,兩種介質的折射率之間的差異成比例。因此,當相幹光器發出的電磁波聚焦鏡燈絲通過檢體具有特定的厚度(t)的折射率(n)的相位,波可以是增加或減少速度。如果試樣的折射率大於周圍介質,波速度降低,而通過試樣,隨後在相對 ​​的相位滯後時,從檢體出現。相反,當周圍介質的折射率超過試樣,波先進的退出時試樣的相。的緊急檢體和周圍介質中的波陣麵之間的位置的差異被稱為相移(δ),並以弧度為單位定義為:

δ=2πΔ/λ

在上述方程中的術語D,這是類似的光路長度光程差被稱為

光程差(OPD)=Δ=(2 - N 1)×T

其中,N(2)(1)試樣的折射率和Ñ是周圍介質的折射率。的光程差的查詢結果從兩個術語的商品:試樣的厚度,其與周圍介質的折射率的差異。在許多情況下的光程差可以是相當大的,即使試樣的厚度是小的。另一方麵,當試樣的折射率等於周圍介質中,光路差為零時,無論是否用試樣的厚度是大還是小。

對於各自的細胞在組織培養中,光程差也比較小。一個典型的單層培養的細胞具有約5微米的厚度和折射率約1.36。該信元被包圍的營養培養基中,其折射率為1.335,0.125微米,或約四分之一波長(綠色光)產生的光程差。亞細胞結構產生小得多遲鈍的。這些小光程差產生的線性強度降低,增加移相(圖像的增長逐漸變暗)到一個點(取決於相位板配置),在這之後,通過對比逆轉標本圖像變得更亮。在相襯顯微鏡的圖像的強度不承擔試樣的整個厚度和折射率範圍的光程差所產生的一個簡單的線性關係。相反,強度依賴於多種因素,包括吸收的相位板,相位超前或相差的相位板的程度,相對此相移的跡象。

波相互作用相差顯微鏡

在圖3中,環繞,衍射和顆粒(SD,和P)的試樣,該區域在明視野顯微鏡(相襯光學配件的情況下)的圖像平麵的波之間的相位關係環繞波和粒子,其相對幅度的數額確定標本的對比,紅線和綠線(分別)所示。從檢體,這是從來沒有直接觀察到的,由X射線衍射產生的波被描繪成一個藍色的波振幅較低。環繞聲波和衍射波通過幹擾複合生成的顯微鏡圖像平麵中的所得到的粒子波。圖3中所示的每個波的振幅表示波的各個組件的電矢量的總和。

相對於環繞波,衍射波振幅較低(因為有更少的衍射比環繞聲光子的圖像點),通過與試樣相互作用約90度(四分之一波長)在相位上被延遲。的二十分之一波長表現出輕微的相移,通常在細胞中觀察到的微小的細節,所得到的粒子波(而產生的衍射波和環繞聲之間的幹擾),以及相關的光路長度差。由於環繞和粒子波的振幅幾乎是一樣的,透明的標本完全缺乏對比和疊加對明亮的背景時,幾乎是無形的。

單個波陣麵之間的關係,在明視場和相襯顯微鏡可以使用極坐標係統的矢量描述。在該係統中,矢量的長度表示一個特定的波的振幅,而相對於一個固定的參考(角的相移)的旋轉矢量表示的角度的相位位移的程度(參見圖3(b))。波相互作用相襯顯微鏡引入向量表示由澤尼克弗裏茨,後來又發展了詳細的羅伯特更加光禿。雖然這種描述的援助很少利用的今天,許多文本和研究報告發表在過去幾年依靠向量圖說明了波關係的討論。

在相襯向量圖,說明相位延遲順時針旋轉(參考任意方位),而被描述為逆時針旋轉相位進步。環繞(S)和衍射的矢量和在圖3(b),這在技術上是一個相量圖,D)的波陣麵產生所得到的顆粒(P)的波陣麵。這種機製是方便,因為它有助於衍射波的相移,以及它們是如何影響的階段,由此產生的粒子波(反之亦然)的可視化呈現波關係。在圖3(b)在圖形上的環繞波的衍射波的相對相移為Φ,其中:

Φ=±90°+φ/ 2

在該等式中,φ為環繞(S)和粒子(P)的波矢之間的相對相移(光程差的函數)顯示可以忽略不計的光程差(實際上,無相移)的標本,後者中的u為零和Φ變成±90度。中提出的圖3(b)所示,衍射(D)波具有非常低的幅度小的(或不存在)中的粒子幾乎等於環繞波的振幅波的相移的結果。環繞波和粒子時也有類似的振幅(或強度),有沒有代對比,在明亮的背景和試樣仍然無形。

相差顯微鏡

相差顯微鏡的設計的最重要的基本概念是從檢體,這是投射到不同的位置的物鏡的後側焦點麵(上麵的物鏡後孔衍射平麵)出現的偏析的環繞和衍射波陣麵此外,必須減少環繞(不偏離)光的振幅和相位超前或滯後(四 ​​分之一波長),以最大限度地提高圖像平麵中的檢體和背景之間的強度差異。用於產生相對相位延遲的機製是一個兩步驟的過程中,試樣由四分之一波長的相位滯後與衍射波,而環繞波的前進(或滯後)在相位上的相位板位於或非常靠近物鏡後焦平麵。隻有兩個專門的配件都需要轉換一個明場顯微鏡相襯觀察。一個特別設計的環形光闌的直徑相匹配,這是光學共軛的內部的居住在物鏡的後側焦點麵的相位板,被放置在聚光鏡的前焦麵。

聚光鏡的環形帶(圖1和圖4中示出)通常是透明的圓環,這是位於前焦平麵(光圈)的聚光鏡構成為平坦的黑色不透明的(光吸收)的板材,使試樣能離焦,從環發出的平行光的波陣麵被照亮。在顯微鏡聚光鏡圖像在無窮遠處的環形隔膜,而物鏡上麵的後側焦點麵(其中的共軛的相位板的定位,如下麵所討論)產生一個圖像。應當指出,多文本描述了從聚光鏡的相襯顯微鏡的光錐與黑暗的中心為中空的應急照明。這個概念是用於描述配置,但不是嚴格精確。聚光鏡的環形帶替換,或位於靠近聚光鏡的前孔中的調節可變光闌。當進行相位對比實驗,利用相位環空和孔徑光闌中的聚光鏡,檢查,以確保可變光闌的開度較大比的相位環形帶的外周的。相襯照明和檢測圓形的幾何與微分幹涉對比和霍夫曼調製對比度,使標本的觀察,沒有方向相關文物。相襯也是偏振和雙折射效應不敏感,這是一個重大的優勢時,研究活細胞生長在塑料組織培養容器。

科勒照明的條件下,環繞聲,不與試樣集中的物鏡的後側焦點麵(衍射麵),為亮環的光波。在這些條件下,物鏡的後側焦點麵是共軛到聚光鏡的前麵開口麵,所以非衍射的零階光波形成聚光鏡的環形帶的明亮影像的物鏡(在圖像上疊加的後孔相位板)。通過的球麵波前 ​​的試驗片(的D波)衍射的衍射平麵的不同位置,在整個物鏡後孔。衍射光的分布(數量和位置)的數目,大小,和折射率差的試樣的光散射中的對象。對於大多數樣品中,隻有一小部分的入射光波被衍射,一個大部分光穿過不偏離最終照亮整個圖像平麵。

與此相反,環繞平麵波陣麵中占有的比例較小的物鏡後的光圈值,這對應於聚光鏡的環形帶的共軛。因此,這兩個波陣麵不重疊到一個顯著的程度,並占據物鏡的後側焦點麵上的不同的部分。因為直接的零階光,衍射光的衍射平麵中空間上分開的,兩種波分量的相位(環繞聲,S或衍射,ð)可以有選擇地操縱,而不與其他幹擾。

相位板被安裝的物鏡的後側焦點麵或其附近的(請參閱圖4和5),以便選擇性地改變的相位和振幅的環繞(或不偏離)的標本的光通過。在某些相襯物鏡,薄相位板包含一個減小的厚度,以環繞(S)由四分之一波長的波的相差異推進玻璃蝕刻成環通常情況下,該環也塗有金屬膜的局部吸收60-90%,以減少環繞光振幅。由於後側焦點麵附近的內部透鏡元件,通常位於一些相襯物鏡產生的實際蝕刻成的透鏡的表麵。無論物鏡是如何製造的,最重要的一點要記住的是,每一個相襯物鏡相板,一個特點,就是沒有從所有其他顯微鏡物鏡被修改為包括。

到達圖像平麵的波陣麵之間的幹擾,因為所得到的粒子波產生完全由的環繞和衍射波陣麵的幹擾,產生的顆粒(P)波具有現在的振幅大大小於環繞時,中性密度施加塗層。淨效果是變換將樣品注入引入的振幅(強度)出射的光從圖像平麵的差異的相對相差。因為人眼解釋密度差異,如對比度,試樣在顯微鏡目鏡中可見,在膠片上與傳統的攝像係統,或數字,利用CCD或CMOS的移動設備也可以被捕獲。所有相襯係統選擇性地推進線性環繞(S的相位波前的球麵衍射(D)波前另外,相襯阻礙環繞相對於試樣衍射光波的波陣麵。

在一般情況下,試樣具有更高的折射率比周圍介質的中性灰色的背景上出現暗的,而那些具有比泳​​介質的折射率低的試樣比灰色的背景看起來更亮。然而,這並不是總是如此,因為專門相襯物鏡,具有較高的耦合,以較低的延遲值(八分之一波長或更小)的中性密度可以製作較厚的標本對比度反轉。最終的結果是,具有很高的光程差的地區開始出現明亮。

為了修改的空間上分離的環繞聲和衍射相位對比光學係統的波陣麵的相位和振幅,相位板配置了一些已被引入。由於相板位於或非常接近的物鏡的後側焦點麵(衍射麵)通過顯微鏡的所有光通過該組件必須穿過。聚焦聚光鏡的環形帶的相位板的部分被稱為共軛區域,而其餘區域被統稱為互補區域的共軛區域包含的材料負責改變環繞(未衍射)光無論是加或減90度的衍射波前的相位。在一般情況下,相板共軛區域寬比聚光鏡的環形帶的圖像,以盡量減少環繞光的量,進入的互補區域擴大的區域中(約25%)。

一個典型的係列相襯物鏡,有越來越多的放大倍率,及其相應的聚光鏡年輪,如圖5所示。作為一般規則,當物鏡的數值孔徑,倍率增大時的相位板的寬度和直徑都下降。與此相反,聚光鏡的環尺寸的增大物鏡放大倍率。此外,圖5中所示剖切表示正和負的相位板的施工背後的基本概念。正相位板產生暗的對比度而包含部分吸收膜的設計,以減少環繞波陣麵的振幅。此外,該板包含設計轉向90度(延緩)的衍射光的相位相阻燃材料。負相位板還包含兩個相阻燃,部分吸收材料。然而,在這種情況下,兩種材料被夾內未衍射環繞的波前的相位板,使影響(衰減和相位滯後90度)是唯一的物種。

從現代顯微鏡製造商提供的相差板是通過真空沉積在玻璃板上或直接到一個顯微鏡物鏡的透鏡內表麵的薄的介電和金屬膜。電介質薄膜中的作用是把光的相位,而金屬膜未衍射的光強度衰減。一些製造商利用多個抗反射塗層與薄膜結合,以減少眩光量和光學係統的雜散光反射回。如果相位板的透鏡的表麵上未形成的,它通常是凝成位於附近的物鏡的後側焦點麵之間的連續鏡頭。的厚度和折射率的電介質,金屬,和防反射膜以及水泥的光學,仔細選擇,以產生所需的相移的相位板之間的互補性和共軛的區域。在光學術語,改變環繞的光的相位相對於衍射光的相位板90度(或正或負)被稱為四分之一波長板,因為它們的光程差的影響。

對比度是通過改變相位板的屬性,包括金屬膜(防反射塗層),相阻燃材料的折射率,和的相位板的厚度的吸收調製。幾個顯微鏡製造商提供的各種相襯物鏡有進步程度的對比。例如,尼康陣容包括五種類型的相襯物鏡。DL暗低)係列物鏡一個淺灰色的背景上產生暗的圖像輪廓。這些物鏡是設計,提交陽性對照標本折射率從周圍介質中,例如組織培養細胞具有顯著差異。對比版本略低的物鏡,的DLL暗低),產生更好的圖像明照明做的DL物鏡相比,被用作一個普遍的物鏡進行聯合觀測熒光,明,暗場,微分幹涉對比。

尼康也產生包含一個輔助的中性密度環,設計,減少暈工件,任一側上的中心相環切趾相襯物鏡。標本具有非常小的相差是尼康的DM)正相襯物鏡,一個中型的灰色背景上產生一個黑暗的圖像輪廓成像的理想人選對於負相位對比,尼康提供的BM明亮的中等)的物鏡,這是特別適合於視覺檢驗,細菌鞭毛,原生動物,血纖維蛋白纖維,分鍾球,和血細胞。明亮的介質相襯物鏡上產生明亮的圖像中灰色背景。

在大多數情況下,僅僅推進單獨環繞的波前的相對相位是不足以導致在顯微鏡的產生高對比度的圖像。會出現這種情況,因為環繞波的振幅顯著大於衍射波,並抑製所產生的圖像創建的幹擾,隻有一小部分的總的波數。通過應用一個半透明金屬(中性,不透明度增加,以減少環繞的波陣麵的振幅值接近(和執行在圖像平麵上的幹擾)的衍射波,在物鏡的相位板密度)塗層。環繞光波,通過在相襯顯微鏡的設計幾乎完全通過相差板,在幅度上顯著地降低到一個值,該值取值範圍的原始強度的10%和30%之間的不透明的相位板。

在圖6中的相位板的配置,波的關係,圖和矢量圖的生成相關聯的正麵和負麵的相襯圖像。此外,也說明了這些技術的標本成像的例子。正如前麵所討論的,剛剛從試樣平麵的衍射光的球麵波前 ​​平麵環繞(未衍射)的波陣麵的相位相對於四分之一波長延遲。在正相位對比光學配置(在圖6中的上排圖像),環繞聲(S)的波陣麵的相位超前遍曆的相位板產生的淨相移180度(半個波長時,由四分之一波長)。先進的環繞的波陣麵是現在能夠參與在與上麵的中間圖像平麵的衍射D相消幹涉

正相襯的概述在圖6的上部。正相襯板(圖6的左手側)推進環繞波的玻璃板中,減少了由波的物理路徑,通過在高折射率板的蝕刻環由於四分之一波長。由於試樣射線衍射(ð波)延遲四分之一波長與試樣進行交互時,環繞波和衍射波的相位板出現時之間的光程差是半波長。最終的結果是一個180度的環繞波和衍射波,從而導致破壞性的幹擾,在圖像平麵上的高折射率試樣之間的光程差。正相襯的破壞性幹擾波的振幅譜中描繪了圖6中上部的曲線中。所得到的顆粒(P的振幅波低於環繞(S)波,使對象出現的相對比背景暗的,在最右邊(POS的的圖像Zygnema綠藻所示示出的矢量圖提高環繞聲波的四分之一波長,這是作為一個90度逆時針旋轉在正相位對比所示,該圖並在圖6中的圖像之間的顯示。

它也有可能產生負相襯顯微鏡的光學係統,在圖6的下部所示。在這種情況下,環繞聲(S)波延遲(而不是作為先進的)由四分之一波長相的衍射D)。其結果是,具有高折射率的標本對較暗的灰色背景顯得明亮(查看該圖像標記在圖6的下部,NEG)。在負相位對比,物鏡相位板包含提升的環環繞波的四分之一波長相對的衍射波的相位延遲的相位的零級(而不是正相襯提前相位)。由於衍射波已經被延遲四分之一波長時,通過試樣,環繞波和衍射波之間的光程差被消除,並且在圖像平麵上的高折射率試樣發生相長幹涉。請注意,生成的顆粒(P)波的幅度高於負相襯環繞(S)波(參見圖6中的下麵的圖)。圖中還示出的向量圖,為負相位對比,,環繞波矢經過一個90度的順時針方向旋轉。

重要的是要注意,上麵的物鏡的後側焦點麵所形成的衍射圖案偏離和相襯和所有其他形式的光學顯微鏡中的試樣散射的所有空間頻率的傅裏葉變換。因此,在中間像平麵和通過目鏡觀察到最終的圖像(或記錄,可通過檢測器)產生的圖像表示傅立葉逆變換的衍射圖案形成在物鏡後側焦點麵和眼點(浮在上麵的目鏡前鏡頭)。相襯顯微鏡利用這些光學共軛性質的增強圖像的對比度,通過修改顯微鏡的光圈功能引入的特定圖像信息的空間過濾介紹的相位板(過濾器)的物鏡後部衍射平麵使試樣的相位變化轉換為強度變化,可以觀察到在最終圖像中。

解讀相位對比圖像

用相差顯微鏡產生的圖像是比較簡單的解釋,當試樣很薄,並且均勻地分布在基片上(作為單層組織培養中生長的活細胞中的情況下)。檢查使用正相的光學對比度,這是傳統的形式,大多數製造商所生產的薄樣品時,它們會出現暗於周圍介質中,當試樣的折射率超過介質。差分相位對比光學邊緣附近的周邊擴展的標本,如蜂窩之間的邊界膜和洗澡的營養培養基中,增強對比度和產生整體高對比度的圖像,可以粗略地解釋為密度圖。因為相襯的標本圖像的振幅和強度相關的折射率和光路長度,圖象密度可利用作為衡量各種結構之間的關係進行近似。效果,具有密度增加了一係列的內部細胞器,如空泡,間期細胞核,細胞質和細胞核(或有絲分裂的染色體),通常是可視化逐漸變暗相對於一個固定的參考對象,如背景。還應當指出的是,眾多的光學構件是存在於所有的相襯圖像,大擴展標本往往會出現顯著的波動,在對比度和圖像強度。對稱也可以決定如何大型和小型的標本出現在相襯顯微鏡的一個重要因素。

理智的解釋相襯圖像需要仔細推敲和檢查,以確保工件不錯誤地分配到重要的結構特征。例如,內部的一些細胞器和組件通常具有較低的折射率比周圍的細胞質中,而另一些具有較高的折射率。因為這些眾多的細胞內結構呈現不同的折射率,內部的活細胞,在積極相襯顯微鏡觀看時,可以揭示一個數組的強度,範圍從非常明亮的極暗。例如,吞飲小泡,脂滴,和空中液泡存在於植物和單細胞原生動物比細胞質具有低的折射率,因此顯得比其他元件更明亮。相反,如上麵所討論的,具有高折射率的細胞器(細胞核,核糖體,線粒體,核仁)出現在顯微鏡暗。如果試樣引入的相位延遲足夠大(約半波長的衍射波的相移)的衍射波和環繞波之間的幹擾變得建設性的,使這些標本的亮度比周圍的背景。

為了避免混亂,相襯圖像的亮區和暗的對比,光程差內發生的試樣製備應慎重考慮。如上所討論的,光程差是來自於商品的折射率和檢體(對象)的厚度,和相關的檢體之間的相對相移和背景(衍射和環繞)波。這是不可能區分高,低折射率部件,沒有相關的信息的組件的相對厚度在相襯圖像。例如,一個小的檢體具有高的折射率,可以顯示更大範圍內的試樣具有較低的折射率相同的光學路徑差。的兩個試件,將具有大致相同的強度時,通過相位對比光學係統。在許多生物實驗,產生收縮或膨脹的細胞或細胞器的條件,可能會導致顯著的對比度變化。外部介質也可以被替換為另一個具有較高或較低的折射率,在試樣圖像的對比度的變化來產生。事實上,在周圍介質的折射率變化形成的圖像的對比度的效果的基礎上的技術被稱為浸沒折光率

圖7中幾個半透明的標本有正麵和負麵的階段對比度光學係統成像。圖7(a)和7(b)示出一個櫛魚鱗,在正相位對比(圖7(a))和負相位對比(圖7的(b)),在相對 ​​較高的倍率(200倍)。這些尺度通常發現在大多數的硬骨魚類(簡稱為硬骨魚類)。前(或前麵)的一部分,每一個規模通常藏後麵的後部,前述的規模。隨著魚的生長,這樣做的尺度,導致圖案的同心生長“環”規模大小的數量增加,出現類似樹幹的橫截麵中發現的那些。在某些情況下,櫛鱗生長型態用於判斷魚的年齡。年輪出現黑暗包圍的淺灰色暈地區正相襯(圖7(a)),但呈現輕得多,四周暗槽與負相襯(圖7(b))。

甲文化活的中國倉鼠卵巢細胞在明照明模式下顯示為透明的時沐浴在生長培養基中,細胞的折射率,這是非常接近的營養鹽緩衝液。正相襯(圖7(C)),細胞內部的細節,包括細胞核和細胞器,可以很容易地可視化。然而,當負相襯照明下檢查,細胞輪廓變得難以分辨,內部細節很大程度上掩蓋除高折射率變得非常明亮的細胞器(圖7(D))。最後,人類紅細胞出現暗灰色的扁橢球一個的甜甜圈輪廓和明亮的中心正相襯(圖7(E)),但相同的細胞是光明與黑暗的中心(圖7(f)條),並脫穎而出大幅在負相襯的背景。

兩個非常常見的效果相襯圖像的特征關閉陰影對比度型態中,所觀察到的強度不直接對應於檢體和周圍介質之間的光程差(折射率和厚度值)。雖然這些模式的出現的相位對比光學係統的自然結果,它們通常被稱為相位工件或圖像失真。在各種形式的正相襯,明亮的階段暈通常環繞大型標本的功能和媒體之間的界限。出現相同的光暈比負相襯光學係統試樣的暗。這些效果是由光程差的波動,可以把黑暗中明亮的光暈正相襯,負相襯亮暗暈進一步加劇。

暈圈出現在相襯顯微鏡,因為圓形的相阻燃(中性密度)環位於在物鏡相位板也從試樣的衍射光(它並非隻限於單獨通過環繞波)發送一個小的程度。的事實,使問題更為複雜的零級的環繞波陣麵的相位板投射到聚光鏡的環形帶的寬度小於相板環的實際寬度。的差異的相位板環和環繞的波陣麵之間的寬度通常是大約25%到40%,但是必要的,由於光學設計上的限製和要求的。由於在物鏡的衍射麵,隻有那些對應的低空間頻率衍射的相位板的環形試樣通過的波陣麵的相位改變環的圓形的空間位置。因此,衍射標本的波通過相板保持90度(四分之一波長)的零階(不偏離或環繞)光相。由此產生的相襯鹵代工件由於衍射試樣通過一個非常淺的角度相對於環繞的零級波前的低空間頻率信息的衰減。實際上,低空間頻率的波陣麵的衍射試樣之間的破壞性幹涉的情況下不偏離的光波產生一個試樣周圍的局部對比度反轉(表現由鹵素)。為了創建一個鋒利的邊緣圖像中,所有的空間頻率衍射試樣必須在最終圖像中表示。

 

相襯光環圍繞著一個大型,低空間頻率的物體,如細胞核,矽藻,整個細胞中表現得尤為突出和明顯的。鹵代工件的另一個因素是在圖像平麵上的光能量的再分配,從區域是破壞性的區域建設性。大的,高對比度的光暈產生混亂的圖像產生大的光程差,如紅細胞,黴菌,酵母,原生動物細胞,細菌的樣品。另一方麵,鹵素效果往往可以強調對比度的差異的試樣和其周圍的背景,並可以增加薄的邊的可見性和邊界的細節在許多標本。這種效果是特別有用的在負的相位相反,其產生的暗暈周圍的低頻圖像的細節。在許多情況下,能夠減少相移的程度和衍射,從而減少暈圈的大小試樣周圍。用於除去或衰減強度的暈的最簡單的補救辦法是修改的觀察介質的折射率具有更高折射率的組件,如甘油,甘露糖醇,葡聚糖,或血清白蛋白。在某些情況下,改變折射率的介質,甚至可以產生逆轉圖像對比度,轉向暗標本的功能亮點不顯著令人不安的背景強度。

光環效應,也可以顯著降低,利用專門設計的階段物鏡,包含中性密度材料圍繞中央相環材料的物鏡後孔附近的一個小環。這些物鏡被稱為切趾相襯物鏡,使結構的階段具有很大的相差異,具有出色的清晰度和細節的定義來看待和拍攝對象。在大多數情況下,可以清楚地分辨細胞內的功能(如核仁)具有明暗反差變跡的物鏡,但這些相同的功能,有明亮的光暈或為亮點,使用傳統的光學相襯成像。與變跡的光學係統,對比度是相反的,由於相對於試樣的直接光通過的大振幅的繞射光。

在實踐中,鹵代減少和增加與變跡光學係統的標本的對比,可以實現通過利用選擇性振幅相鄰建立到物鏡的相位板上麵的後側焦點麵上的相位膜的過濾器。這些振幅濾波器包括中性密度施加到周圍的相位膜的相位板的薄膜。在經典的相位板的透射率的相移環是約25%,而對周圍的相鄰環的相移圈中的切趾板有50%的透射率的中性密度。在這兩個板的相位膜的寬度是相同的。這些值是一致的相移的透射率值的薄膜適用於標準板在相襯顯微鏡。

關閉陰影相襯顯微鏡的光學神器是另一種非常常見的,往往是最容易觀察到大型,擴展階段標本。它通常會被預期會出現一個大的形象相試樣具有恒定的光路長度橫跨直徑均勻或深或淺,在顯微鏡。不幸的是,用相襯顯微鏡所產生的圖像的強度並不總是承受一個簡單的線性關係,由試樣產生的光程差。其他因素,如吸收的相位板和相位延遲或提高量,以及相對的相位板和聚光鏡的環形帶的重疊大小也發揮了關鍵作用。大,厚度均勻的正位相對比試樣的強度分布往往從邊緣逐漸增加光的強度在中部地區的中心,在那裏可以接近周圍介質(相反的是真正的負相標本)。這種效應被稱為陰影關閉,並經常觀察研究擴展平麵的標本,如材料板材(玻璃或雲母),副本,扁平的組織培養細胞和大細胞器時。

正麵和負麵的相襯的鹵素和濃淡銷工件的影響列於圖8為一個假設的擴展的相位檢體具有矩形幾何形狀和較高的折射率比周圍介質中(圖8(a))。記錄整個試樣的中央區域上的光強分布圖8(b)中示出。正相襯(圖8(C)),標本圖像呈現出獨特的耀眼光環,並演示了一個戲劇性的樹蔭效果,這是遍曆時表現逐步增加強度試樣從邊緣到中部地區(見強度分布在圖8(d)段)。的光環和陰影關閉效果已經扭轉負相襯(圖8(e)及8(f)條)的強度。一個黑暗的光環圍繞著標本圖像查看時負相襯光學(圖8(E)),和樹蔭過渡範圍從明亮邊緣的中心暗灰色的水平。此外,在強度分布圖(圖8(f)條)是相反的,從與正相位對比觀察。

樹蔭下脫落的現象也通常被稱為區域行動的效果,在試樣厚度均勻,因為中央區衍射光不同於高折射率區邊緣和界限。在中央區域的一個標本的相對角度和衍射光的量顯著減少時相比,邊緣。源於中央的試樣區域的衍射波陣麵,因為隻有輕微的空間偏離的零級非偏離的的環繞波陣麵(但仍然是由四分之一波長的相位滯後),它們被捕獲的物鏡後方的相位板焦平麵,以及與環繞光。其結果是,試樣的中心區域的強度基本上保持相同的背景。外觀遮蔭的影響在相對 ​​平坦的標本地區,邊緣和界限產生過高的對比度,提供了強有力的證據表明相襯機製主要是受合並衍射和散射現象。

光環和陰影銷文物依賴於幾何和光學特性的相板和被檢查的標本。的寬度和相位板的透射率的材料特別是,在控製這些效果(相差板的寬度通常是十分之一左右的總開口麵積的物鏡)發揮了關鍵作用。更廣泛的相位板具有降低透光率,往往會產生較高的強度光暈和樹蔭,而環的直徑有一個較小的影響,這些影響。相對於一個特定的物鏡(或正或負)的光程差和試樣的大小,形狀和結構有顯著影響的嚴重程度的鹵素和陰影的影響。此外,這些影響是嚴重影響物鏡,放大倍率較低,產生更好的圖像。

結論

相襯是一個極好的方法用於增強薄的,透明的標本對比度而不損失分辨率,並已被證明是一個有價值的工具的研究在活細胞中的動態事件。此前引進相對比度光學係統,電池和其他半透明的標本進行呈現在明顯微鏡可見的由人工染色技術。雖然這些標本可以被觀察和記錄與暗場和斜照明,或散焦明場顯微鏡,這種方法已被證明是不可靠的細胞結構和功能提供關鍵信息。

相襯的技術被廣泛應用於生物和醫學研究,尤其是在整個領域的細胞學和組織學。因此,該方法被用來研究活細胞,組織,並在光照下是透明的微生物。相襯使內部的細胞成分,如膜,細胞核,線粒體,主軸,有絲分裂器,染色體,高爾基體,和來自植物和動物的細胞和組織容易地可視化的胞質顆粒。此外,相襯顯微鏡被廣泛采用在診斷腫瘤細胞的生長,動力學,和行為的各種各樣的活細胞培養。專業長工作距離相襯光學係統已經開發倒置顯微鏡組織文化調查。相襯觀察的好處是血液學,病毒學,細菌學,寄生蟲學,古生物學,海洋生物學在生物領域的其他地區。

相襯的工業和化學應用包括礦物學,結晶學,聚合物形態調查。無色微晶粉末,顆粒狀固體,結晶性聚合物,具有隻有輕微的環繞浸沒液體的折射率不同,往往容易被使用相差顯微鏡觀察。事實上,定量折光率往往利用取得的折射率值,用於識別物鏡。相位對比光學技術審議的其他的商業產品包括粘土,油脂,油,肥皂,塗料,顏料,食品,藥品,紡織品,纖維和其他纖維。

入射光相襯顯微鏡,雖然在很大程度上取代了微分幹涉對比技術,用於檢查的表麵,包括集成電路,晶體位錯,缺陷和光刻。一個很好的例子是在矽外延片,半導體產業有巨大的意義堆垛層錯。在反射光中的相襯係統中的照明的環形帶,一個圖像被投射到的物鏡,其中的相位板通常位於後側焦點麵。此外,該相位板的位置不在物鏡之內,但由一個輔助的透鏡係統,以避免所產生的相位板的反射和散射而形成的後焦平麵的圖像。應當指出,在反射光的相差顯微鏡,相差從救濟產生的試樣表麵上,而不是試樣內的相梯度。

減少的光環和陰影關閉文物仍然是一個主要關注相襯顯微鏡。變跡相位板是用於減少嚴重暈,和專門的可變相位對比係統,可以微調,以控製這些影響,以優化圖像質量和技術所獲得的信息的保真度。發展先進的相襯係統提供精確的測量相標本具有大光路的差異,以及與其他的對比度增強技術的結合觀測也有相當大的興趣。特別相襯往往利用熒光成像,熒光團確定的位置,並有望增強對比度,在光學顯微鏡。



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