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徠卡顯微鏡,細胞培養和激光顯微切割

2013-11-01  發布者:admin 

許多目前正在作出的發現,在細胞分裂和分化,單個細胞和細胞器之間的關係,與藥用物質的細胞的治療,等不會有可能沒有活的細胞培養物。允許單細胞的形態學和生化觀測不同實驗條件下,他們提供了一個獨特的信息來源。細胞培養所麵臨的挑戰是想象他們使用合適的對比度不殺死細胞的技術。

 

激光顯微切割活細胞培養中的應用

激光顯微切割提供了廣泛的細胞培養操作和選擇選項,不僅是單個活細胞,但也是整個文化同質小學文化作進一步處理或種植隔離。

可以很容易地使用各種活細胞切割(LCC)模塊,為進一步培育或如PCR分子生物學分析解剖選定的區域或不同的克隆細胞培養顯微單細胞或細胞聚集要保證所需的無菌細胞和完好狀況,他們往往已經培養在特殊培養皿或標本幻燈片與特殊井為細胞培養。這些元件放置在專門設計的持有人在樣品載物台,並與激光顯微切割技術進行觀察,操縱和解剖。傳統的培養皿中,培養皿PEN膜之間是有區別的。後者特別適合於現場的小區扇區使用LCC。激光顯微切割後,解剖細胞下降,例如,可以在孵化器96井機架上,從而有機質為8條。

激光顯微切割的各種試樣和集電極持有人的可能用途和組合在下麵的章節中描述。

 1:的人力forescin成纖維細胞感染人類巨細胞病毒,巨細胞病毒-GFP融合蛋白(禮貌:瑪格麗特Digel UKT蒂賓根大學醫學病毒學研究所基督教Sinzger博士,德國)。

Sinzger博士,德國)。

1A:顯微切割前, 
1B:顯微切割後, 
1C:顯微成纖維細胞的檢查, 
1D:4天之後在培養
 

激光顯微切割標本和收藏家持有人的可能組合

下麵的標本和集熱設備都可以使用,結合LCC模式:PEN膜,可堆疊膜環和Ibidi幻燈片的培養皿。這3個試樣的載流子可以用於激光顯微切割和選擇,也適合作為收集裝置。8孔條和陪替氏培養皿(無PEN膜)也可以被用作收集裝置,但不能用於激光顯微切割。但是,生活沒有PEN膜細胞培養和單個活細胞在培養皿中,可以用激光操縱,並觀看了時間較長的使用時間推移電影功能。

特別是,所有標本設備適合用於細胞培養的組合習慣采集設備(0.5毫升管,0.2毫升管,8條,片上實驗室(LOC),Ibidi幻燈片和培養皿)。

培養皿與PEN膜
細胞在培養皿中培養PEN膜可以在LCC模式解剖,並轉移到其他的皮氏培養皿(帶或不帶PEN膜)。同樣,從陪替氏培養皿的dissectates可以直接收集在一個芯片上在所謂的Ibidi的幻燈片進一步培育或0.5 ml微量離心管,0.2 ml微量離心管,8孔條紋上限,或實驗室的 8孔條(LOC)分子生物學下遊分析。

可堆疊
可堆疊膜膜環環提供相同的培養皿PEN膜的可能性。此外,它們可以相互下麵層疊激光顯微切割捕獲隔離材料在鎮定劑環直接從上麵。

Ibidi滑動
標本幻燈片Ibidi幻燈片特殊井,像上麵,組合試樣夾具適用於LCC模式以及與下遊分析的習慣采集設備(0.5毫升管,0.2毫升管的整個範圍的,8條實驗室在一個芯片上(LOC))。此外,一個Ibidi堆棧是一個優雅的,汙染的自由選擇方法:,如果解剖標本持有人從這種堆疊的細胞,dissectates自然垂下下麵進入下一個幻燈片,這是在一個特殊的堆疊支架,恢複耕種舉行。

 2:Ibidi的幻燈片和LCC 8孔條紋。可用於單個幻燈片(左上角),或作為Ibidi滑動堆棧(右上角)的激光顯微切割ibidi幻燈片。對於高吞吐量的應用程序為8-條紋(左下方)和Ibidi幻燈片的(右下)的收集裝置可以結合對活體細胞的試樣夾持器。
 
 

激光顯微切割後的在培養

顯微切割後,傳遞給細胞的收集裝置,並可以在新鮮的營養培養基中有機質的。堆疊膜環並不需要一個專門收集持有人。這些和Ibidi幻燈片可以簡單地疊放在對方允許的汙染顯微切割過程。然而,在一個合適的蓋(ibidi幻燈片)或可選的氣候室的激光顯微切割係統相結合,無汙染的選擇過程中得到了保證。可堆疊的膜的環和Ibidi的幻燈片的另一個優點是,當一個單元被解剖,沒有單獨收集需要支架。

此外,所有的習慣收集設備,如離心帽或在一個芯片上的實驗室(LOC),可用於分子生物學分析和PCR,例如,沒有任何進一步的製劑。

 3:氣候室徠卡LMD係統。徠卡LMD係統可以交付與氣候暖空氣孵化室(圖左,應用實例權)。
 
 

實際使用中的活細胞激光顯微切割(LMD)

在基礎研究的目標之一是要找到一種新的抗癌藥物的想法。這在下麵的例子進行了說明。

在實驗中,培養腫瘤細胞在原代培養物的形式,並分裂之前達到匯合。部分細胞有機質的進一步的實驗,以獲得足夠的細胞的物質,而其他的PEN膜施加到陪替氏培養皿。

對於進一步的步驟,在陪替氏培養皿中的營養培養基中首先已被刪除,直到隻有一個薄膜仍然存在。由於使用PEN膜的陪替氏培養皿,在現有的培養的單細胞可以很容易地選擇所LMD LCC模式轉移到8孔條。現在有一個單個腫瘤細胞的各孔中  

可以重複該過程,直到集合中的每個孔中的移動設備包含單個單元格再次,在這種情況下,形成一種新的文化的基礎解剖後。因此,一個以及各培養的細胞應含有相同的DNA,因為它們源於一個相同的分離的原始細胞,細胞可以用於PCR分析的突變檢測裂解和轉發。因此,結果是總是溯源到一個單細胞dissectate。

 4:激光顯微切割和活細胞培養(LCC)。實驗培養細胞的激光顯微切割(LMD)的利益。A)顯示常規培養過程和拆分單元格(在這個例子中,文化與異質細胞腫瘤):匯合增長後細胞是splittet和的重新培養為進一步培育成平常的培養皿中,並進入PEN膜作進一步處理的培養皿LMD。B)的線路輸出端,例如,特定的細胞提取到8條紋井在不同條件下或不同細胞的各孔中,使細胞生長的調查。C)再次用以耕作細胞選擇性地選擇克隆LMD:單個腫瘤細胞(綠鬆石)剪成不受影響細胞(灰色),同時一個幻燈片Ibidi進一步培育井留在培養皿中。可以用作一個堆棧(“三明治”)的激光顯微切割分離克隆的細胞多的並行分析,如用不同的毒素處理分為以下幾種不同井的Ibidi幻燈片ibidi幻燈片。

 

除此之外,可以進一步細胞原代培養定期轉移到培養皿與PEN膜分裂。LMD可用於解剖在恢複耕種在另一個陪替氏培養皿與PEN膜的陪替氏培養皿中的這些腫瘤細胞的新的單細胞。同樣,相同的原始細胞的單細胞可以分離出在LCC模式下,通過PCR分析和上麵所描述傳送到平行Ibidi幻燈片中。毒素可被添加到這些比較健康細胞的細胞生長(圖2),以分析其對腫瘤細胞生長的影響。

關於一種新的抗癌藥物的發展,可以在不同的毒素具有相同的DNA為同一來源的細胞,以檢查特定的毒素的反應的細胞。它也可以觀察到細胞的基因組中(基因和蛋白的表達,如果需要的話),通過分子生物學技術。

另一種可能性是治療不同的單細胞與同一腫瘤的不同的DNA具有相同的毒素。然後,可以檢測和比較的各單電池的反應所施加的毒素。

,而不是常規的計數室的許多細胞或手動選擇,自動視覺控製(AVC)程序可以被使用,其中確定並選擇一個自動的基礎上的激光顯微切割的細胞。樣品,並因此節省大量的時間,這意味著大的吞吐量。AVC模塊是一個特別可行的替代手工采集的單個細胞在蛋白質研究中。AVC程序也能夠捕捉到並選擇熒光細胞。對於成功的外源DNA轉染到真核細胞中,熒光標記物可以被耦合到導入的載體作為對照。例如,綠色熒光蛋白滲透的方式從一個向量;成功後,浸潤和進一步培養含有GFP蛋白的熒光標記的細胞,並可以很容易地計算和解剖。

 5:肺上皮細胞培養。

5A:顯微切割前 
5B:在顯微切割 
5C:顯微切割後
 

細胞培養研究中

正越來越多地用於醫學研究,在製藥和化妝品工業和生物技術和環境分析以及細胞培養。一個主要應用是在基礎研究方麵的新陳代謝,分裂和其他細胞過程的研究。它們也可用於測試係統,例如,用於信號轉導和細胞毒活性的物質以供檢查的療效。

簡單的蛋白可以很容易地在細菌中產生的,而更複雜的蛋白質隻能產生與細胞培養物,使合適的蛋白質糖基化和複雜的連接,通過二硫鍵發生。

活細胞製造各種生化製品,如單克隆抗體的研究和治療在醫學中應用也起到了顯著作用。幾個單克隆抗體的許多可能的用途是治療急性和慢性白血病,非霍奇金淋巴瘤的無線電免疫療法治療類風濕關節炎的。某些疫苗(例如預防流感),也可以從細胞培養物生產。和促紅細胞生成素,應用作為造血治療在患有乳腺癌的連接,例如,從細胞培養物中獲得。

幾乎所有類型的細胞,可以產生從幹細胞的培養。一個熟悉的做法是使用造血幹細胞在白血病研究和治療。成體幹細胞,也可以用於組織工程。

在診斷中,潛在的病原微生物被施加到文化和分析增殖後發生。

在植物研究中,完整的植物可以產生的未分化的分生細胞。例如,擬南芥可以是大量生產的在體外進行測試,對鹽脅迫性,耐水性等

所謂生物反應器特別是在業內被發現與活細胞 - 一個典型的應用是現代胰島素的生產。骨髓間充質幹細胞可用於不同類型的組織的再生,因為它們可以在不同的體細胞,如軟骨,骨或肌肉分化。要取得在特定的細胞類型的分化,組織特異性的生物反應器的使用,例如,開發用於在體外檢驗惡性腫瘤血管的皮膚等同物。類似的實驗,具有標準化的人類細胞的物質是作為日後動物實驗的替代方法的或完全替換它們。

上麵的例子,但是,隻顯示一個巨大的範圍的可能性,並在活細胞研究和發展的機會的一小部分。

細胞培養的是什麽?

一種細胞培養是在受控條件下在營養培養基中的有機體(在體外以外的動物或植物細胞的培養小學和永生細胞培養之間是有區別的。一個主要的文化是一種非永生化細胞培養直接從組織樣品。永生化的細胞培養,另一方麵,其特征在於由它的無限的容量用於除法。這可能需要通過隨機突變,如在腫瘤細胞中,或故意遺傳的變化,如引進一個專門的質粒載體。這樣的細胞可以在體外腫瘤或惡性轉化的顯示特征

基本上可從各種組織(如肝,皮膚,腎,腦細胞,等),單細胞。這是通過用蛋白酶如胰蛋白酶,保持細胞的蛋白質,分解。以這種方式分離的細胞,然後培養和乘以陪替氏培養皿多個除法可以選擇性地在某些類型的細胞中,通過添加生長因子刺激。

 6:PEN膜的培養皿中。活細胞應用標準培養皿中,培養皿PEN膜可用於收集dissectate(左)。此外,PEN膜的培養皿可用於活細胞(右)解剖標本架。
 
 

養殖

不同於細菌,動物細胞/原代培養能夠生存在懸浮液中,並為他們的成長需要一個合適的粘結麵。因此,能夠區分從非貼壁細胞懸浮培養的貼壁細胞培養物(如成纖維細胞,上皮細胞,內皮細胞和軟骨細胞的表麵上生長的),其中的細胞增殖,因為它們在營養培養基中自由遊動,例如為淋巴細胞。

在合適的培養基中,細胞分裂形成一個所謂的細胞草坪。當貼壁細胞密度達到最大可能的在他們的安排,AG亚游集团講的匯合處。這觸發了接觸抑製,停止細胞分裂和文化變得靜止。通常隻劃分脊椎動物細胞凋亡前的30到50倍。有時是自發的,但通常實驗誘導的措施,如引入一個特殊的質粒作為載體誘導細胞永生化。一個主要的文化,從而成為永久的細胞係,這是受到無限的分裂速度,但其原有的細胞有許多特點。

惡性細胞轉化通常缺乏接觸抑製的現象,提出自己不朽的文化和尚存在懸浮液。因為他們有腫瘤細胞的特性,可誘發腫瘤的形成,通過注射進入一個有機體/實驗動物。

增殖

營養介質必須是這樣的,以確保乘以以及執行的典型功能的細胞,細胞的生長,增殖和分化。的最佳組合物取決於特定的細胞類型。化學上確定的培養基通常是優選的,典型的基礎培養基中含有氨基酸,維生素,無機鹽和緩衝液的混合物,額外的生長和分化因子,可以被替換胎牛血清,除了。

培養的細胞隻能存活在合適的媒體。必須進行監測的pH值,一般是通過在營養培養基中的顯色指示劑。正常的細胞增殖,5%CO 2的氣氛中以37℃的溫度下發生,作為緩衝介質,在特殊的孵化器。成倍後,細胞可以從他們的陪替氏培養皿的表麵除去,通過化學(如胰蛋白酶)或機械(例如,幻燈片)細胞培養在合適的稀釋。貼壁的細胞進行傳代培養,即轉移到一個新的營養培養基中,發生匯合之前。在這種方式中,小學文化,可以保持相對長時間活著。

可視化細胞培養的方法

光鏡觀察生活材料仍然是一個特權。盡管他們的高解析度證明不適合現代高科技儀器,如掃描電子顯微鏡。

然而,活細胞是由透明的視覺光譜性質,因此在對比極其惡劣。在一個常規的光顯微鏡下,幾乎是“透明的”,難以識別圖像中產生所謂的明視場模式下。獲得所需的對比度雖然有許多標本染色產品,通常殺死細胞培養製備和染色過程。

活細胞可以成像與相位對比技術,雖然在較厚的部分的檢體造成問題的串擾和扭曲。微分幹涉對比方法(DIC)是成像細胞培養和活細胞的另一種方法。集成調製對比度(IMC)技術也被證明可用於檢查未染色,低對比度的樣本。觀察活細胞的另一種方法是對其進行標記,用熒光蛋白。這些可以被基因導入細菌為動物或植物細胞。該方法可用於標記單個活細胞,細胞聚集體,器官或整個動物。蛋白質的生物合成,以及運輸,分泌和降解過程可以直接在生物體中使用的熒光觀察和分析。熒光蛋白存在於許多不同的形式,用不同的熒光光譜,例如

  • GFP(綠色熒光蛋白)
  • 藍色熒光蛋白(BFP),
  • 青色熒光蛋白(CFP),
  • YFP(黃色熒光蛋白)。

熒光素和熒光珊瑚蛋白也正在越來越多地用於顯微鏡。GFP是常規應用,標記蛋白質在活細胞中,並檢查他們的行為在原地

題外話:熒光/ GFP

短波輻射暴露時,一些物質發光。在熒光技術,這是利用非自體熒光的利益結構與相應的熒光蛋白如GFP標記。GFP是一個發光的水母(Aequorea victoria的修飾蛋白當藍光或紫外光激發時,它會發出一個密集的淺綠色的顏色。

當通過基因工程技術導入細胞,熒光蛋白的分布,解剖學和發展的目標單元格的形式給分析上市。因為他們沒有毒性作用,它們非常適合探索活細胞。細胞既不損壞或破壞,所以條件是理想的活的生物體體內試驗,原位和實時。

如何進入細胞的遺傳信息得到?

這個問題的答案是,特種運輸質粒引入到目標生物體作為載體。的熒光蛋白質通常是耦合於這些。

向量的工作方式不同:

克隆和表達載體留在目標生物,即使在完成運輸任務。無法建立自己在這些自殺載體,可以被引入到許多主機。由於他們的transposomes(所謂的跳躍基因)的自殺載體管理滲透到靶標生物的染色體或質粒,以與它們耦合的GFP。自殺載體的其餘部分都將丟失。

細胞周期阻滯與FUCCI技術

也可以結合使用激光顯微切割技術在未來的另一項技術是FUCCI(Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator method)。

在該方法中,細胞係是專門處理,以改變它們的熒光,根據他們的細胞周期的狀態。蛋白質組學研究可以在原地進行,在體內,在細胞周期的實時捕捉到發展階段的不同的細胞蛋白表達和解剖所需的細胞或地區使用激光顯微切割。此外,它也有可能快速並直接使用AVC的軟件,例如以選擇單個細胞相同的細胞周期階段。  

細胞周期阻滯

所謂的檢查點是特別重要的,為“質量檢查”細胞周期過程中的相變。這是可能使細胞周期停滯在G1-/S-phase(中期)。到現在為止,它被證明是困難的,以確定確切的時間和地點相變 - 它隻能通過化學誘導的細胞周期阻滯過程,例如。細胞有不同的劃分率,因此在細胞周期的不同階段,目標階段捕獲活細胞是有問題的。

如果一種毒素被施加到前S期的細胞,使除停滯在細胞周期可以同步在2天內。然後在所有的細胞是相同的相位。這種類型的細胞周期阻滯用於分離白細胞染色體,例如。人體血液中的白細胞培養72-96小時一段時間,然後用一小時與colcemide停止在細胞周期中的中期。

然而,細胞周期同步再次變得不平衡了一段時間後,由於不同的劃分時間。

FUCCI技術

FUCCI技術可以用於可視化在活細胞中由G1期向S期過渡。等待時間長的問題與化學誘導細胞周期阻滯技術所遇到的規避引入熒光蛋白。然後,可以通過不同的顏色標識的不同階段的細胞的發展。熒光被觸發,例如通過引入蛋白質MAG-相中的mKO2的CDT1。各個階段確定醒目的顏色對比。細胞核顯示紅色在G1期,S,G2和M期的綠色熒光。從G1向S期的過渡黃色熒光確定。激光顯微切割的熒光模式的組合是一個巨大的節省時間,作為黃色熒光的細胞,例如,可以通過對AVC模塊捕獲,並直接記錄,可在熒光模式下解剖。

 



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