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尼康顯微鏡,什麽是共振掃描激光共聚焦顯微鏡?

2013-11-08  發布者:admin 

激光掃描共聚焦顯微鏡已被證明是對固定和染色的細胞,組織中一個有用的工具,甚至整個生物體的光來源於區域從焦平麵將消除高對比度。熒光蛋白在活細胞成像,然而越來越多的應用,現在需要顯微鏡的成像速度為毫秒級解開在許多生物過程中發生的複雜的動力學。不幸的是,傳統的激光掃描共聚焦顯微鏡由電流計鏡有限的采集速度,這是一個線性鋸齒控製信號以每像素幾微秒的速度驅動。這意味著掃描速率範圍從500毫秒到2秒,取決於圖像尺寸。為了獲得更快的時間尺度的圖像,激光掃描共聚焦顯微鏡必須重新設計,將先進的掃描方案,使光束能夠光柵掃描整個標本在更高的速度。為了克服共焦顯微鏡本身速度慢,一些製造商已經推出了配備共振掃描鏡能夠采集的圖像在30幀每秒或更高的儀器。

尼康A1R激光共聚焦掃描單元

如圖1所示是一個尼康A1R激光共聚焦顯微鏡掃描單元配備了許多先進的功能,包括一個基於高分辨率檢流計掃描儀(4096 x 4096像素;非諧振)和高速共振掃描儀,連續可變的六角形小孔,光譜成像能力,幾個光輸出端口,並對不同波長的多個激光對一個輸入端口。一個額外的自由空間光束引入口包括在a1r-mp(多光子模型)的超快激光多光子成像的必要。共振掃描係統能夠在速度從每秒30幀的高速圖像采集(512 x 512像素)以每秒420幀(152×32像素)而非共振掃描儀功能的最大掃描每秒4幀的速率在512 x 512像素。聚焦變焦與共振掃描儀(從1.5倍到8倍)是由一個單獨的Ronchi光柵模式每一步的要求限製(在下麵討論),而非共振掃描儀具有一個1X無級變焦範圍1000倍。也許A1R掃描裝置最先進的功能是執行混合掃描使用能力在串聯兩掃描儀在這種模式下,非共振掃描儀可用於激活或漂白試樣的選定區域進行共振掃描儀後續高速成像實時觀察的光活化物種的恢複或擴散。該儀器的真正力量在於多功能,使固定標本和實時掃描與可選的光催化活細胞成像的熒光蛋白的熒光筆,光學高分辨率共焦成像,熒光和關。在有限的預算下的核心設施,這種多功能性使在一個單一的儀器更廣泛的用戶基礎的住宿。

雖然比較複雜的諧振振鏡已商用超過三年,在激光掃描共聚焦顯微鏡的應用還沒有廣泛實用的經驗。在研究人員希望圖像的快速鈣波的活細胞,早在上世紀90年代初的實驗室製造的第一點掃描儀器。經過多次研究報告描述了成功的實驗,其他研究人員開始開發更先進的儀器,包括多光子共聚焦含有共振掃描儀。共振掃描顯微鏡結構複雜的高速共振掃描儀的餘弦運動,產生像素時鍾問題。然而在過去的十年中,在,幾個可行的解決方案(包括硬件和軟件)的出現,使儀器執行正常的聚焦功能,如平移和縮放,視頻傳輸速率。這些工具應該會增加在未來幾年普及無疑將能夠與旋轉盤和線掃描儀在速度和成像效率。

在傳統的激光掃描共聚焦顯微鏡,激發光束擴展和向雙光柵掃描光束聚焦在試樣振蕩光學掃描振鏡。熒光發射掃描通過相同的鏡組,通過共軛(聚焦)針孔孔徑去除聚焦光進入光電倍增管檢測器之前。在掃描過程中,掃描過程中,掃描振鏡的一個沿快,水平軸的標本,而其他鏡掃描和跟蹤速度較慢的垂直軸。繼續掃描直到整個二維(XY)是將采集到的圖像,這一過程可以重複產生隨時間變化的一係列圖像。另外,重點可以沿著顯微鏡軸向平麵獲得三維(XY,和Z)光學切片圖像棧。掃描速度由快軸鏡機械規格有限,通常的掃描速度大約4每像素5微秒。因此,對於一個512 x 512像素的圖像在一個單一的二收集,掃描點從每個像素約4微秒。在一個標準的視頻率驅動振鏡掃描器(每秒30幀)來收集類似大小的圖像是很困難的,如果不是不可能的,因為鏡子很快會被加速,在恒定的速度而在現場掃描,然後迅速減速和旅行的方向逆轉,為每個掃描線重複這個循環。嚐試這樣一種行動在30幀每秒會創造條件,可能導致過熱和過早失效。作為一個結果,慢的掃描速度的限製需要非共振線性振鏡共焦顯微鏡觀察在非常快的時間發生的事件的能力。

快速樣品掃描方法

基於激光掃描共焦顯微鏡鏡,掃描速度最快的方案包括使用線掃描獲得一個像素行沿一條軸線與快軸鏡標本同時將慢軸鏡掃描選擇合適的位置(圖2)。在現代聚焦的工具,掃描線不受約束的X軸,但可以麵向任何方向包括所有感興趣的標本特征。結果往往是繪製一係列掃描偏移使熒光強度隨時間變化的可視化。這種方法可以產生高速掃描,但其檢測事件在樣本的其他地區可能出現的能力有限。另一個陷阱快速掃描線是駐留時間,每個像素一般不足以激發所有的檢測到的熒光,尤其是窮人的目標數量的標本。此外,使用共聚焦顯微鏡的光電倍增管有一個量子效率範圍從約15至百分之40,所以掃描速度的增加,檢測到的光子的數量可能在每個像素的一些標本下降到一定水平,由光電倍增管的本底噪聲遮蔽。

圖2給出了線掃描共聚焦顯微鏡在活細胞中的例子。如圖2所示的序列(一)捕捉XT掃描係列鈣火花的合成試劑,誘導心肌細胞Fura紅。注意高熒光強度在序列中的連續時間點的幾個地點發生的地區。圖2(b),鈣波的圖像說明穿越細胞質中使用熒光蛋白卡默萊昂傳感器探頭在一個孤立的HeLa細胞(含mcerulean和mvenus)。獲取高空間分辨率的圖像(如512 x 512像素)需要快速XY掃描必須用顯微鏡可以在毫秒整個掃場進行,通過在下麵的段落中描述的儀器為例。使用快速線與線性振鏡配備的共聚焦顯微鏡掃描,鈣波可以在一個維度記錄作為時間的函數的說明在圖下麵的圖片集。圖2(c),掃描進行了沿白色虛線在圖2(b)捕捉到一個單一的波的空間維度,通過細胞在不到一秒。

線掃描共聚焦顯微鏡

快速圖像獲取的另一個策略是提高像素停留時間沒有通過塑造照明光束成一條線,同時激發熒光團在一軸降低幀速率,而掃描試樣沿另一軸以中等速度達到鏡麵視頻的幀速率(如圖3示意圖(c))。這種掃描的概念已經在商業聚焦儀器,消除快軸擺動振鏡和捕捉熒光發射采用線性CCD陣列實現(線陣CCD)。因此,線掃描共聚焦顯微鏡可以實現視頻的幀速率激勵線通過聚焦狹縫形照明和采集熒光發射。線掃描共聚焦儀器的實際限製是不對稱的決議,由於在一個軸的分辨率是通過共聚焦掃描而在其他軸的分辨率是通過傳統的寬視場光學有限公司提供而獲得的。此外,它在技術上是很難產生一個窄的衍射極限的線聚焦的光加上適當大小的檢測狹縫分辨率不低於理論上的最優。

商業狹縫共焦顯微鏡的解決方案依賴於使用不同寬度的狹縫孔(不同程度的共焦),沉積在光學玻璃的不透明材料製成的薄膜。掃描照明由柱麵透鏡元收斂在由物鏡的數值孔徑確定一個角的焦平麵形成一個光之楔。狹縫掃描儀器能夠在決議,隻有在軸向方向上的圖像的點擴散函數的一個輕微的降解受阻的高速圖像采集,如上麵提到的。另一方麵,狹縫掃描儀目前依靠線性CCD探測器的像素具有相同的量子效率和噪聲特性的科學級CCD。這些探測器遠比電子倍增CCD不敏感(EMCCD技術)因此需要顯著更高的能量來實現類似的信噪比。其結果是快速的光漂白和光毒性的活細胞成像的高水平,這限製了掃描,可以在文物開始晦澀的實驗結果獲得的數。線掃描共聚焦顯微鏡將采用先進的互補金屬氧化物半導體的引入大大提高了(CMOS)或EMCCD型線陣電荷耦合器件圖像傳感器。

高速共焦成像更先進的方法包括掃描標本多的平行光束通過一個旋轉的尼普科夫圓盤或者通過掃描陣列在試樣捕獲所有的圖像點平行形成。在後者的儀器設計的關鍵是創建一個網格模式,能夠掃描整個場在一個單一的掃描運動,但維持照明和探測針孔在足夠大的距離,防止針孔熒光發射之間的串擾。尼康”的生命可以“掃場共聚焦顯微鏡是一種多點陣列掃描儀提供了可選的網格具有不同的針孔大小的增加細化的一個很好的例子。該係統還可以選擇使用一組具有不同寬度的狹縫提供最大限度的激發能量和發射效率在降低成本的共焦(圖3(b))。在操作中,32個照明點網格席卷標本現場使用快速掃描振鏡和壓電元件的組合來控製反射鏡和在視頻速率捕獲圖像。狹縫掃描模式,掃描場共聚焦顯微鏡能夠在速度接近每秒1200幀圖像采集。該儀器還可利用聲光可調諧濾波器(多色熒光成像聲光可調諧濾波器)激光控製,專業多帶雙色鏡,和匹配濾波器組。此外,顯微鏡可以耦合到高性能,使用盡可能低的激發能量的活標本最高效低噪音EMCCD相機成像係統,從而最大限度地減少光漂白和光毒性。

高速激光共聚焦顯微鏡掃描機製

通過旋轉盤共聚焦顯微鏡快速掃描活體標本提供一個很好的替代尼普科夫圓盤。這些工具都是基於一個圓形,旋轉盤,包含一個或多個針孔陣列排列的阿基米德螺旋設計的單盤旋轉時掃描整個試樣平麵(或少用一些設計)。旋轉磁盤的顯微鏡也可以有縫隙而不是在減少軸向分辨率成本針孔。先進的旋轉盤係統功能的雙磁盤包含微透鏡元件放置在磁盤陣列上的針孔,從而起到焦點事件激發光對下盤相應的針孔顯著增加光通量(圖3(a))。這類工具通常被稱為,或陣列掃描儀因為他們掃描照明的點或線場每個圖像的采集過程中無數次的數組。旋轉盤顯微鏡最高的成像速度接近每秒2000幀,但儀器往往阻礙了達到如此高的利率由於磁盤的高速旋轉必要通過每個照明點在試樣多次相同的部分。長期的整合所需時間被用來捕捉圖像的數碼相機(至少在全或半幀大小)也限製了采集速度。旋轉盤顯微鏡通常使用激光照明,發光二極管,或電弧放電燈,但執行優化時配備的全固態激光器的波長匹配合適的熒光激發峰。活細胞成像的應用,旋轉盤或其他陣列掃描共聚焦顯微鏡通常是樂器的選擇,尤其是在快速的細胞動力學研究。平行光束減少光漂白和光毒性,使較長的成像。

額外的技術能夠在視頻速率掃描標本(雖然沒有市售)包括儀器配備聲光光束偏轉器(定位;圖3(d)),數字可編程陣列微鏡(DMDS;圖4(b)),或旋轉多邊形鏡(圖4(a))。中心利用超聲波產生的壓力區,可以在晶體衍射或偏轉一個角度入射激光的光與聲的頻率變化。這些固態設備受益於無機械運動部件和可忽略的慣性,使高度精確的鋸齒柵格生成掃描幾乎瞬間反激。此外,AOD掃描儀能夠產生用戶定義的變形產生興趣的掃描區域。光學顯微鏡的缺點是基於這些器件的色散特性,它隻適合單色光控製通道。因此,寬帶熒光發射不能退掃描和狹縫通常用於激光共聚焦檢測,從而減少軸向分辨率降低熒光從外麵焦平麵區域的排斥。此外,柱麵透鏡是必要的激光光束形狀和晶體矩形孔徑匹配。雖然這些問題已經解決的幾個實驗儀器的設計,使用AOD掃描儀的概念尚未流行用顯微鏡製造商。

可編程陣列顯微鏡(PAMS)特征的數字微鏡器件作為圖像平麵中的空間光調製器產生廣泛的用戶自定義的光照和檢測方案。這些工具可能傑出的多樣化選擇光源可在反射,傳輸,和光學切片和多重熒光模式,利益選擇能力,同時區。PAM的儀器設計的核心是DMD單元,它由微型(約16微米)平方鏡元素可以單獨設置旋轉“對”或“關閉”相對於入射和反射光(如圖4(b))。DMD可重複模式的複用提高光通量的使用,和他們比振鏡應用於點掃描共聚焦顯微鏡明顯快。原則上,PAM工具可以生成圖像和光學部分,可以通過目鏡觀察,熒光發射是對科學級CCD相機係統或電子倍增。利用DMD器件的主要優點是,他們可以通過軟件控製,沒有移動部件(除微型反射鏡),並提供能夠使用兩個不同的鏡子的位置直接光通過分光路。在這方麵,PAM儀器提供更大的靈活性比旋轉磁盤和狹縫掃描顯微鏡。然而,DMD顯微鏡受到嚴重限製的照明方。照明光束必須擴大到包括DMD的整個表麵,減少來自任何特定的鏡光供給量,從而使激光光源具有挑戰性的應用。

共振掃描時序問題

用旋轉多麵鏡的光束偏轉係統是一項成熟的技術,利用光簡單,非色散曲麵創建輸出光束具有基本的鋸齒柵格類似於傳統的視頻掃描。多邊形的鏡子(圖4(a))已被用於在過去幾次商業和實驗聚焦的工具,但目前沒有被顯微鏡製造商實施。在實踐中,多邊形鏡的使用需要更複雜的光學元件的設計,和單位是容易相對於旋轉軸在反射率和角微乎其微的變化。被稱為錐體的錯誤,這些角差異產生光束的波動必須的光學矯正。由於多邊形麵數必須在光柵掃描線總人數的比例,專業鏡常常必須為了建立聚焦的工具。多邊形有15,25,或75方都必須在63000,37800轉,或12600轉每分鍾,分別,為了生成視頻速率在每秒15750線掃描。這些高的速度,需要專門的軸承,更複雜的儀器設計。由於這些原因,基於多邊形鏡共焦顯微鏡是罕見的,一般歸屬於特殊利益項目。

旋轉盤,掃場,和線掃描共聚焦係統都受到光學切片性能妥協相比,點掃描共聚焦儀器。表現較差是由於這樣的事實,從試樣的偏遠地區光漏出到探測器通過空間的串擾,並越來越嚴重的高熒光厚組織成像時。此外,一些市售的旋轉的磁盤工具采用固定針孔大小不可調的用戶,因此這些顯微鏡是限於隻有特定的目標放大的兼容。情況稍好的市售基於狹縫圓盤顯微鏡匹配目標分辨率和放大提供可互換的磁盤。然而,大多數在以上段落犧牲最佳衍射限製的照明和檢測速度的描述工具,並不能產生商業上的激光點掃描共聚焦顯微鏡平移或縮放功能可用。然而,這些顯微鏡能夠產生薄優良的圖像,在視頻速率或更好的貼壁細胞培養。

共振掃描儀的基本知識

回顧傳統的單點激光掃描共聚焦顯微鏡,擴大激光束掃描在試樣用電流計鏡不斷改變的光通過物鏡後焦平麵的夾角。的情況下被放置在一個90度角的對方這樣的掃描鏡與自己的表麵以及在遠心麵顯微鏡的光軸的旋轉軸(共軛的目的後焦平麵)。來回的振鏡旋轉反射鏡將聚焦激光光斑在試樣在柵格模式穿越田野的橫向尺寸。一邊一個鏡麵旋轉(X)產生水平掃描線,而其他的鏡子上下旋轉(Y)產生垂直偏轉。現代共焦儀器配備先進的掃描係統,給予高度的靈活性,對試樣的形狀和尺寸,掃描區域。掃描角度可以通過重新分配的一部分旋轉X-振信號的Y檢流計,反之亦然。同樣,共焦變焦功能可以通過改變該電流計掃描角範圍內實現。掃描一個專門的用戶定義的區域的標本為實驗能力需要激活或漂白選定區域不具有矩形幾何特別有用。

高性能的伺服控製,閉環振鏡應用於激光掃描顯微鏡是一個工程奇跡,為了準確地旋轉附加鏡和精密的光束位置在一個壽命超過幾個億的周期。振鏡是在一個類似於電動機采用轉子和定子驅動定位運動構造執行器,包括整個裝配和響應根據慣性比它的扭矩。根據振鏡的設計,無論是轉子或定子永磁與妹妹組成的線圈相互作用,產生驅動力,轉子。機械站是用來限製轉子運動的有限轉動弧。在大多數的共聚焦顯微鏡,移動磁鐵驅動器是首選由於其緊湊的尺寸,定位精度高,剛度和響應速度快的優勢。電流計鏡表麵很薄的銀或鋁沉積在矽,石英片,或鈹襯底。檢流計反射鏡的最重要的要求之一是,他們是重量輕,建立剛性材料,具有孔徑大小不限製光線進入物鏡孔徑,並具有高度拋光的表麵,平的波長的一小部分。鏡子必須在較寬的波長範圍是同樣的反射(約350至700納米)和反射麵應集中在掃描單元的旋轉軸。

諧振掃描鏡運動

如上所述,伺服控製線性振鏡在掃描速度由於慣性作用有限,因此,隻能光柵在圖像采集速率,通常範圍從1到5幀每秒的幀尺寸的試樣在標準掃描。為了實現視頻率,用於水平線掃描速度較慢的線性振鏡可以更快的共振掃描振鏡的振動頻率固定,是一個音叉旋轉等效替換。在共振情況下(也被稱為反旋轉掃描儀CRS),能量儲存在扭簧或杆組件用於振蕩的鏡子在正弦曲線的方式。這些設備的周期在4到8赫茲的共振頻率,通常接近國家電視係統委員會(比例分數NTSC製式)視頻標準的15750線/秒水平頻率。當在7900赫茲運行共振掃描儀是用來獲得512線,逐行掃描在雙向取向(奇數行從左到右,甚至線右到左),結果是大約125微秒和圖像捕獲率在每秒30幀的順序單獨一行期。

圖5給出了幾種共振電流計設計具有不同的鏡像(圖5(a)),隨著一個圖,說明了鏡子的振蕩運動(圖5(b))。高速(7.9千赫)諧振振鏡可以旋轉約12度,在每個方向繞中心軸。入射激光的激發光反射在鏡子般的表麵通過物理反射鏡位置確定一個角(共覆蓋24度的範圍內)。如果鏡像運動在振蕩周期的相位和速度方麵考慮,從一個階段過渡的鏡子(速度等於零)通過0(最大速度)為(速度等於零)。因此,將在下麵更詳細的描述,速度是最小的(或零)在鏡達到最大角度的振蕩周期的結束,和最大的周期在鏡角為零的中心。

諧振振鏡掃描儀的主要優點之一是,他們逐漸加速和減速,因為他們通過振蕩周期的進展,從而避免複位信號的必要性在每次開始掃描線。為了實現平滑的運動,先進的掃描儀都配備了兩個振蕩質量平衡扭杆是機械調諧在建立平等的相反相共鳴,但方向相反的扭矩,取消住房安裝位置。其結果是一個反應少機械振蕩器,消除抖動和外部振動。高速共振掃描儀鏡孔徑大小是直徑約5毫米,並用銀或鋁塗層的光學級鈹製成,具有優良的比剛度。這些情況下的掃描角度範圍從15到26度,峰值。在振蕩,如圖5(b)和圖6,一個諧振振鏡的角速度在餘弦變換方式,在零度角達到最大速度(在掃描區域的中心)在90度和最小速度(在場地的邊緣),在那裏掃描方向的變化。當生成圖像使用共振掃描儀,這些非線性的變化出現在像素時鍾上的一個重大問題。

諧振掃描時序問題

由於共振掃描儀速度的非線性,熒光試樣在中部地區最高的速度掃描的速度逐漸減小,當掃描到邊緣。因此,當圖像數據流來源於共振掃描儀和圖像采集卡的主頻率獲得恒定的像素(假設光束掃描線),圖像出現在邊緣延伸。此外,激光激發強度分布不均勻(大邊)產生過度的光漂白(和潛在的光毒性)在掃描區域的邊緣,因為增加了暴露於激光。掃描非線性補償的最簡單的方法是限製掃描範圍這部分的振鏡的速度幾乎是線性振蕩周期,這發生在一個跨越約百分之70的總掃描寬度區域。不幸的是,該解決方案降低了發射信號可以被收集的時間,提高周轉時間之前掃描信號可以再次收集,並不能防止漂白在該地區被記錄在跌倒的標本地區。光漂白的影響可以被最小化,然而,當用檢流計的振蕩的線性部分采用限製試樣暴露於光照區域的孔徑可調。

圖像失真的非線性共振振鏡掃描引起的是幸運的是可預見的,可以通過軟件或硬件解決方案修正。不管涉及產生圖像的校正方案,最有效的策略包括在掃描振鏡的向前和向後掃描收集數據。在正向掃描是簡單的記錄數據,但由於落後的掃描改變像素的圖像數據記錄的方向,必須使用專門的讀寫緩衝區或軟件倒。在實踐中,圖像聚集在正常寬度的兩倍(實際上,1024像素為512 x 512像素的最終圖像的大小)和正常高度的一半(256像素)。在每個結束了X-諧振振鏡軸掃描,提供線性垂直鋸齒波信號(Y)電流計加1線和反向(X掃描開始)。在這種方式中,垂直掃描進展順利256次直到一圖像足夠的數據采集。

共振掃描時序問題

諧振式掃描共聚焦顯微鏡軟件和硬件時鍾解決方案依賴於了解高頻諧振振鏡的位置數據。在7.9千赫的設備,這麵鏡子可以旋轉約12度,在每個方向繞中心軸(共24度的旋轉)。鏡角位置(θ)和相位(或速度φ)的關係可以預測取決於振蕩周期的狀態。在一個振蕩周期的開始(鏡子的位置等於正負12度;圖5和圖6)鏡子是固定的速度等於零。當鏡子移向中點,角速度隨相位的餘弦函數,達到其最大值時,鏡角等於零。繼續,鏡子又減慢時向前掃描到的速度等於零,因為它瞬間改變方向的結束。在角速度相同的變化是觀察鏡在相反的方向轉動。應考慮與共振情況下的另一個因素是,這些設備是高Q振蕩器和不能有效地同步到一個外部頻率的相位和振幅變化大的反應時稍有漂移的自然振頻率和外部驅動源之間發生。因此,共振電流計本身應該是作為主振蕩器的定時元件同步所有其他。

基於軟件的時鍾方案涉及共振掃描共聚焦顯微鏡能夠像素數據的線性化使用查找表的基於鏡像的可預測的運動算法。作為一個例子,一個流行的算法首先確定相位常數為鏡和圖像采集卡,然後確定最終圖像的中心像素。該算法通過圍繞中心對稱平麵的反射鏡的位置與高度精密稱。圖像通過一個水平掃描時間在它們傳送到圖像采集卡生產線加工。像素數據存儲接收從掃描儀在兩次最終圖像寬度和高度的半決賽。這個過程的第一步涉及反相點數據的水平掃描線的下半年,其次是隔行倒數據線之間的圖像上半年(圖6(b))。由於圖像中點的可能不是由於數據和水平同步信號觸發采集起始集合之間的滯後確知,這往往是軟件偏倒的幾個像素的掃描線的必要。在這種情況下,掃描線的右邊緣作為圖像的一個參考點。序列中的下一步是將一個校正因子為每個像素或相位相對於中心像素。像素然後安置在最終圖像的正確位置(圖6(c))。在理想的情況下,利用先進的高速計算機,輸入數據可以動態分析和記錄到硬盤實時。

硬件時鍾

由於諧振振鏡可以漂移的溫度和振幅的變化,以及作為一個主持人,很難控製其他變量,設計硬件時鍾機製是掃描鏡在振蕩周期的瞬時角位置的精確測定的關鍵。目標是產生一個時鍾脈衝,當激光束穿過一個均勻分布的像素邊界上從左到右或從右向前掃描對逆轉左掃描。這些時鍾脈衝不會均勻分布在諧振情況下的時間。正如上麵所討論的,這種差異是由於角速度是在掃描範圍最大的中心,那裏的時鍾脈衝將更加頻繁(有間距約70納秒)。在極端的情況下,在振鏡開始改變方向,時鍾脈衝將有更大的間距(接近160納秒)。在理想的情況下,時鍾脈衝用於觸發的光電倍增管輸出的模數轉換和每個像素代表在最後的圖像相同的空間位移。已開發的幾種方法,線性諧振掃描數據(稱為掃描線性化)使用的硬件,但最成功的兩個策略被模擬像素時鍾和實時測量的光纖光柵反射鏡位置。

的像素時鍾解決方案的一個例子是利用一個電壓控製振蕩器(壓控振蕩器)和相位檢測器連續跟蹤像素和周期循環操作的電流計。一旦像素時鍾鎖定掃描共振頻率,振蕩器時鍾計數器,訪問一個內存芯片存儲信息有關的像素位置的掃描速度。記憶將該存儲的信息通過數字模擬轉換器,將壓控振蕩器在一個封閉的循環。由壓控振蕩器接收的控製電壓用於校正時鍾頻率匹配的掃描儀的餘弦速度變化。作為一個交叉檢查,像素時鍾發送每個像素的觸發相位檢測器比較定時掃描同步的電子信號。檢測到的相位誤差產生校正電壓,反饋到壓控振蕩器的維護周期與掃描周期同步。壓控振蕩器的輸出用於探測器的像素時鍾。幾種先進的專有像素時鍾可以從共振電流計製造商為他們的電子控製選項。然而,大多數的產生是基於查找表不允許在掃描模式的發生是由於機械漂移的小變化信號。

尼康共振掃描儀像素時鍾的光學係統

最先進的基於硬件的像素時鍾能夠直接跟蹤反射鏡的位置在整個掃描周期使用輔助反饋係統,直接追蹤鏡運動獲得的光學數據。也許最好的例子是第一次描述了羅傑錢和布瑞恩bacskai和作為第一個商業共聚焦顯微鏡含有共振掃描儀的基礎上,介紹了rcm-8000的尼康,早在上世紀90年代。類似的計時係統是目前采用的高性能的尼康A1R共聚焦顯微鏡係統。總之,尼康的像素時鍾是基於使用一個輔助的低功耗紅外激光係統反映了共振電流計反向鏡麵時梁。反射光束聚焦在光柵的透明與不透明的條紋(稱為Ronchi光柵)和振動與共振掃描儀沿光柵周期的步驟。光通過光柵記錄的強度變化,使用專用的光電二極管,提供信息給電子元件,數字化的圖像數據。由於檢流計反射鏡的位置檢測精度高,振蕩,像素時鍾是非常準確。

如圖7所示是一個示意圖,勾勒出一個Ronchi在共振掃描共聚焦顯微鏡為基礎的可變像素時鍾光柵光學係統組件。在像素時鍾的主要光學和電子元件在圖中左邊所示,包括低功耗半導體紅外激光光源,可旋轉的磁盤包含光柵不同間距,中間透鏡聚焦激光光束反射到Ronchi光柵和光電傳感器,探測光脈衝通過光柵。參與激勵和成像光學列車在右手邊的圖形組件,但為了簡單,成像元件的數量減少到最低限度。注意,在圖7中的諧振振鏡對雙方為高反射的表麵適應成像和時鍾激光器。

在操作中,由時鍾二極管激光器發射的光直接反射而參與成像係統激光器光從同一麵鏡子前反射諧振掃描鏡的背麵。從時鍾激光聚焦聚光透鏡席卷對振鏡的擺動運動步Ronchi光柵的表麵。在光柵,激光束掃過一係列交替的不透明和透明的空間線條寬度相等。聚光透鏡聚焦時鍾束小於間距光柵確保光是完全通過或由光柵部分封鎖線的大小,以交替的方式依賴於檢流計反射鏡的位置。關鍵的一點是,在光柵表麵的激光束光斑水平要明顯小於柵線寬度為消除衍射。在光照強度的振蕩振引起的波動是由光電二極管檢測,位於下方的光柵。

在水平掃描振鏡的諧振周期,時鍾寄存器的脈衝激光二極管的Ronchi光柵可以電子方式轉化為具有可變頻率的像素時鍾散。這些光脈衝將時振鏡在其振蕩周期的中央部分將更加頻繁,但他們會慢下來,如鏡的掃描,達到改變方向的結束。對光電探測器的要求之一是處理可變脈衝頻率的能力(在帶寬方麵),它必須足夠大以檢測整個線掃描。檢測器連接到一個跨導放大器,光電二極管的電流脈衝轉換成放大的電壓,然後送入一個倍頻器電路,雙打每行的像素數。光電二極管和相關的電子傳遞256脈衝每線和倍頻電路將輸出512個脈衝,每行由圖像采集卡采集和用於構造一個圖像。

Ronchi光柵像素時鍾

圖8給出了一個Ronchi光柵耦合到光電探測器作為可變像素時鍾的使用背後的基本概念的說明。為了清晰,光柵圖8(a)隻包含八個間距相等的疊加與共振電流計和時間的餘弦運動一個完整周期(紅色曲線;125微秒)。實際光柵256線間距和是線性尺寸更緊湊,由於像素時鍾激光實際上追述一行(垂直於不透明線)在光柵表麵的操作(如圖8(b))。當光束進入和退出的Ronchi光柵的清晰區域,透射光強度是由光電二極管檢測到的上升與振鏡運動步跌倒(圖8(c))。每個過渡(在這種情況下,從黑暗到光明)光由光電二極管檢測是用來產生像素時鍾(圖8(d))觸發圖像采集的顯微鏡。雖然時鍾脈衝,圖8(d)的非均勻間隔的時間(大約70至160納秒),但它們對應於圖像的空間間隔相等。

為了在相同的空間間隔獲得像素樣本(而不是在相等的時間增量),光電倍增管的信號從主顯微鏡成像係統通過可變增益和偏移傳統的放大器,然後通過模數轉換器由Ronchi光柵脈衝產生像素時鍾觸發的數字化。然而,對圖像信息的一半倒由於雙向共振振鏡掃描。為了糾正這種雙向掃描神器構造一個圖像之前,數字像素輸出是先轉移到一個先進先出(FIFO)或後進先出(後進先出法),緩衝取決於像素從左到右或從右到左後天。因此,對振鏡的水平掃描過程中,圖像的像素是掃上半年獲得(62.5微秒的時間)被送入FIFO緩衝區而反向掃描過程中獲得的像素被送入後進先出緩衝區。FIFO緩衝區讀取和重置為零在每個水平線開始收購,而後進先出緩衝區計數輸入數據存儲在下讀出期間確保反向掃描過程中獲得的像素倒。

共振掃描的優點

不像旋轉盤,形勢掃場,旋轉多邊形的顯微鏡,激光掃描共聚焦顯微鏡共振能夠改變放大倍率不使用通用的聚焦縮放功能改變的目標。變焦控製的物理基礎涉及改變旋轉角度為橫向諧振振鏡掃描鏡以及垂直線性振鏡。小後掠角降低了試樣的同時保持有效提供選定的標本細節放大圖像的像素數相同掃描的區域。調用聚焦變焦功能需要改變間距的線在Ronchi光柵用於可變像素時鍾。圖7中的磁盤包含光柵四大小,每一個都可以旋轉到像素時鍾光火車為了改變縮放因子。當線徑在Ronchi光柵間距尺寸縮小一半(保持相同的線路總數),由兩個因素的縮放因子的增加。同樣,降低光柵線尺寸由四增加到4倍的放大因子的一個因素。可能的縮放設置的數量取決於Ronchi光柵尺寸可變像素時鍾數。尼康A1R激光共聚焦顯微鏡能放大步驟7從1到8倍。互換光柵需要降低諧振振鏡的掃描角,這是使用預先存儲的信息在顯微鏡控製電子檢流計掃描角坐標與選定的光柵實現。

諧振掃描鏡的動態影像采集速率的選擇僅僅通過改變圖像的尺寸提供廣泛的緯度,同樣像素組合在旋轉盤顯微鏡麵陣探測器。雖然這一水平線掃描速度是由檢流計的諧振周期固定,用每幅圖像的行數可以減少產生更快的成像速度。因此,在512×512像素的圖像的大小,尼康A1R顯微鏡在每秒30幀的速度產生的圖像。如果垂直線的數量的一半是采集收購具有512 x 256像素尺寸的圖像,幀速率是每秒60幀,理論上翻了一番。注意圖像的大小速度的關係是不完全的線性由於在線性定位輕微的延遲(Y在更高的速度表)。對於尼康A1R顯微鏡,掃描率最高達到共振掃描模式,每秒420幀,在512 x 32像素的圖像尺寸。對於許多應用,如快速的鈣波成像活細胞,減少垂直圖像尺寸的增加速度可以接受的犧牲。

串聯諧振振鏡掃描的應用

如圖9所示是使用光學熒光筆熒光蛋白在活細胞中的光轉換和光活化的實驗中,從該串聯掃描和如此配備諧振掃描共焦顯微鏡高速能力的一個組合,其顯著受益。圖9(a)至圖9(c)說明了在光轉化標記的融合mEos2的間隙連接(紅色到綠色的光可轉換熒光蛋白)的蛋白43間隙連接組分和表達於HeLa活細胞。一個小的區域被選擇為光轉換與耦合到一個405納米激光的檢流計線性(如圖9(a)),其次是成像用488納米激光(圖9(b)和圖9(c))。圖9(d)〜圖9(f)表示的PA-GFP的光活化融合到人β-肌動蛋白在腎細胞。類似於圖9(a)中,感興趣的區域被照亮用405納米激光隨後成像在488納米。最後,線粒體的使用的融合紅色發光點燃熒光蛋白(KFP1)到線粒體靶向信號出現在圖9(g)至9(ⅰ)的照片切換。標記的線粒體被成像與在圖9(克)既熒光和微分幹涉對比(DIC)模式561納米的激光。後完全照片切換標記的嵌合體“關”與488納米的光照,線粒體通過再次成像在561納米的出現缺乏熒光(圖9(H)),它可以被重新激活(圖9(i))。使用光學熒光筆調查可以與共振掃描共聚焦顯微鏡下進行在成像速度必要澄清細胞內動力學上各種各樣的時間尺度。這些成像技術是通過在尼康A1R掃描儀hyperselector成為可能(見圖1),它將405納米光子用於光活化的振鏡掃描器,離開共振掃描儀可以同時獲得的光固化產品的高速圖像。振鏡掃描器可以縮放限製刺激區域的大小(可以大大加快激活)。能夠用光催化在405納米的同時獲取圖像,利用諧振掃描器延伸到尼康a1r-mp多光子顯微鏡。

結論

傳統的激光掃描共聚焦顯微鏡遭受的主要缺點是相對緩慢的關於圖像采集速度盡管在光排斥來自熒光區域從焦平麵取其高分辨率的優勢。在共聚焦技術的主要技術的局限性是一個快速的水平要求(X軸)掃描鏡能夠產生500個或更多的實時每幀的線。然而,即使在相當慢的掃描速率的點掃描共聚焦顯微鏡配備標準線性振鏡,波束駐留時間,構成一個像素很短,限製了可以采集的信號量。隨著新技術的引入,提高掃描速度,如共振電流計,爭論仍然存在,繼續增加點掃描共聚焦顯微鏡的速度隻會降低信號量,直到它最終運行在最高速度。這最重要的,但關鍵的信噪比概念也許不公平的LED的幾種可供選擇的高速成像技術,提供劣質的光學切片的性能在重點工程努力點掃描儀器能夠視頻速率的圖像捕捉消費的發展。

與預期相反,一些報告顯示高速點掃描共聚焦顯微鏡配備共振掃描儀能夠改善信號水平和減少漂白過什麽預料。這個意外的結果最有可能來自人工合成的熒光團,這極其複雜的光物理行為的量子點,和基因編碼的熒光蛋白,所有這一切都似乎是能夠激活,光的光譜,在不同程度上通過廣泛的不明原因的機製。關於共振掃描共聚焦顯微鏡,熒光信號的增加可能是激發光照劑量依賴性反應,通過快速掃描產生的信號電平增加調製。通常情況下,這樣的反應應該取決於光斑的直徑和速度的光束掃描標本。結果模擬脈衝照明的熒光。因為脈衝光可以轉變成黑團或“關閉”的矛盾狀態中,他們避免進入激發態,熒光發射水平的增加而增加,光漂白率有所降低。這些報道都沒有得到實驗驗證,一個廣泛的基礎,但他們應該記住在檢查生活快速共聚焦成像結果和固定標本。

共振掃描共聚焦顯微鏡,一個仍在發展和完善的技術,應該被證明是用於檢查主機采用細胞生物學問題的組織,一個有用的方法,和完整的生物條件下的視頻率成像是實驗的關鍵在。同時利用諧振和線性振鏡與興趣激活或漂白優越的光學部分的分辨率比區串聯進行高速成像是一個額外的好處,不能與其他技術實現的能力。最精密的儀器,可以將視頻率與使用專門的探測器進一步提升這些新型成像光譜共焦掃描顯微鏡。例如,使用熒光蛋白成像鈣波共振生物傳感器需要非常快速的采集速度因為波可以在不到一秒鍾穿過細胞。使用傳統的共聚焦顯微鏡,鈣成像幾乎是不可能的,但與儀器如尼康A1R,波可以實時捕獲和熒光發射光譜的貢獻而可以解開與光譜檢測器。這種類型的實驗,以及無數的人,將有利於在未來的激光掃描共焦顯微鏡檢查諧振。



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