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尼康顯微鏡的熒光原位雜交技術

2013-11-21  發布者:admin 

 近四分之一個世紀以來已通過引入原位雜交的方法檢測和研究染色體和細胞的DNA序列在文獻中出現的第一個研究文章。 然而,在過去的15年裏,發生了一場革命,光鏡下通過熒光技術的發展,允許前所未有的輕鬆,精密,準確定位,識別和生物醫學樣品的基因構成數據記錄。

通過同時使用多個熒光色原位雜交的力量得以極大地延長。 多色熒光原位雜交(FISH),在其最簡單的形式中,可以用於識別盡可能多的雜交中使用的不同的熒光團標記的功能。 不僅使用單一顏色,而且顏色的組合,有更多的標記的功能可以被同時檢測到單個細胞中,使用數字成像顯微鏡。

圖1中顯示的是一個典型的多色熒光原位雜交標本。 正常男性淋巴細胞雜交FITC標記生物素標記Chr2l的的的CHRY探頭和CY3高辛標記Chrl3的的和CHRY探頭。 在左上角的一個形象的DNA的細胞核用DAPI染色的,采取了使用DAPI過濾器集。 右上角是一個圖像的Chr21 CHRY與FITC染色,用一個FITC過濾集。 在較低的左邊是一個形象的Chrl3 CHRY CY3染色,用CY3過濾器設置拍攝。 在右下角的圖像加入彩色合成圖像顯示所有物鏡染色體的顏色。 由馬薩諸塞州弗雷明漢,綜合遺傳學,添博士Houseal,提供標本。

多色熒光原位雜交,與數字成像技術相結合的技術,今天提供前所未有的功能的多個核酸序列的電池組件,染色體和基因的分析的非同位素檢測。

在一個不同的,通常較長的波長的現象,即在一個光波長激發一種化學發光,熒光,用於在整個生命科學的研究各種各樣的結構和細胞內活動。 探頭和顯微鏡技術的進步導致的​​熒光技術的快速發展,在過去的十年。

該評論文章將覆蓋FISH技術的基本知識的局限性,研究人員已經麵臨多年來在使用FISH,最近的事態發展在硬件,軟件,探針,試劑技術發展的影響,以及在該領域目前的研究結果。 FISH的技術開始擴大超出純理論研究,為臨床診斷設置的新發展,也將被審查。

FISH技術概述

使用FISH基因組學,細胞遺傳學,產前研究,腫瘤生物學,輻射標簽,基因定位,基因擴增,基礎生物醫學研究正在迅速增長。 原則上,技術是相當簡單的。

標識,雜交反應,或標簽,物鏡基因組序列,因此它們的位置和大小,可以研究。 適當情況下,染色體特異性探針的DNA或RNA序列,首先與記者的分子標記,通過熒光顯微鏡,這是後來查明。 標記的DNA或RNA探針雜交到中期染色體或間期核的投影片上。 洗滌和信號放大後,試樣的報告分子篩選通過熒光顯微鏡觀察。

FISH形態學和基因組結構,可以非常精確的空間分辨率。 該技術具有快速,簡單地實現,並提供了巨大的探頭穩定性。 一個特定的物種的基因組中,可確定整個染色體,染色體的特定區域,或單拷貝的獨特序列,這取決於所用的探針。

上一頁限製

直到最近,FISH是有限的硬件,軟件,試劑,探針技術,並參與實施該技術的成本。

市售顯微鏡硬件優化多色FISH是不可用的,直到20世紀90年代中期。 在此之前,顯微鏡FISH應用程序進行自定義。 沒有被設計成大多數光學顯微鏡檢測FISH信號中固有的低光水平。 作為基因組的分辨率的技術已急劇增加,在顯微鏡光學係統的要求已進一步增大。 多個波長之間色差一直是一個問題。 對於多色進行具體分析,所有的鏡頭,包括集電極鏡頭,不得不被色校正。 此外,落射熒光光源均勻照明難以對齊。

多色熒光原位雜交圖像分析使用(一)單個濾波器的多維數據集需要的各種信號的隔離,或(b),利用一個激勵濾光輪與多路徑的二色性和屏障過濾器。 最近的事態發展過濾技術糾正了一些以前遇到的問題,通過光學失調引起的個別濾光塊的機械開關。 激發濾光片輪,可以有效地用於多通分色和阻隔過濾器使用三種顏色,采用每種顏色單獨激發濾光片沒有注冊移位。 但是,對於超過三種顏色,單通濾波器仍然可以使用。

高速彩色膠片或CCD( 電荷耦合器件 )相機,用於收集數據和色彩保真度問題。 此外,疊加的圖像的過程中,的收購不同顏色與不同的探針在一個單一的試樣的限製。

成像軟件,可以定量分析樣品熒光試劑也很有限,因為現有的圖像分析係統,優化工作與熒光樣品。 可視化分析是勞動密集的,往往是主觀的程序,並在某些情況下,熒光的樣品的分析而使用先進的熒光成像能力是困難的和不確定的。 研究人員通常必須有一個軟件開發人員創建自己的內部圖像分析軟件。

所用試劑和探針本身沒有足夠的所有應用程序。 例如,現場檢測雜交的效率降低隨探針大小,創建通過熒光顯微鏡觀察,可觀察到顯著的限製。 不同顏色的熒光染料的數量是有限的,和染料的光穩定性差。 但由聯邦政府資助的人類基因組計劃的熒光染料技術和分拆技術的新發展,現在有一定的影響。 有所有的人染色體,越來越多的新的基因的特異性探針的探針可用。 原位雜交試劑盒和熒光標記的探針商業上可從幾家公司。

成本是另一個主要障礙。 由於沒有市售FISH係統市場上,研究人員組裝定製的係統,包括試劑,探針,顯微鏡,成像硬件,軟件,數據分析和報告能力。 同時要執行的多色FISH複雜的圖像分析可能花費20萬美元,大多數臨床研究人員不容易接觸到的一筆研究員向上。 其結果是,許多研究的科學家們希望在他們的實驗室使用FISH被禁止這樣做。

FISH已成為廣泛使用

許多硬件和軟件製造商已經開發出的方法來創建自定義係統的負擔得起的商業替代品。 發達國家的許多公司和實驗室從事FISH類合作精神,讓新的突破發展。 作者將引用在自己的經驗作為例子,這些類型的係統的發展。

構成的係統中使用,在美國,它提供了一個中等價位的FISH係統研究,從一些廠家和依賴於圖像分析軟件,顯微鏡硬件及配件的最新發展。 臨床研究實驗室會發現該係統可用於各種各樣的應用。 該係統提供了集成和自動化的最終處理臨床測試卷。

軟件係統所示,這裏是MultiFluor(TM)多參數成像軟件(生物檢測係統),在Microsoft®Windows(微軟,華盛頓州貝爾維尤)為基礎的係統,可以檢測,分析,多色顯示的結構和分子功能FISH樣品。 分析的時間和準確性得到改善,通過關聯測量在每個樣品中的各種波長的多個功能。 該係統有利於圖像采集,圖像存儲,數據庫管理,顯微鏡自動化控製,全功能的圖形化數據分析。

如圖2所示MultiFluor軟件數據審查畫麵。 用戶也可以檢查圖像和相應的數據一起,和關聯從多個顏色(波長)的交互式圖形繪製工具,包括直方圖,散點圖等,這裏使用各種多參數數據,多個數據圖表一起顯示所選擇的多彩色的圖像設置的小區(DAPI染色細胞核,FITC-ChrX,CY3-CHRY,CY5 Chr2l的示出),以及與原始數據表中所示的測量。

FISH研究人員可以自動捕捉多種波長和多個焦平麵的圖像,多色FISH探針可視化,注釋和圖像打印出來,並存儲和檢索大量的彩色圖像數據集。 多色熒光原位雜交中期染色體進行分析,包括基因定位, 比較基因組雜交 (CGH)的比率,和核型的產生。 用戶選擇的地區,可以掃描和分析樣品。 該軟件的自動對焦操作,在多個波長上獲取圖像,記錄細胞的滑動位置,並測量多個功能,包括探頭計數,熒光強度,和細胞形態計量學。 可以從多種波長的多個功能相關。

該係統的另一個特點是其工作能力與聯網的個人計算機(PC)。 在一個典型的設置,一台PC機連接相​​機和顯微鏡硬件上線的分析站。 這台電腦處理的圖像采集和瞬時分析。 其他電腦服務複審站第一台PC所產生的結果進行分析,或進行專門的分析脫線。

軟件允許所有圖片要顯示的組件在生動的偽多色同時成像。 例如,圖像,同時四色實驗,用DAPI(藍色),FITC(綠色),CY3(紅色),FITC-CY3(黃色)的組合都可以被單獨顯示,或相結合,以形成彩色複合圖像(在圖1中)。 每個圖像可以以交互方式增強揭示興趣特征。 此外,很容易創建直方圖,散點圖,試算表,線圖,以及其他形式的數據製表和審查通過軟件(圖2)。 最後,數據保存在一個方便的流行的數據庫格式,可以存儲為TIFF,JPEG,GIF,或其他文件。

EPI-照明

自動顯微鏡硬件也是係統的一部分。 Optiphot和以後的模型顯微鏡係統(尼康儀器有限公司,梅爾維爾,紐約),具有自動化,計算機驅動的XYZ階段和對焦係統,存儲每個對象的坐標。因此,重要的細胞和染色體位點可以被立即召回在顯微鏡幻燈片簡單地搬遷細胞按鈕上點擊鼠標,讓更廣泛的顯微鏡目視檢查或審查。

其中最重要的顯微鏡係統的優點是FISH的應用程序設計的照明裝置的開發。Quadfluor(TM)和後來的模型落射熒光照明(尼康儀器公司)接受四個熒光濾光塊,大幅提高亮度和對比度,這是重要的好處,研究人員用多種熒光染料。

照明,進行FISH和其他先進的熒光技術的研究人員可以自由工作沒有停下來更換過濾器立方體,具有四個或更多不同的探針。 ,是用於切換的四個過濾器中的一個非常精確的線性滑動件的平滑移動,確保出色的圖像配準。

該過濾器的多維數據集提供更高的亮度和非常高的對比度通過勵磁機,分色,節流閥過濾技術的使用;內部輕莫名其妙;節流閥過濾器的高精度斜的安裝角度和專有的抗反射塗層。 此外,落射熒光照明器可以容納在一個時間中的四個立方體用於分離不同的熒光信號,或者可以用於多頻帶濾波器立方體的一些熒光染料同時圖像。

高傳輸的物鏡也是必不可少的成像分鍾染色體上的利益。 CFI-60 plan fluor物鏡(尼康儀器公司)的光水泥高透光塗層,以允許更廣泛的波長範圍和明亮的圖像。 物鏡是自由的色彩和球麵像差,並提供極高的對比度和低背景的自發熒光。

其他電腦控製的顯微鏡配件,以創建先進的電動係統,這將是模塊化和更負擔得起的研究和臨床應用目前正在開發的幾個廠家。 相機是該係統的另一個重要的考慮因素。 圖像可以使用數字CCD或愈演愈烈攝像機的收購。 在係統中的關鍵因素是他們有能力執行而不犧牲保真度低光成像。 通過適當的軟件,可以自動設置相機的設置,通過全自動化的顯微鏡的精度和易用性。

癌症,產前,產中和生物學研究

這裏描述的FISH係統,可以訪問到更多的比舊的,定製係統的研究人員,正在進入更廣泛地使用在癌症研究,病理學,遺傳學,發育生物學。 在他們的應用程序間期細胞多色探測器點計數,免疫,細胞形態學,DNA含量的分析。

該係統是在使用測試畸變染色體拷貝數,總DNA含量的相關性,與膀胱腫瘤。 在出生前的研究中,該係統可用於測試在產前唐氏綜合征,特納綜合征,克氏綜合征,以及其他的缺陷,包括相關聯的間期核中的anneuploidies。 在細胞和發育生物學的研究中,該係統可用於映射的存在和相對分布的細胞表麵標誌物,例如受體,胞質蛋白標誌,包括細胞骨架蛋白和特定的基因的信使RNA。

診斷潛力

在過去的十年半,研究人員已經知道,FISH技術具有非凡的潛力,不僅為純理論研究,但作為一種工具,產前診斷,細胞遺傳學,腫瘤評估等領域的臨床診斷中使用。 缺乏一個高層次的,價格適中的係統,不僅放慢了速度FISH已成為大多數研究者,但也阻止這種不可避免的擴張技術的輔助診斷的醫療保健設置。

在此係統中的最重要的後果之一是,它可以提供高級別的結果,不僅成本高,自定義配置的係統能夠提供在過去。 將FISH不僅要更廣泛的生物醫學研究中的應用,而且成為患者的直接需要的夢想可能會在不太遙遠的將來成為現實。



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