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貨真價實 坦誠無欺
新聞資訊

尼康顯微鏡,目鏡測微尺的介紹

2013-12-11  發布者:admin 

長度的所有測量都是基於對象的正在審議與另一種已知的尺寸,或具有標準化,標定比例的比較。為了確定一個木板的長度或寬度,例如,一把尺子或卷尺放在與板接觸和尺寸都注意到直接比較標尺上的刻度數值標記。

這個基本原理是適用於在顯微鏡下觀察試樣的測量,但在實踐中,它往往是無法實現的化合物顯微鏡放置尺子與試樣直接接觸(盡管這通常是在低倍率立體顯微鏡進行) 。 在複合光學顯微鏡進行測量,在高放大倍率的替代機製必須采用的,最常見的是在組合目鏡分劃板與微米級的應用。 大多數與複合顯微鏡進行測量落入0.2微米到25毫米。(廣角目鏡的平均場直徑)的尺寸範圍。 低於0.2微米的水平距離是在顯微鏡的分辨能力的下方,並且長度比的視廣角目鏡的場較大,通常(且更為方便)用立體顯微鏡測定。

如圖1中所示的是現代顯微鏡目鏡(通常被稱為一種 )配備有一個內部標線片的規模。 還介紹了圖中的是一個舞台微米,其中包含被細分為10和100微米的增量小金屬化毫米的尺子。並列在目鏡分劃板的刻度與舞台上的千分尺使顯微鏡校準標線儀和樣品進行線性測量。

用光學顯微鏡進行了第一次報告的測量由荷蘭科學家安東尼凡列文虎克,誰用砂的細顆粒作為計,以確定人類紅細胞的大小進行了在17世紀末期。 自那時起,無數的方法已被用於測量線性,麵積和體積試樣尺寸與顯微鏡(稱為測微形態測量實踐),以及各種有用的技術已經出現在過去的幾百年。 許多這些方法都具有實際用途,並可以被分隔成若幹廣義的類別,概述如下

  • 由試樣尺寸的直接比較在x獲得的微米級的測量-顯微鏡y平麵上(例如,使用機械校準階段,並專門測量顯微鏡)。 機械級使能在x軸和y軸的運動,並且常常采用一個副尺刻度,使讀數台的位移與0.1毫米(該方法的準確度)的精度。

  • ,利用投影的實像和那些由傳統或數字相機係統結合了微尺的方法製作的技術。 由於微米尺度的同時與試樣沒有觀察時,千分尺的圖像,必須通過顯微照片或數字相機係統的裝置被記錄。 這種技術是精確到微米或更小重複性非常高,往往收效。

  • 通過投射的測量刻度進入視場或通過包括與試樣具有已知大小的物體而得到的線性比較。 通常,聚苯乙烯或玻璃珠均勻的製劑可以包含與標本,如紅細胞,以提供大小參考。 測量,然後進行利用顯微照片或數字圖像。 該方法的準確度是可變的,並且取決於所述比較的對象的同質性。

  • 直接測量試樣通過位於顯微鏡內刻度尺,如含有固定或可移動的掩模版(最常用的方法)的目鏡來進行。 光罩必須連同一個階段微米校準,但提供的約2-10微米(3〜5%,這取決於倍率和鏡台測微計的分辨率)的精度。

  • 校準的顯微鏡載玻片和計數室被用於直接線性測量或計數樣品粒子的密度。 精度取決於10和50微米之間分格線,但平均值之間的間隔距離。

  • 顯微鏡的固定尺寸可以被用來產生試樣尺寸的粗略估計。 通過測量或計算的視場的大小,一個裝標本的相對線性尺寸可以被確定。

  • 確定沿顯微鏡光軸(z軸方向 )通過利用在顯微鏡校準的精聚焦調整垂直距離。 這種技術通常被折射的工件和球麵像差變得複雜,但可以提供幾微米的平均精確度水平。

一些被通常用於對象(樣本),兩者在顯微鏡和在日常環境的測量的技術,涉及的轉印比例的原理。 直接比較測量需要在審議訪問對象,並準確的標尺或刻度。 如果測量是必要的,沒有合適的尺子可用於比較,轉印規模往往可以用來確定關鍵尺寸。 傳輸尺度可以是任何合適的替代品,可以放置在與對象接觸,從而使對象的長度(或寬度),以直接比較,或轉印到轉印規模。 對象的絕對尺寸後的比較來校準刻度(或直尺)測定。 如果傳輸規模本身被標記以任意單位的刻度,則刻度必須通過比較標準的引用到絕對單位。

共聚焦成像焦平麵

轉移規模的原則已被用於從人類最早的天日常活動,並可以應用到研究中,盡管他們可能不直接測量與標準化規模進入顯微鏡標本。 有各種方法,采用轉移規模顯微鏡,包括將規模上使用的透明材料具有拉伸管,或者直接在投影圖像進行測量。 另一種方法是,拍攝或雕刻的規模到玻璃元件,它可以在顯微鏡的成像共軛平麵中的一個被放置在光路中,以便它可以在銳聚焦疊加的試樣圖像上被觀察到。 前的定量測量可以被執行,轉移規模的任意分割必須通過比較到主刻度的絕對刻度,諸如微尺進行校準。

各種各樣的試樣可直接安裝到顯微鏡校準刻度,如印在專門測量幻燈片,並測量然後可以通過使用絕對單位來進行。 如果這是不可能的,那麽轉印尺度的圖像必須被疊加到,在上麵描述的方式的標本。 最常用的技術目前用於測量樣品特性與光學顯微鏡是特征尺寸帶有刻度的地理位置優越,在光學顯微鏡下火車的刻度比較。 為了進行直接比較測量,在顯微鏡內的規模必須同時出現在大家關注的焦點與樣品。

在疊加刻度尺到樣品,以這樣一種方式,它可以與樣品進行成像的關鍵要求,是將刻度的顯微鏡的合適的共軛麵。 的原則,共軛焦平麵兩個主套沿著正確聚焦和對準複式顯微鏡的光軸發生。 一平麵集合包括四個圖像形成或場平麵 (參見圖2),而其他包括四個照明孔徑平麵 集內的每個平麵被稱為共軛與該組中的其他飛機,因為它們是同時在焦點,並且可以被看作通過顯微鏡觀察樣品時,疊加在彼此之上。 放置在一個共軛組的一個平麵上的對象將在同一組的所有其它共軛平麵中出現尖銳焦點。 很明顯,如果一個刻度是同時觀察試樣的圖像是可見的,並在焦點中,規模必須放置在成象平麵集合中的一個。

示於圖2是一個典型的透射光顯微鏡和光學係(在該圖的左手側)的示意圖的共同圖像形成共軛平麵。 在光學路徑電位測量分劃板位置是目鏡固定光闌,試樣平麵上,並且視場光闌。 掩模版還可以(理論上)被定位在相機和/或視網膜圖像平麵,但該過程是很難完成的,不切實際的,並且通常沒有必要。 注意,視場光闌的顯微鏡垂直照明,用於落射照明,也是合適的(但難以進入)位置設計成在反射光顯微鏡進行測量分劃板。

從考慮綴合物的成象平麵的清單,但很明顯,一種可能的位置為一個刻度是被照明視場光闌的平麵。 一個規模放置在視場光闌的平麵將同時出現在重點用顯微鏡舞台上的標本(見圖2)。盡管許多技術用於在該位置上插入一個測量刻度已經報道,這是不容易實現的許多顯微鏡的設計,主要是由於在獲得的可變光闌的難度。 大多數現代顯微鏡都與視場光闌位於儀器和不可訪問的運營商的基地內構成。 除非刻度可以精確的視場光闌的平麵定位,冷凝器必須沿著光軸(散焦),以使該比例為焦點重新定位。 因此,在改變顯微鏡配置有可能,要實現真正的科勒照明所需的顯著差異。

目鏡設計

中間像平麵在圖像形成共軛設置測​​量刻度可以被插入在其中的備用位置。 這架飛機正好與目鏡固定的隔膜,這是一般交通方便(圖2)。 幾乎任何目鏡可以安裝一個刻度在焦平麵,將目鏡插入在顯微鏡下觀察樣品的特性的測量裝置。 目鏡秤通常被稱為十字準線 ,盡管術語手提袋 ,或刻度被普遍使用在同樣的意義,並經常在文獻中遇到的問題。 最常見的常規目鏡的不同之處相對於固定膜片的物理位置。 一些目鏡設計位置隔膜在單元(透鏡之間)的中心,而其它的模型有一個固定的隔膜在目鏡的基礎上,下方,和外部,該透鏡組件。 在這兩個目鏡樣式,視場光闌位於所述中間圖像的焦平麵,但外部隔膜設計是優選的測量,因為任何掩模版,指針或其它規模將目鏡的光學係統之外。

一個最簡單的目鏡設計,被稱為惠更斯 (或惠更斯 )目鏡,由搭載有它們的麵向目標的凸表麵(如圖3)2平凸透鏡。 最靠近眼睛的透鏡被稱為眼透鏡 ,和一個更接近目標被稱為場透鏡 這種類型的目鏡是未校正的光學像差,並具有圖像平麵位於所述兩個透鏡(內部隔膜)之間的缺點。 因此,掩模版的精度是由單獨的眼透鏡的像差的影響,同時樣品圖像從場鏡,以及所產生的任何光學缺陷受到影響。

冉斯登目鏡具有結構基序相似的惠更斯目鏡,除了場透鏡的方向為平麵表麵麵向目標(圖3)。 此外,焦平麵和隔膜位於所述光學係統(外部振膜設計)以外,隻是場透鏡的下方。 放置在膜片A線網或類似規模將經曆比用惠更斯設計失真更小,並且在目鏡的任何光學象差將同樣會影響樣品和分劃板的圖像。 一個冉斯登目鏡的主要應用之一是在測微。

拉姆斯登的設計,被稱為凱爾納目鏡的更高度糾正和完善的版本,采用了消色差雙的眼睛晶狀體更充分正確的色場透鏡的像差。 凱爾納目鏡(圖3中未示出)還配備了高眼點,這是非常有用的操作符戴眼鏡,但他們引入一個小程度的扭曲的形象。 因為較低的焦平麵是外部在凱爾納目鏡光學係統中,像差影響的中間圖像和目鏡標線片相等的,因此,這種目鏡式是理想的導通與顯微鏡精確測量。 許多無限遠校正顯微鏡配置由製造商提供凱爾納式目鏡,這是一種具有可移動的固定光闌管擰入目鏡桶的下部。 除去膜片管和安裝在光罩的能夠容易地實現在幾分鍾無目鏡內部透鏡元件支架的拆卸。

在引入無限遠校正光學係統,補償目鏡被用於幫助色差校正。 這些目鏡一般設計有兩個獨立的透鏡,一個或兩者均為雙峰或三峰(參見圖3;廣角目鏡)。 補償目鏡可以通過彩色邊緣周圍出現的固定隔膜的內側邊緣被識別時,目鏡在明亮的光源前被視為(普通目鏡顯示一個藍色的條紋,而補償目鏡呈現出黃色,橙色或藍色條紋)。 倍率色差異,共同所有的高功率目標的像差,可以由光學係統耦合到一個補償目鏡校正。 此外,補償目鏡被設計來校正圖像的曲率,以在有限的程度。

對分劃板放置的正確位置是視場光闌或目鏡,它位於中間像方焦平麵的固定隔膜。 現代目鏡通常包含可從目鏡,用於插入一個分劃板的底部將其擰下固定環。 後光罩正確就位的固定光闌,保持環被重新插入並擰緊。 體視顯微鏡目鏡通常包含用於安裝光罩彈簧式持有人。 固井光罩到保持器將確保適當的取向,並且整個組件被插入到目鏡鏡筒和移向眼透鏡,直到取得正確聚焦。 分劃板保持器將保持恒定的位置,由於保持器上的目鏡鏡筒的側麵的彈簧張力。 分劃板的焦點可以被改變以適應觀察者的眼睛通過翻譯整個組件上升或下降。 使用這種類型的分劃板保持器的前,目鏡的隔膜必須被移除以允許掩模版夾持器滑入目鏡管。

載物台測微尺

如前所述,線性測量需要的對象也可以具有標準化尺度,如尺子測量的比較。 在利用目鏡標線片或目鏡測微計在顯微鏡下測量,轉印刻度(標線片),這是該試樣的圖像疊加後的任意單位,必須轉換成絕對單位,如毫米或微米。 通常是通過成像的鏡台測微計具有相同的目的也可以用於樣品的測量進行的分劃板刻度分度的刻度。 一個適當的校準包括確定在舞台微米的絕對距離,成像到位的標本,它對應於規模的一個師在目鏡分劃板的。 這個值通常被稱之為千分尺的值 ,或者校正因子 ,用於特定的目的。 一旦該值已經確定,任何樣品特征的尺寸可以通過乘以與正在使用的物鏡的校正因子的特征跨區目鏡標線片的分割數來計算。

階段微米設計用於采用透射光顯微鏡的應用包括具有刻度限定長度的直接附著到表麵上,或優選地,夾在已知厚度的玻璃蓋的下方一個標準大小的顯微鏡載片上(1×3英寸)的。 微米通常具有長的刻度尺一個或兩個毫米,細分為單位,每單位長度的十分之一毫米(100微米為單位)。 每100微米的單元被進一步分成10等分,從而產生相當於10微米的最小刻度。

大多數顯微鏡物鏡與標準厚度(0.17毫米),一個蓋玻片利用被校正的,因此,這是最常用的蓋玻片的厚度為微米級尺度。 微米也可提供無蓋玻片,而這類型應與被校正零厚度的蓋玻片(或缺乏蓋玻片)反射光的目標使用。 某些階段微米設計利用金屬板,大小相等,以一個標準顯微鏡載玻片,作為被印或刻有刻度的小圓形玻璃嵌入載體。

的實際測量尺度可能由照相工藝來製造,但此法所得的線不鋒利而準確地定義為那些通過物理雕鏤線形成。 用於產生尖銳微米線的另一種方法是在金屬膜的電沉積直接在顯微鏡載玻片上的玻璃表麵。 在許多舞台微米,鱗片是由一條黑線,簡化定位分鍾刻度的任務,並協助粗糙聚焦顯微鏡包圍。 雖然照相製作微米足以應付日常工作,特別是在較低的放大倍率,其線條太粗糙沿邊緣和太寬的精確測量,或使用在高放大倍率。 這些微米應僅限於粗略測量在低倍率。

在利用反射照明光(反射光)的應用,在透明玻璃微尺的設計是不適合的,而直接在高度拋光的金屬刻鱗被代替使用。 用落射照明,如在反射光利用金相顯微鏡物鏡,用於通常校正未經蓋玻片,並需要一個階段微米未經蓋玻片在判決進行準確的測量。 因此,未受保護的尺度很容易受到傷害,必須非常小心處理,以避免刮傷和汙染灰塵,汙垢,指紋或其他雜物。

目鏡十字線校準

目鏡分劃板(確定的千分尺刻度的關係)對特定目標的校準通常是按照以下所描述的推薦程序(參見圖4)進行。 注意,隻對特定的目標/目鏡組合被測試,並且在顯微鏡的特定機械管長度的目鏡標線片的那個校準成立。 為了避免不必要的重複的過程,每個組合的校準信息應記錄並存儲在附近的顯微鏡工作站的便利位置。

  • 後確保顯微鏡對準並配置為科勒照明,插入適當的掩模版到顯微鏡目鏡和使玻璃分劃板盤的表麵上的刻刻度顯示清晰地聚焦調整眼透鏡。 仔細檢查分劃板的方向,以確認位置上方或下方的刻線數量也不予轉回。 這個任務可以通過按住目鏡在明亮的光源前,通過眼睛盯著鏡頭來完成。 最後,調整顯微鏡雙目瞳孔間距和以後測量記錄此值。 如果該顯微鏡配備有補償在兩個目鏡調整(如大多數現代顯微鏡的情況下),掩模版的校準值將是正確的任何瞳孔間距。

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  • 放置鏡台測微顯微鏡舞台上,並把微米尺度成焦點采用顯微鏡粗微調焦控製旋鈕。檢測規模,將其轉換為視場的中心是通過采用低功耗的目標促進先找到周圍的刻度圈,然後規模本身。 環包圍微米尺度是用肉眼可見的,因此應該使用來定位微尺在顯微鏡光路中(第一階段孔徑)的中心。 此外,幾個階段微米設計有刻從戒指到規模,這也有利於在使用高倍率的目標定位時規模的邊緣線。 旋轉的預期目標到位,並確保兩個秤(台千分尺和目鏡分劃板)是在同時進行重點視場可見。

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  • 翻譯階段,使用x - γ運動控製旋鈕或手柄,和/或旋轉目鏡(及其分劃板),以使兩個尺度成平行取向(圖4(a)和圖4(b))。 現代機械階段通常具有圍繞顯微鏡光軸的有限度的轉動運動。 在這種情況下,鬆開翼形螺釘(通常位於舞台的前部,將試樣台的下方)並旋轉階段,直到微米和目鏡標線片是平行的。

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  • 直接定位在目鏡標線片在微米(與階段控製)和對齊的分劃板上的左手定則與1的長,編號台上微米(100微米)的分割線(圖4(b))。 根據不同的目的倍率和目鏡場直徑,距離150微米和4毫米(階段微米尺度的長度的兩倍)之間的範圍內將是可見的目鏡。 在100至1000微米(10至100規則)在舞台微米的距離,確定兩個點在哪個分劃板和微米尺度完全匹配(參見圖4)。 為了獲得最準確的測量,利用兩個尺度上的最大可能範圍劃分的。 隻有偶爾做掩模版和鏡台測微計的刻度重合在其整個長度在目鏡可見,但是這往往與製造用於特定目鏡標線片的情況。 最後,確定目鏡規模參照舞台微米的分歧明顯的長度。

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  • 為正在使用的物鏡的千分尺的值可以通過將階段微米的選擇區域的已知長度的目鏡刻度的分割數對應的計算。 其結果將產生每刻度上的分劃板刻度為目標的距離,一個量通常被稱為校準常數 。 疊加在一台測微尺在圖4中,標線片(b)示出標記20的左手法則(標記為0)上的分劃板與鏡台測微計師的對準。 這兩個規則的重疊是由紅線清晰顯示。 發生重疊的下一個區域,在舞台上的千分尺標有30的規則與目鏡分劃板的7.5馬克一致。 因此,該階段微米的100微米的區域等於7.5分劃板的分裂。 目鏡標線片的各劃分,因此,對應於13.3微米,對於特定的目標/目鏡組合被校準。 適當的分劃板校準計算顯著數字的數量應進行仔細的審查。 因為在光學顯微鏡的最小可分辨距離約為0.2微米(在最佳情況下),低於該值的線性測量,不能精確地確定。

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  • 進行精確測量時使用配備有變焦光學係統的顯微鏡,有必要使用一個階段微米,以顯微鏡各變焦設定。 雖然許多顯微鏡變焦環和控製旋鈕都畢業於名義物鏡放大倍數,這幾乎是不可能的變焦控製返回完全相同的位置,一個必要條件精確測量。

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  • 後在目鏡標線片已校準的階段千分尺,試樣的線性尺寸均可測量。 所有測量,最高放大倍數的物鏡應選擇使感興趣的整個標本的功能下降光罩規模的跨度之內。 東方的光罩尺寸與試樣地區備受矚目的輪廓相吻合。 接著,將試樣轉移至左邊緣帶編號的行中的目鏡標線片重合,並且計數由目標區域跨越尺度分割數。 仔細估算師的任何部分。 為了提高精度,開展對大型樣品多次測量。 當圓形或橢圓形的樣品被測量(如血細胞,酵母,細菌等),記錄至少20名來自不同域的尺寸。 正在研究在圖4(c)的試樣是人類的頭皮頭發軸,它是在直徑約93微米(測量與校準的標線片,如上麵所討論的)。

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剛才所描述的校準過程必須,當然,可以重複每個目標要被用於線性測量。 應當指出的是放大倍數由幾百分之刻有相同的放大倍數(例如,10倍)相似目標(即使來自同一製造商)而變化,所以每一個目標應該被獨立地計算。 如果顯微鏡是經常與許多不同的目標時,它可能會更方便繪製校準曲線以圖形形式的每一個目標。 這提供了一種簡單的機製來快速確定而與顯微鏡的工作,而無需對所有的用於進行測量的目標施加微米的值時,重複運算的特征尺寸。

上述的校準程序提供的一個因素,其有效期為一個特定的光學組合,而不需要實際的物鏡放大倍率,通常不同於壓印在物鏡鏡筒的額定功率的知識。 在利用包含修正衣領,以適應變化的蓋玻片厚度的目的,是要記住重要的是與衣領的不同設置的放大率的變化。 因此,確定這樣一個目標的校準係數隻適用於用於校準校正衣領設置。 目標具有可調整的套環,適用範圍廣的蓋玻片的厚度提供校正,但也表現出倍率變化到高達15%,在整個調整範圍。

目鏡光罩及專業載物台測微尺

各種各樣的目鏡標線片的已經開發了許多線性,麵積和計數測量與顯微鏡(見圖5和6)。 簡單的交叉線十字線(圖5(a))通常作為一個定位標誌,用於測量大型試樣用有刻度的機械平台。 這種類型的掩模版也常用於配備為正交偏光照明,以幫助觀察者在確定雙折射樣品的相對於偏振器的振動軸的方向的顯微鏡發現。 對於線性測量,無論是水平或垂直線規則疊加在所研究的樣品特征的一個邊緣。 接著,該帶刻度的機械階段被翻譯無論是在x或y方向移動,直到相反的邊緣與基準線一致時,與所述特征的大小通過檢查尺度上的機械階段確定的。 即采用機械測量階段應重複從左到右(或從上到下),反之亦然舞台齒輪組,以補償間隙誤差。

水平和垂直分劃板秤(圖5(b)至圖5(G))在寬的頻譜配置的製造,以適應任何線性測量的要求。 畢業水平尺度(圖5(b)-5(e)條)是最常見的,通常由細分為8,10或100師一個10毫米的規模。 這些光罩是所有樣本的特征尺寸的測量是有用的,而且往往含有參考標記來幫助校準和測量。 越過微米尺度的光罩(圖5(f)和5(g)條)被用於二維線性測量,或在獨立的測量都是在垂直和水平方向上的便利。 錐形量規標線(圖5(h)條)包括具有在每對線之間不同的間隙幾個分格線對。 線對旁邊刻是用鏡台測微計分劃板的校準的參考編號。錐形量規光罩是方便用於測量混合的纖維和類似的標本已經重複特征尺寸的尺寸。

旨在協助顆粒和纖維的分析光罩往往含有方格,地球儀,同心圓,和量角器,如圖6所示。 廣場和電網光罩(圖6(a)至圖6(d))受雇於小特征尺寸的係統測量或計數的微生物,血細胞和小顆粒。 在大多數情況下,試樣的選定區域進行計數,並將結果乘以在感興趣的整個區域上以得到定量結果。 其中最常見的計數應用需要米勒掩模版(圖6(b)),其使操作者能夠確定顆粒的數目在的小正方形1,然後將結果乘以計算出包含在所述顆粒的總數量分劃板的界限。 米勒光罩也是有用的,以大的比例比較小的顆粒中的樣品。 惠普爾光罩(圖6(c))相類似的設計的米勒光罩,但目的是使更小的試樣的特性的測量(顏料分散體,膠體顆粒,灰塵和細菌)。 專為隨機分析與體視學(從二維樣本推導三維數據的科學)光罩可在幾個流行的設計(圖6(d)就是一個例子)。

圓和角標線(通過6(小時)如圖6(e)條),可在設計範圍廣泛,以容納大量的測量要求。同心圓形光罩(圖6(e)條)被用來進行二維測量類似於那些越過規模線性光罩進行。 然而,在這種情況下,(通常為圓形)的試樣的中心被放置到與分劃板的中心重合。 類似光罩以各種各樣的組合(圖6(f)到圖6(H)),用於估計弧,角度和半徑刻有量角器,軌距尺寸,和參考點。 有些光罩(圖6(f)條)同時包含對標本的功能同時測量線性和角度的規則。這些測量光罩的典型標本磨料,化肥,纖維,細小的灰塵,顏料,植物種子,煤炭矽石,砂粒,土粒,和類似的粒子。

在半導體工業中,對掩模及矽片微觀特征的尺寸和位置是要製造組裝線的關鍵。 線寬的標準是用於維持在不同的植物在遠程位置進行測量之間的一致性的校準標準(階段微米)。 確定尺寸的鈉鈣玻璃板上塗有具有110和130納米,2.6和3.4之間的光密度之間的厚度的防反射鉻。 在標準的中心是一個明確的矩形測量4×5毫米,隨著不良貸款的字母(縮寫為國家物理實驗室在特丁頓,英格蘭),使易於識別的板中心。 線寬設置在8圖案分組組成的具有標稱寬度範圍從0.25至10微米的不透明和清晰的線條。

另一類階段微米,這是受歡迎的和經常使用的目標校準進行定量顯微鏡,是設計用於測量顯微鏡的光學係統的性能分辨率目標。 分辨率目標由含有正極,負極和/或半透明的圖案分組,通常排列為多個行,並具有不同的寬度和長度的數字或在測試分自定義布局。 一個高性能的顯微鏡物鏡的分辨能力往往可以準確地估計縝密偵查從合適的分辨率目標取得的成果。

包括在舞台微米的大類是校準的秤(前麵已經詳細討論),取景標線,並計數室(見圖7)。取景掩模版被用於定位的上一個樣本的感興趣區域,同時計數室被設計成使顆粒和細胞計數中的液體的特定體積。 計數室被廣泛使用,用於計數的血細胞和精子,並且包括具有中心拋光厚的載玻片(圖7)的和排除的平台。 該平台被定位在短距離(一般為0.1毫米)的下方雙拋光蓋玻片支持,以創建可以被填充有流體的精確數量的腔室。 在實踐中,一個幹淨的玻璃蓋玻片放置在所述腔室和中心定位在拋光支撐。 該裁定計數平台和蓋玻片之間的差距等於100微米,和被統治(刻)麵分為確切尺寸的平方。 其結果是,該液體放置在所述腔室的容積可以很容易地計算,得到每單位體積的粒子(細胞)中的懸浮液的數量的精確分析。

最常見的類型計數室中,其目的是用於計數血細胞,被稱為血細胞計數器 (參見圖7)。 幾種不同的血球網格圖案是由製造商提供,但大多數包含一個大的正方形邊界細分成更小的正方形,以協助計數。 Hemacytometers通常用於計數和測量的顆粒大於約50至100微米以下。 通常,要被計數的樣品必須精確地稀釋係列稀釋移液管填充計數室,以避免過多的微粒,可以是難以計數之前。 每個小方5〜10顆粒的顆粒密度被認為是最佳的濃度進行定量分析。

絲狀目鏡測微

標準目鏡標線片,當用精密微尺結合,提供了一種快速,方便,準確進行測量的顯微鏡裝置。然而,對於更容易和更精確的測量(具有更大的客觀性),一個專門的遊標測微目鏡,被稱為絲狀目鏡測微尺 ,通常被認為是必不可少的。 這個特殊的測微目鏡采用同樣的原則作為一個標準的目鏡和分劃板的組合,但除了固定或移動刻度尺定位在焦平麵上設有可移動的行規則(或行規則組)。 該絲襪微米避免了需要估計一個部門的分數上一個階段微米(一個困難和主觀機動),從而導致較大誤差。

在一個絲襪微米的移動線的規則組的目的是跨視場來翻譯,遍曆一個固定副尺刻度,通過一個由旋轉的外筒操作的精密絲杠機構的手段。 在一般的應用中,一個單一的規則或其它參考點(取決於特定的設計)對準樣品特征的一端到被測量和校準滾筒的讀數悉。 滾筒被旋轉移動至整個樣品特征的參考線,和一個第二讀取在鼓的規模。 兩個讀數之間的差值得出樣品特征測量一個明顯的線性尺寸,並且當與鏡台測微計進行校準,使一個絕對確定的特征尺寸。

一些絲襪微米設計變化由外筒,其允許所述滾筒規模為調零後的基準線被定位在對象的要測量的第一邊緣包括掩模版尺度的額外運動。 此功能使每個測量開始與感光鼓上的刻度為零,並且避免了確定兩個滾筒讀數的差的必要性。 對於大多數絲襪微米,主要光罩尺寸為10毫米的行駛距離。 規模也分為100刻度與各部門代表0.1毫米。 測微螺旋鼓也被分成100的間隔,從而使感光鼓師之一間隔對應於0.1間隔目鏡規模。 鼓滿旋轉平移整個目鏡規模的一個間隔的測量規則(行)。

一些現代化的絲襪目鏡測微尺樣式包含一個內部變焦鏡頭係統,簡化了千分尺校準與不同的目標。 目鏡的下部包含一個刻度圈可旋轉到光學改變有效管長,以疊加的微尺的刻度直接到絲襪微米的內部尺度。

軸向線性測量

標本深度的測量,同時在顯微鏡的光(或z)的軸,可以用顯微鏡具有刻度精細聚焦旋鈕來進行。 在此之前進行軸向測量,各部門對畢業調焦旋鈕的值必須確定。 在許多情況下,製造商可以提供這樣的信息,但是它也可以用玻璃蓋玻片實驗測得的。 仔細測量蓋玻片厚度與機械師的千分尺或卡尺(盡可能準確),然後放置在蓋玻片的每一側的標記用氈尖筆,奠定它到一個標準的顯微鏡載玻片的表麵。 專注於標誌放置在蓋玻片上表麵,並注意微調對焦旋鈕刻度相對於參考點的位置。 找到並專注於下表麵標記,並再次記錄精細調焦旋鈕的位置。 對應於精細調焦旋鈕的各部門的軸向距離等於玻璃蓋通過遍曆從頂部至蓋玻片的底部旋鈕刻度的總數除以厚度(微米)。

為了測量樣品的軸向尺寸,感興趣的特征是位於視場和在顯微鏡聚焦在試樣的底表麵。 合焦後,對焦旋鈕的確切位置被記錄下來。 接著,焦點被移動到上部的樣品表麵和新的調焦旋鈕的值,然後從從成像的底表麵獲得的1減去。 試樣尺寸可以通過上麵所討論的,或由製造商提供的校準因子相乘的調焦旋鈕的增量的數量來計算。

軸向測量是通過現場的波動,這部分是由物鏡的數值孔徑和放大倍數確定的樣本深度複雜。幾個額外的因素,其中必須解決的問題,是折射工件和球麵像差時顯著厚度的試樣,通過水溶液或具有不均勻的折射率等(安裝)介質進行成像,往往會發生。 還應當指出的是軸向測量相結合耦合到所述主觀判斷的最佳樣本集中一個微米尺度的定量分析。 出於這個原因,許多顯微鏡不要依賴這種技術進行精確測量。

結論

即使是采取在操作顯微鏡,並在用於進行測量光罩的校準一個顯著量的護理,有錯誤的幾種可能的來源,可以影響校準過程中,以及對樣品的特性的實際測量值。 使用鏡台測微計校準目鏡分劃板時的一個重要考慮因素是包括許多舞台微米刻度盡可能在計算的。 這將最大限度地減少由於變化的各個刻度間隔,除了潛在的錯誤中準確地確定各行的邊緣誤差。 校準高倍物鏡時,因為較少的刻度可以同時成像在顯微鏡視場平均在多個間隔成問題。 這是從來沒有建議單靠一個10微米劃分的準確性,因為各個刻度的寬度可以預期,從一個跨度略有不同到另一個。

刻度上的階段微米的質量有對與該校準可進行高精度的顯著作用,這一點尤其是在高放大倍率。 如前麵所述,通過諸如薄膜沉積過程中產生微米通常具有更好的定義的邊緣更精細的線條比那些照相產生的,並且能夠提供更高的準確度和精確度。 照相製作微米尺度是比較經濟,但線條,再加上線條之間隨機分布的孤立銀顆粒發生的毛邊,使這種微米不適用於精確的測量。

可發生測量誤差,如果采用有字段或圖像失真的顯著曲率的目標進行測量。 擁有現代化的目標,這種錯誤的來源並不像它在過去是常見,但是,它仍然是最好盡可能使用平場或計劃目標。 如果必須使用具有某些字段失真客觀,限製測量的視場的中心部分將減少測量誤差。

在測量問題也可以由於難以精確地對準目鏡標線片線與用於校正的階段微米的發生。 一個高精度,畢業機械階段(參見圖9)可以被用來使該過程更容易完成。 現代畢業於階段裁定以毫米為單位的兩個軸並包含verniers翻譯讀數至0.1毫米。 這些階段都相當適合在xy方向的大(超過幾個毫米)測量。

這兩個尺度(分劃板和鏡台測微計)被成像為急劇盡可能它是至關重要的,並且如前麵所說,它是優選的,因為可以在視圖中為校準場可以觀察到利用階段微米的許多部門。 目鏡標線片與測微計的線的對準要始終從階段微米線的規則相同的邊緣進行,而不是在中心處(不能被再現地識別)。

這應該被視為測量誤差的潛在來源的一個重要因素是參與設定的基準線在一個試樣特征的邊緣的主觀性。 它應該在牢記的是,在顯微鏡下進行的測量,利用試樣和未檢體本身的光學圖像。 在成像中使用的對比機製,光源的類型,質量,和數值孔徑與物鏡的其它性質都影響樣品的外觀特征邊從該測量通常采取。 此外,如果衍射文物存在的形象,特征的選擇對測量基準線的邊緣位置可以是高度不確定的。

使用數字成像或傳統顯微攝影技術,線性試樣尺寸可以通過直接測量的具體特點和比較的鏡台測微計在同一放大倍數的圖像來確定。 例如,拍攝了10倍的目標的試樣可以通過在相同的放大倍數連續地獲取階段微米的第二照片來測量。 用一把尺子或類似測量裝置,該顯微鏡可以再直接測量試樣的功能和使用階段微米的照片計算出尺寸。 該技術對於數字圖像,其中計算機軟件可以被用來代替一個標尺與一台測微尺比較樣本圖像時,兩個圖像被捕獲在相同的像素分辨率同樣有用。

在不透明物體的測量,圖像的亮度在從明亮的背景上以深色樣品的過渡主觀評估可能會導致錯誤識別下與各種照明條件下所發生的不同強度梯度的尖銳邊緣。 這是很難解釋所有的實際顯微鏡錯誤的可能來源,但潛在的缺陷的認識可以幫助防止大的錯誤或不一致,比較已經由使用不同的儀器的技術和設備進行測量時尤其如此。



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