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徠卡顯微鏡,相幹反斯托克斯拉曼散射顯微與細膩樣品成像

2014-01-02  發布者:admin 

 熒光顯微鏡假定在細胞生物學中的關鍵作用,一旦有可能通過熒光染料選擇性地染色的細胞成分。一個有針對性的染色,保羅·埃爾利希的第一個探險家,有想法的東西,專門汙漬也應該殺了明確 - 這是與術語“靈丹妙藥”,化療的基本思想有關。他的研究小組發現灑爾佛散,抗梅毒藥物量身定做 - 雖然不夠具體,沒有造成重大的副作用。篩選許多熒光染料導致染色這是在組織學使用,包括像染料DAPI或蘇木精伊紅一長串。

在具體的染色革命發起的引入抗體介導的免疫組化染色和DNA雜交為基礎的染色。這允許一個單一的蛋白質或DNA序列被龐大而無法與經典的化學染料分化的化學性質相似的分子背景高亮顯示。在這方麵,最近的重要進展已取得的熒光蛋白。這些被引入到染色的結構,分子與細胞或在傳感器為代謝物,離子和其它物種中的活細胞和有機體,以提供用於觀察生命的機械的一個窗口被用於 - 在實時模式。然而,所有這些染色程序涉及更多或更少侵入性的幹預措施,並要求在許多情況下死亡或固定的準備工作。此外,該熒光蛋白的方法取決於外源蛋白在靶細胞中表達,通常顯著與在細胞中的靈敏調節穩態幹擾。因此,方法進行了探索,使笨重的樣品的成像沒有任何汙染。

圖1:左:本土化研究和檔次脂質在不同類型的巨噬細胞積聚的:脂類綠色,63×物鏡顯示為紅色,肌動蛋白。來自:Alba Alfonso Garcia and Jeff Suhalim 美國加州大學Potma實驗室。細胞:阿德爾海德求Kratzer博士,醫學係肺科和臨界指數的護理,科羅拉多大學。右:兩個錄音從三明治醬疊加圖像:脂質顯示為紅色,水綠色,25倍的目標,比例尺為25μm。

 
圖2:散射過程。Y:瑞利散射。S:斯托克斯散射。答:反斯托克斯散射。(G:基態與振動子狀態,E:激發態與子狀態,V:虛擬狀態)。

瑞利和拉曼散射

光能夠與物質不僅通過吸收光子接著分子假設較高激發態相互作用,而且還通過假設所謂的“虛態”。在這種情況下,光子不具有能量量子能適合任何給定的分子中的狀態的差異。出於這個原因,所釋放的光子不斯托克斯位移,因為沒有熱子狀態係列中的虛擬狀態,可能導致排放轉移到紅(熒光,激發態先迅速放鬆到的最低振動子狀態興奮狀態,釋放熱能而離開發射的光子具有較少的能量 - 偏紅色調)。在正常條件下散射,入射和散射光子,因此具有相同的能量,這是相同的顏色,並且不能從相互作用的分子,攜帶任何特定信息。此標準的情況下被稱為“瑞利散射”(圖2:Y)。

然而,有一種可能性,發射不覆蓋整個跨度到該分子的最低振動狀態,但是,例如,能量隻返回到第一熱狀態。在這種情況下,所發射的光子不僅缺乏的是熱態的能量差到基態。發射紅移。這種現象被稱為拉曼散射(這裏,斯托克斯散射,參見下麵的替代方案,圖2:S)。因為這些子狀態的能量差是非常特異的分子結構,事件和釋放的光子之間的能量差表明,在與光相互作用的化合物的詳情。因此,拉曼光譜已成為分析化學一個非常有用的工具。另外,該分子可能隻是碰巧居住在振動狀態(這在一定程度上會發生,即使在環境溫度)。在此情況下,在照明的虛擬狀態是更高相比上麵所討論的例子。作為發射後的分子通常會假定為最低能量,散射光子具有更高的能量大於入射光子。這被稱為反斯托克斯散射(圖2:A)。這兩個過程很少發生;斯托克斯過程約10 -3 -10 -4小於瑞利過程倍,且反斯托克斯過程甚至一個或兩個數量級低於。對於成像,自發拉曼散射的效率是迄今為止太低,以產生合理的時間內足夠的信號。

 
圖3:一個反斯托克斯拉曼信號,以產生足夠的信號用於化學成像的擴增。詳細信息請參見正文。

反斯托克斯拉曼信號的放大

為了產生拉曼光子的強度的有用的,這是必要的,人為地增加的第一振動狀態的人口。當達到這一目的,許多光子會散發在反斯托克斯波長,產生可測量的信號。

為了實現這一目標,強烈紅外光束(泵浦光束)最初通過使用標準脈衝高功率紅外激光聚焦到樣品上。這束將促進許多虛擬狀態中分子的集合體。為了避免他們的回歸到零振動能級,第二束照射(探測光),刺激從虛擬狀態的回歸,就像一個STED光束返回激發態到基態。如果第二光束被調諧到與第一振動狀態(表示該能量必須泵浦光束和振動能量的差)完全匹配,則該分子將不承擔零電平處於基態。因此,許多分子中的焦點已經晉升到振動狀態。第二激光器是可調諧紅外激光,和現代係統使用的複合設備,提供同軸兩種波長。

這兩個過程或多或少同時發生。兩種波長需要照射樣本。因此,當泵浦光束仍是上,所述分子可以假設較高的虛擬狀態下,從第一振動基態開始關閉。他們將在這個虛擬的狀態放鬆到基態的零子狀態,從而發射出光子能量高於泵束的高。所不同的是第一熱狀態完全相同的能量。所有AG亚游集团需要做的就是收集這些散射光,並從泵和探測光束分開。這是沒有必要的,以適應發射帶通濾波器的反斯托克斯波長,作為特定信號是由填充了大量的熱狀態是特定於所討論的化合物(圖3)的製備。的特定信號是泵和探針,其具有被調諧來選擇所需的化合物之間的差異。

 

事情,AG亚游集团現在可以看到

作為熱能源關聯非常特別具有化學鍵,能夠進行本地化的樣品在不同的鍵類型。對比度是根據特定熱激發和信號將規模與化合物的濃度。CH-CH鍵高度集中於脂質雙層和其它非極性結構。因此,它可以對圖像的極性(主要是水)的背景脂質區 - 無任何熒光染色程序。這已被證明是與許多類型的樣品很成功。整個生物體,像果蠅胚胎,成蟲和組織樣本,細胞,甚至活酵母細胞變得可見,沒有任何染色過程。在具有快速掃描係統,例如,在Lei​​ca TCS SP8車的共振掃描器結合,在細胞內的秘密可以在生理條件下進行監控。食物樣本可以檢查組件的脂水分配和龐大的應用範圍是開辟了聚合物的研究和產業。



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