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徠卡顯微鏡,CARS和共聚焦

2014-01-06  發布者:admin 

 由於激光共聚焦顯微鏡的問世,科學家們已經獲得了導致生命如何工作有更深的了解了許多新的見解。 單光子和多光子共焦顯微術的最重要的缺點是需要來標記樣品。 CARS(相幹反斯托克斯拉曼光譜法)解決了這個問題,因為它是無毒的,非破壞性的,微創

染色過程有約束:染料漂白隨著時間的推移,可以是光毒性,並可能影響後續的研究方法和偽裝隨後的研究信息。 過程與彩色樣品不適合長期分析:大氣條件的破壞染料和染料改變時,在與空氣或濕氣接觸 - 任何變化的環境條件會影響試驗結果。 另外,染色過程非常耗時。 有些樣品不能被汙染可言,因為染料的熒光團或存在的連接改變了分子或生物體的功能。

相幹反斯托克斯拉曼光譜 - 技術

CARS是一個三階非線性過程,涉及到一個泵浦光束在可濕性粉劑和斯托克斯束的WS的一個頻率的頻率。 試樣是通過波混頻過程的刺激。 反斯托克斯信號πas=2πp-ΠS是相匹配的方向,在頻差振動產生相反Δν= VSP-與泵浦光與斯托克斯梁之間。 這等於振動的特定化學鍵的能量的頻率。

能量圖的造車工藝(相幹反斯托克斯拉曼光譜)。一種泵光子“激發”的分子轉換成虛擬狀態,從它被強製通過一個斯托克斯光子返回到基態的特定的振動狀態。第二PUPM光子激發到第二個虛擬狀態,從哪裏能被動地返回到基態,並發布了可檢測的CARS信號。泵和斯托克斯光束產生高人口的特定振動的狀態,這是為化學鍵的簽名。作為泵浦光束是可調的,許多不同的化學特征可用於成像。徠卡TCS SP5與共振掃描儀是用於生命細胞和整體動物CARS成像。
圖1:CARS能量圖
 
兩種顏色的CARS圖像記錄兩個不同的泵頻率。示例:霜。綠色環保:水至3150厘米1。紅色:脂肪液滴在2850 CM-1。為了避免熱運動偽影,共振掃描與徠卡TCS SP5II共聚焦顯微鏡建議。
2:在霜,覆蓋圖像脂滴的偏差。 綠色背景顯示的水(在3150厘米-1收購),而紅點是脂肪成分(在2850厘米-1收購)。

活分子分析與CARS

CARS顯微鏡的主要應用被發現在生物,製藥和皮膚病研究,生物醫學成像,食品加工和材料科學。 其潛力已被證明對各種生物醫學應用中,如脂質轉運的成像,蛋白濃度,DNA,RNA,組織在活的生物體,並且為了在液晶。 通過集成CARS技術融入現代光學掃描顯微鏡係統中,研究人員擁有最新的技術在手加上一個易於使用的共聚焦係統。

 

高分辨率圖像

在拉曼CARS圖像移動2849厘米-1這是具體的CH2伸縮振動。樣品:小鼠皮膚。儀器:徠卡TCS SP5II汽車。
 3:小鼠耳(最大投影)的皮膚,在2849厘米-1拉曼位移(對應於CH 2的伸縮振動)。 教授Sunney謝,化學係和化學生物學,哈佛大學,劍橋大學,美國的禮貌

傳統的掃描儀是用於形態學研究優化在大腦和皮膚,或亞細胞成像功能,如細胞骨架。 它允許每個圖像采樣高達8,196×8,196像素,結合來看高分辨率大視場。 此外,掃描器的速度可以適應從400赫茲到2800赫茲在雙向模式。

在皮膚表麵,對應的毛發與色球長的細絲可以看到一個非常強烈的信號,因為毛發覆蓋著油。 在皮膚表麵,一個明亮的多邊形圖案輪廓形成的皮膚的最上層時,角質層的角質細胞。 起因於細胞間隙富含脂質,膽固醇,神經酰胺和信號。 在第二層中,周圍的毛發根部明亮的結構被檢測到,皮脂腺。 他們是擠滿了包含甘油三酯和蠟酯皮脂水庫多細胞車廂。 在70-80微米表麵的細胞,脂肪細胞,含有豐富的脂肪,被發現在真皮層。 因為CARS信號隻在焦點處產生的三維成像能力被示為具有最大的突起。

 

CARS在視頻速率

共振掃描器提供了緊湊的設計和快速的畫麵記錄的好處。 當基於點照明和點觀測的真實共聚焦的概念,共振掃描器允許在雙向模式16,000赫茲頻率的速度。 在512×512像素的幀大小時,係統獲得每秒29圖象。 以較低的采樣,速度可以提高到512×32個像素的分辨率,以每秒290幀。 高時間分辨率的動態過程進行成像和測量或線掃描可以采取全速率。

施加平均提高了信號的信噪比,這在諧振掃描儀的情況下特別有用。 它有可能找到的圖像質量和采集速度之間的正確折衷,根據成像要求。 在專業設計的共焦共振掃描器的幅度是可調的,這使得它可以通過施加較小的振幅進行放大。 有了這個功能,可以集中到感興趣的區域,而在收購視頻率圖像。 泛函數 - 另一個有用的設備迅速轉移到有趣的地方,這不一定是在微觀領域的中心 - 也應該是可與共振掃描儀。

隨後CARS顯微鏡開辟了新的途徑,以可視化的基礎上固有振動特性的結構不染色或標記的標本。 試樣不從擾動由染料或光致漂白受損。 CARS打開了新的研究方法,尤其是在細胞生物學,神經科學,藥理學,皮膚科,以及醫療成像。 
 

Subcutanous脂肪層小鼠皮膚,成像與徠卡TCS SP5汽車。左:共振掃描,每秒30幀,相當於每個像素120ns的仍然提供了結構的一個很好的例證。在右邊的比較:與30的平均值,它對應於每秒1幀拍攝圖像。
4:這些CARS圖片顯示小鼠皮膚的皮下脂肪層的富含脂質的脂肪細胞。 左邊的圖像是采取共振掃描儀的全速,采集圖像以29張/秒的雙向模式的速度,即在視頻速率。 在120納秒像素的停留時間隻有幾輛車光子被檢測到,從而在嘈雜的形象。 右邊的圖像對應於平均與諧振掃描器接管30的圖像,即,對應於非諧振掃描儀的圖像質量。 教授Sunney謝,化學係和化學生物學,哈佛大學,劍橋大學,美國的禮貌
 

使CARS顯微鏡訪問

化學係的Andr​​eas Zumbusch教授,德國Konstanz大學領導的一個研究小組對物理化學。 他專注於單分子熒光光譜和顯微技術,以及對非線性光學顯微鏡的開發與應用:“許多研究領域,無論是從生命科學和材料科學的背景下,需要快速,非侵入性的成像具有高空間高分辨率,高分子特異性和靈敏度高。正如它的對比度是內在的樣品光譜特性的基礎上產生的一種光學方法,CARS顯微鏡可以提供這一切。在神經科學,例如,CARS顯微鏡可以產生影響比得上雙光子顯微鏡,不同之處在於它不依賴於引入的熒光標記物。

商業CARS顯微鏡係統的出現無疑是朝著使該技術訪問感興趣的研究人員在其應用程序中的重要一步。 有吸引力的係統概念提供離手操作,同時允許被使用的CARS顯微鏡的全部潛力“。

皮脂腺,脂肪成分通過激勵CH 2鍵結轎車的形象。圖像與徠卡TCS SP5 CARS拍攝。
 5:一隻老鼠耳未染色的皮膚。 Sebacouce腺體多細胞車廂,其中包含甘油三酯和蠟酯。 由於它們的CH 2鍵結,脂肪成分可以完美成像和CARS及導致銳利,清晰的成像效果。 教授Sunney謝,化學係和化學生物學,哈佛大學,劍橋大學,美國的禮貌 
兩個參數成像在小鼠尾部。顏色編碼綠色的F-SHG(向前二次諧波產生,一個MP-技術)和紅色的外延車(後向散射相幹反斯托克斯拉曼光譜)。 F-SHG揭示的結構特性,特別是從膠原蛋白。 EPI-CARS表明脂質分布。圖像與徠卡TCS SP5 CARS收集。
6:小鼠尾巴成像labelfree與外延車的橫截麵(反射光,紅色區域)和F-SHG(透射光,綠色區域)相結合的大約脂質和試樣的結構性質的信息。 

 



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