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尼康顯微鏡,落射熒光照明

2014-01-08  發布者:admin 

 直到最近,熒光照明隻有在配備專門的高數值孔徑物鏡究級複合顯微鏡可用的選項。 需要對這種技術在立體顯微鏡已經升級,推出基因編碼和特定的生物熒光蛋白如GFP(綠色熒光蛋白)的。

立體顯微鏡的觀察GFP的應用程序現在如此普遍,立體聲熒光照明器更經常被稱為GFP的照明 ,即使它們可以用於在生命科學和電子製造行業既許多其他應用。 大的標本,如幼蟲,線蟲,斑馬魚,卵母細胞,和成熟的昆蟲可以容易地選擇和操縱的時候都標記有綠色熒光蛋白和熒光技術的照明係統。 熒光照明揭示其生物體產生熒光蛋白和立體視覺連接到的觀點和充足的工作距離大字段允許觀察員進行實驗,鑷子,吸管,或顯微操作。 其他更傳統,標本也很容易觀察到,用體視顯微鏡熒光照明記錄。

上的方式,類似於那些在更為複雜的複合顯微鏡采用體視顯微鏡功能照明的落射熒光。 通常情況下,熒光照明器包括包含在經由中間管連接到顯微鏡的外部燈箱氙或汞弧燈(或垂直照明 ,參見圖1和圖2)定位在所述顯微鏡放大的身體和觀測管之間。 這種類型的照明目前僅限於使用共同的主要物鏡(CMO)的立體顯微鏡的應用程序,因為它使用市售的部分,以適應一個格裏諾或收斂型體視顯微鏡熒光照明是不可能的。

由弧光燈產生的光通過一個可調節集光透鏡引導至容納在組合過濾器塊中的激發濾光器(如示於圖2和圖3),它允許具有特定波長範圍(或帶通)僅光通過。 經過濾的光,然後通過顯微鏡成像路徑的顯微鏡(放大體和在體視顯微鏡物鏡)的下部和上試樣通過一個二色鏡,這也是調諧選擇性地過濾,反射和/或發射一個特定的偏轉設定波長區域。 術語二色性 (或二向色性 )指的是過濾器或反射鏡的反射由下麵指定的波長的顏色的限製,同時發送上述限製那些波長的兩個色彩範圍之間進行區分的能力。

聚焦的激發光通過顯微鏡放大體和物鏡,在那裏形成照明的倒置錐體該沐浴標本,令人興奮的任何所存在並具有對應於激發波長的帶通範圍內的吸收帶的熒光通過。 從樣品發射的二次熒光發射(通常為更長的波長比激發光)是由立體顯微鏡的共同的主要物鏡捕獲並通過變焦機構,以阻擋濾光器直接返回該塊的激發波長,並且隻允許發射波長的選定區域通過。 顯微鏡主體管在圖1和2被構造成使得回傳通過左,右放大的光信道波長更長的熒光發射的光在到達落射熒光照明器之前獨立地聚焦。 從左邊的信道的光直接穿過的屏障過濾器被定向到的觀測管或到相機端口之前。 與此相反,光從右側通道第一行進回通過二色鏡,然後在阻擋濾波器和目鏡。 此燈沒有一個通路到相機端口,並且隻能用於觀察標本。

熒光濾光器組合塊的結構細節在圖2和圖3。 每個塊包含一個單一的激發濾光器,兩個阻擋過濾器和一個二色鏡。 由汞弧燈產生的光入射到塊通過激發濾光片,由二色鏡的表麵反射,如上麵所討論和圖3所示。 次級熒光發射通過屏障過濾器通過。 激發濾光器,二色鏡,和用於左聲道的屏障過濾器是粘到的地方,但在阻擋濾波器用於右聲道被安裝在一個小的幀,可以從塊鬆開一組固定螺釘被刪除。 卸下屏障過濾器框架允許訪問的二色鏡設置在過濾器塊的內部。當塗膠更換過濾成塊,注意不要鋪膠附著在過濾器表麵,不要按住過濾器或雙色鏡沒戴手套的手,以避免汙染與油膩指紋的表麵。

熒光垂直照明可同時容納三濾塊和一個直徑過濾器偽字(不含過濾器),使正常的明場觀察。 濾波器塊被安裝在一個滑動齒條,並且可以由被利用來控製齒條位置的杆的裝置被插入到光路中。 每個塊具有可插入的槽上按順序以使操作者能夠容易地選擇用於熒光觀察的正確塊的照明器外部殼體伴隨的標識牌。

目前,尼康提供了一個溫和的陣容過濾器的組合,其中列於表1。 這些過濾器涵蓋範圍廣泛的熒光激發和發射條件,並且應該是許多生物學研究中常用的熒光探針有用的。 該過濾器的組合也適合於工業應用,如檢查通過熒光照片集成電路晶片的汙染的抗蝕劑的聚合物。 熒光探針,激發波長380和510納米之間的範圍可以通過選擇合適的激發/發射過濾器組合(見表1)予以確認。 該過濾器的組合也可用於研究使用各種綠色熒光蛋白的突變體,包括青色和藍色版本相當有用的。

在活具有熒光蛋白標記細胞培養物中,信號強度可以被顯著當過濾器組合被審慎相匹配的熒光團的激發和發射輪廓改善。 例如,在DS-紅信號,視覺和圖像傳感器檢測的紅色熒光的情況下,可以顯著地由紅色信號轉移到更橙色發射的提高。 此外,專為具有葉綠素強烈的自發熒光背景輻射的植物標本過濾器組合常常受益於謹嚴選擇的過濾器規格就相應的信號發射。 顯微鏡工程師采取許多這些設計標準納入考慮時,他們優化的波長帶通區域的立體過濾器組合。

體視顯微鏡熒光濾光片組合
濾鏡套裝 激勵 
波長範圍
分色鏡 發射 
波長範圍
Blue GFP/DAPI 379-401nm 420 nm (DCLP) 435-485nm
Cyan (EGFP) GFP 426-446nm 455(DCLP) 460-500nm
Endow GFP Bandpass HQ 450-490 nm Q 495(LP) 500-550nm
Endow GFP Long Pass HQ 450-490 nm Q 495(LP) 500nm(LP)
TRITC(DsRed HQ 530-560 nm Q 570(LP) 590-650nm
Yellow GFP Bandpass HQ 490-510 nm Q 515(LP) 520-550nm
表1

與其它敏感幹涉濾光片,所述組合塊過濾器將隨時間暴露於高強度的光及紫外線的波長惡化。特性,如帶通頻率和透射數值也將受到影響,如果過濾器被暴露在高濕度的條件。 為了增加這些過濾器的使用壽命,應保存在幹燥器中或含幹燥劑的密封容器中。 此外,減少時間的光被通過保持照明快門穿過過濾器的金額關閉時的標本沒有被直接觀測或拍攝用數碼或膠片相機係統。 該濾波器隻能用從耳朵氣球,軟camelhair刷,或無油的加壓氣瓶的幹燥空氣進行清潔。 永遠不要試圖擦拭過濾器的表麵與鏡頭紙,以避免造成劃傷或擦傷進入軟幹擾塗層。

各式各樣的標本可以在熒光照明成像用立體顯微鏡,如尼康SMZ1500。 隨著0.5倍1.6倍,通過與15倍變焦範圍物鏡放大倍率,顯微鏡能夠提供4倍的總放大倍率廣度540X,采取立體顯微鏡觀察範圍成經典複式顯微鏡的。 放大這個很大的自由度使顯微鏡圖像兩個大客廳標本和存在於熒光標記的被安裝在顯微鏡玻片上薄切片微小的細節。 在高倍率範圍內的熒光觀察的例子示於圖4為小鼠腎組織的三重標記的厚部。 將試樣用DAPI標記的Alexa Fluor 488的WGA,和Alexa Fluor 568(的的Alexa Fluor探針和樣品購自Molecular Probes公司獲得),並使用表1中列出了三個過濾器的組合進行成像: 藍綠色熒光蛋白/ DAPI,賦予GFP的帶通 ,和TRITC紅色熒光蛋白 。 此圖片清楚地說明了熒光立體顯微鏡的高倍率能力,觀察原先的複合顯微鏡製備標本。

其他體視顯微鏡製造商提供的熒光激發和觀測的替代照明策略。 最流行的配置,如圖5所示,包括一個外部途徑的熒光激發,不利用顯微鏡的成像光學係統 從電弧燈箱照明是通過激發濾光片首先通過,然後通過設置在主顯微鏡主體後部的管引導。 在管的下部裝有一個透鏡係統,指示激發波長到標本。 此配置可確保光線被直接引導到標本在所有放大倍率變焦位置,提供一個均勻深色背景在所有放大倍率同樣強烈的熒光照明。

從標記的樣品次級熒光發射是由共同的主要物鏡(圖5)捕獲並通過變焦頻道和成一組定位在所述顯微鏡頭屏障過濾器通過。 從那裏,光被引導到目鏡直接觀察或成攝像管用於數字成像或顯微攝影。 這種結構的主要優點是由於缺乏對二色性反射鏡的需求,以及一個獨立的從預先配置的過濾器的組合塊,其允許在過濾器選擇的研究者稍寬緯度。 但是,配置也可導致無經驗的運營商誰試圖觀察標本不正確的過濾器組合錯誤。

通過汞弧光燈產生和利用作為在熒光顯微鏡激發源的強烈的紫外線輻射可能損壞觀察者的眼睛的視網膜上。 為了避免這種情況,許多顯微鏡製造商包括能過濾紫外線沐浴在顯微鏡載物台標本在顯微鏡體保護裝置。 其他的安全預防措施,包括在觀察路徑和周圍的燈箱雜散光防護紫外線阻隔過濾器。 此外,虛擬運營商過濾器經常插入滑塊和設計的熒光幹涉濾光片旋轉框無人居住的過濾器的位置。

熒光立體顯微鏡通常配有一個光停止定位在汞燈箱和垂直照明器來阻止來自燈有害的紫外線輻射時,試樣不被觀察或成像之間的某處。 這個站應該總是被插入到光路中時,觀察不被進行。

反射,或熱點可以在熒光立體顯微鏡使用較高的放大倍數複消色差物鏡(1.6倍至2.0倍),觀察試樣時出現在視場的下部。 這神器通常是唯一可見在較低的縮放比率,往往消失時的變焦倍數增加。 在大多數情況下,反射性​​的問題不與較低倍物鏡(0.5倍和1.0倍)發生,而不管光學校正因子,並且通常是從低級校正(消色差透鏡和平場消色差透鏡)的高倍率物鏡缺席。

存在範圍廣泛的用於利用立體顯微鏡熒光勘測應用中,如在表2中給出。 的受益於該觀察模式標本的數量是相當大的,涵蓋廣泛的學科範圍包括從生物領域的工業製造商。

熒光立體顯微鏡應用
領域 應用
生物學 基因表達,細胞分選,解剖,發育過程,眼睛和肌肉調查
植物學 植物細胞,組織自發熒光,土壤樣品和寄生蟲
藥理 微板流,藥物和ELI觀察
水文學 水質,細胞結構和濾膜分析
農學 種子觀察,基因表達,並Transgenetics
電子 錫膏,環氧樹脂分析,監控塗料,聚合物鑄件集成電路
半導體 光致抗蝕劑汙染,雜質顆粒,過程中的誤區
聚合物 雜質顆粒,空洞,珠分析,非聚合的區域
金工 裂縫和表麵缺陷,汙染,焊接控製,斷裂分析
物料 裂紋,焊縫,碳鍵,骨折,研究方向
造紙 光纖塗料和夾雜物
取證 紡織纖維,體液,指紋,銀行票據,偽造
表2

熒光觀察的立體顯微鏡相比,由經典複式顯微鏡呈現的視圖提供的三維觀測的獨特屬性。 此外,更大的工作距離和場由立體技術得到的深度使之視圖和更強烈的熒光更寬的全景字段。這些功能都是巨大的利益調查誰正試圖處理大量的生物標本和材料的技術人員正在開展前期準備工作,如嵌入,電子檢查,或切割。 隨著越來越多的明確定義的過濾器組合成為可用於專業應用,在立體顯微鏡采用熒光應繼續攀升。



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