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尼康顯微鏡的激光共聚焦顯微鏡原理

2014-02-28  發布者:admin 

 激光共聚焦掃描顯微技術(Confocal laser scanning microscopy)是一種高分辨率的顯微成像技術。普通的熒光光學顯微鏡在對較厚的標本(例如細胞)進行觀察時,來自觀察點鄰近區域的熒光會對結構的分辨率形成較大的幹擾。共聚焦顯微技術的關鍵點在於,每次隻對空間上的一個點(焦點)進行成像,再通過計算機控製的一點一點的掃描形成標本的二維或者三維圖象。在此過程中,來自焦點以外的光信號不會對圖像形成幹擾,從而大大提高了顯微圖象的清晰度和細節分辨能力。

 
圖1. 共聚焦顯微鏡簡化原理圖

圖1是一般共聚焦顯微鏡的工作原理示意圖。用於激發熒光的激光束(Laser)透過入射小孔(light source pinhole)被二向色鏡(Dichroic mirror)反射,通過顯微物鏡(Objective lens)匯聚後入射於待觀察的標本(specimen)內部焦點(focal point)處。激光照射所產生的熒光(fluorescence light)和少量反射激光一起,被物鏡重新收集後送往二向色鏡。其中攜帶圖像信息的熒光由於波長比較長,直接通過二向色鏡並透過出射小孔(Detection pinhole)到達光電探測器(Detector)(通常是光電倍增管(PMT)或是雪崩光電二極管(APD)),變成電信號後送入計算機。而由於二向色鏡的分光作用,殘餘的激光則被二向色鏡反射,不會被探測到。
 
圖2. 探測針孔的作用示意圖
 
圖2解釋了出射小孔所起到的作用:隻有焦平麵上的點所發出的光才能透過出射小孔;焦平麵以外的點所發出的光線在出射小孔平麵是離焦的,絕大部分無法通過中心的小孔。因此,焦平麵上的觀察目標點呈現亮色,而非觀察點則作為背景呈現黑色,反差增加,圖像清晰。在成像過程中,出射小孔的位置始終與顯微物鏡的焦點(focal point)是一一對應的關係(共軛conjugate),因而被稱為共聚焦(con-focal)顯微技術。 共聚焦顯微技術是由美國科學家馬文•閔斯基(Marvin Minsky)發明的;他於1957年就為該技術申請了專利。但是直到八十年代後期,由於激光研究的長足進步,才使得激光共聚焦掃描顯微技術(CLSM)成為了一種成熟的技術。
 
圖3. 激光共聚焦顯微鏡原理框圖
 
當今的激光共聚焦顯微鏡已經發展為一種結合了激光技術,顯微光學,自動控製和圖像處理等多種尖端科研成果的高技術工具。是現代微觀研究領域不可缺少的利器之一。Nikon秉承“信賴與創造”的一貫企業理念,正在為業界提供世界領先水平的共聚焦顯微鏡係統產品。
 
圖4. Nikon新一代A1激光共聚焦顯微鏡係統

 



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