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徠卡顯微鏡激發共聚焦

2014-03-10  發布者:admin 

 熒光激發需要專門的彩色光:它應該有效地激發探頭(接近激發最大值),但留出空間,收集沒有蔓延到檢測路徑的排放。 在激光共聚焦顯微鏡,是用經典的多行激光或激光“電池”。 這種安排需要挑選所需的線,適合當前使用的熒光裝置。 強度控製是必須完成的另一項任務 - 最激光器將顯示增加的噪聲強度時,是在源頭直接控製。 的聲光可調諧濾波器的引入簡化了過濾,並在同一時間顯著改善的靈活性。

濾光輪 - 早期的方法

光源,用於在共聚焦顯微鏡熒光激發是激光器或激光器具有不同顏色的組合。激光器用於技術原因。 不幸的是,傳統的激光器發射出通常隻有一個單一的波長,或隻有幾行(一個現代化的解決方案是白光激光器)。 然而,用在生物醫學成像表演激發帶在近紫外和近紅外的光譜中的任何地方熒光染料。 在大多數情況下,有必要從幾個不同的熒光染料在同一時間拍攝的排放。 為了完成這個任務,一係列的激光束是由二向色鏡組合。 在這種情況下,反射鏡采用的是逆模式相比,“分束器”分隔的激發和發射光的熒光照明。(本文來源:徠卡顯微鏡激發共聚焦

由於激光器一般有低噪音運行一個可比窄帶,這是不可取的,直接由激光功率控製力度。 因此,一個設備是必要的,使激光強度來單獨地衰減。 類似地,如果源被關斷激光壽命將減少,並且在許多次。 氣體激光器特別是不要在高溫下承受功率時仍。

一個典型的實現所有這些要求是“激光電池”,由一係列激光(一般為3〜5)。 所有激光器都配備了驅動機電和控製軟件的光閘。 所有的激光器需要一種伺服控製裝置 - 用於衰減 - 一個車輪或滑塊與灰色濾波器的序列。 多行激光器需要在另外一個滾輪或滑塊的,它包含了一係列的邊緣和帶通濾波器,以挑線單行或組合。

很顯然,整個安裝程序可以變得稍微拜占庭,很容易出現偏差和漂移的問題,它可能會在過濾器選擇引進的機械振動。 這也是很慢的時候光照製度需要進行修改,並且由於適合在滾輪或滑塊過濾器數量有限,設備也很靈活。

激光用電池,因為在早期的共聚焦顯微鏡出台,如徠卡激光共聚焦顯微鏡和徠卡TCS 4D。該係統是相當不靈活,較一AOTF的解決方案,是非常優雅由雇用產生超連續譜的設備,如徠卡TCS SPX白光激光(WLL)係統實施的最新進展所取代。

1:古典“激光電池”5激光管,5機械光閘,8組束鏡,5衰減濾光輪和1線選擇濾光輪為多參數共聚焦顯微鏡

 

聲光可調濾光器 - 操作方法

簡化的機械安裝和數量級增加靈活性顯著步驟是一個聲光濾波器(AOTF)的實施情況。 基本上,一個AOTF是一種裝置,使得所需的顏色來進行控製,以指向不同的方向,而顏色的其餘部分直接通過AOTF中。 的AOTF是由一個晶體,通常TEO 2,SiO 2等或其它化合物具有類似性質。 該晶體是由一種機械波在幾百MHz範圍內通過機械換能器(術語“聲波”指的是機械波,雖然頻率沒有達到AG亚游集团所標記為可聽見的聲學)激發。 最重要的是,在該期望的光束被偏轉的方向是固定的,並且不依賴於光的顏色。 和作為一個額外的好處,光的,應該在被請求的方向指向的量是可控的機械波的幅度。

在與(準直)的激光線的各種波長的,由“激光電池”的規定的照射下,AOTF使被拾起並針對所請求的方向上的充分強度的任何所需部分的任何線路。 因此能夠真正同時選擇多個行。 數量主要取決於電子設備的數量一個是準備投資。 體麵的係統同時提供8行。

總體而言,AOTF完全取代了單晶的機械固定在上述所有的百葉窗,衰減器和行選擇器。 行的任何組合是很容易選擇的,當該激光電池提供總共8條線,組合的數量達到256 - 而不是與AOTF問題。 加:每個選定的線路是在強度無級控製。 在本質上,AOTF是一個“8通道激光調光器”。

工程師們可能會說,AOTF指示不同方向的兩個偏振模。 這是完全正確的,但不損害概念。 激光器反正偏振光,因此光將始終指向所希望的方向。 垂直方向將保持空的,沒有任何後果。

與傳統的激光組合組合AOTF完全取代所有的光閘,衰減器和行選擇器。徠卡首先介紹了AOTF的共聚焦顯微鏡係統於1992年。配備聲光濾波器的第一個係統是徠卡TCS 4D,標誌著徠卡在激光共聚焦顯微鏡光譜革命,終於在2007年四舍五入的白光激光徠卡TCS SPX的開始。

 2:聲光濾波器(盒右側)取代了傳統的電池激光共聚焦照明所有的百葉窗,衰減器和行選擇器。 任何輸入AOTF的線路可以被抑製,減弱或用於在共聚焦顯微鏡使用完全傳送。 由激光器發出的線的任何組合可以被組合(一個非​​常高的,雖然組合有限數量)。

 

AOTF - 免費額外的好處

感興趣區域的掃描第一次成為可能引進AOTF共聚焦顯微鏡。徠卡TCS 4D是第一個AOBS共聚焦。在感興趣區域的掃描模式下,激光被迅速切換(在幾個像素,這取決於設置),以“漆”具有不同的顏色組合的激光照射任意或幾何圖案。
3:掃描感興趣區域用不同的激光線或同一行的不同強度。 在逐行掃描中,照明政權在預設點根據預定義的模式改變。 的任意組合是可能的,在幾乎任何圖案,這是由手帶圖形光標繪製到一個預掃描圖象。 當然,幾何圖案可被施加,以及(矩形,圓形,橢圓形...)。“零線”也是一個圖案,並經常用於保護背景細胞在細胞培養物。 

除了明顯的好處,即AOBS允許任何激光器組合,該特定樣品中適合的熒光染料的組合物,它具有進一步的好處。 讓AG亚游集团假定該標本染色用兩種不同的熒光染料,是一個非常強有​​力的和其他的相當弱。 在這裏,無級亮度調整使得熒光發射,以便在類似的強度由調光激發的染料鮮豔,記錄兩者的熒光進行平衡。 這是很容易可以在網上,在成像過程中。 AOTF的控製速度快,不需要掃描進程停止。

通過無級亮度調節平衡的激勵,不僅有利於對的熒光通道可比性,這也是一個有價值的工具,以提高熒光的分離。 許多染料顯示在他們的發射光譜,導致了錯誤的染料被拾起在右聲道長“尾巴”。 通過降低勵磁到最低限度,分離可以提高(降低串擾)。

最後,集中選擇線(和強度)之間的開關速度非常快 - 在幾微秒;相比大約一秒鍾為標準的機械過濾器的輪子。 這種快速開關允許照明政權(這在什麽強度線)一行的掃描過程中被改變。 此功能是用來描繪出不同的照明顏色圖案在樣品上,所謂的“感興趣區域”,不同的激光器是積極的。 它也可以用來“變黑”,其中沒有信號要被記錄的區域。 這樣可以使樣品活著後研究這些地區。 在這篇文章的開頭圖為利益,其中5種不同的參數設置是否在單次掃描得到應用,例如區域。



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