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尼康顯微鏡Lambda堆棧的基本概念

2014-03-12  發布者:admin 

類似的概念來使用的激光掃描共聚焦或解卷 ​​積顯微術高數值孔徑物鏡較厚的標本中獲得的光學部分 (  z棧)中,lambda堆棧的三維數據集,它由使用相同的試樣場的圖像采集在不同的波長帶,每一個橫跨有限的光譜區域範圍從2到20納米的獲取。 相反,在各種形式的光學顯微鏡的典型成像方案涉及在檢測器的整個波長響應頻帶獲取單個圖像(或一個連續組中的延時實驗圖像)。 本教程探討一個lambda棧的頻譜分量。

教程初始化與在上左角隨著三重標記的標本表達靶向至細胞核,線粒體和肌動蛋白網絡的探針的偽彩色圖像3熒光蛋白譜(ECFP,EGFP,EYFP和)的曲線圖元。 一疊拉姆達部分出現在左下方的角落。 為了操作的教程,使用LAMBDA堆棧深度滑塊從拉姆達棧,這是直接到堆棧的右側顯示在一個窗口檢查單個圖像。 另外,使用AUTO按鍵,通過堆棧自動播放。 為不同的部分呈現,未混合和偽彩色版本被同時顯示在檢體圖像窗口和光譜上的箭頭指示的帶通區域的位置。

光譜成像LAMBDA堆棧解剖

為了更好地理解在lambda棧的概念(通常也被稱為在文獻中作為圖像立方體光譜立方體),在橫向維度圖像的單個像素的位置(具有坐標 x I,Y i)的沿波長被檢查(Zλ)軸。 如圖1(a)中的像素的強度和/或顏色分別改變為熒光發射信號的強度和波長,一個函數,當從拉姆達堆的一端到另一監視。 通過繪製像素強度與波長的線性圖(參見圖1(b)),特定的熒光團在空間上位於像素的發光光譜曲線,我可以很容易地確定。 但應注意的是,使用這種技術獲得的發射光譜的精確度和分辨率是聚集在不同的波長帶,在各波長帶中的納米的光譜寬度(較短的帶寬產生較高分辨率)的λ堆棧的圖像的數量的函數,所研究的樣品的物理質量和檢測器的光子的靈敏度(量子效率)。

在使用具有重疊譜3熒光蛋白活細胞獲得的激光掃描共聚焦顯微鏡的lambda棧的一個真實世界的例子示於圖2。 在本實驗中使用的熒光蛋白標記物增強型綠色熒光蛋白(EGFP從水母;發射最大值在507納米),增強型黃色熒光蛋白(EYFP從水母;發射最大值在527納米),並Kusabira橙色(MKO的單體版本,發射最大值在561納米),從天然存在的珊瑚蛋白開發了一種高性能的探針。 在這種情況下,個別的lambda堆棧的圖像進行掃描,在10納米的波段範圍為480至640納米(圖2(a)),以產生總共16個譜段的熒光蛋白的混合物。(本文來源:尼康顯微鏡Lambda堆棧的基本概念

在lambda堆棧的第一圖像顯示在480到490納米的發射範圍的樣品的光譜特征,而所述第二圖像包含從490到500納米的發射數據(請參閱圖2(b))。 注意,幾乎所有的前兩個拉姆達部分的熒光發射的來自EGFP的短波長尾巴單獨隻用從EYFP長波長段(490至500納米)的非常小的貢獻。 在接下來的兩節拉姆達(500〜510納米和510到520納米),從EYFP的貢獻穩步增加從EGFP達到一個平台發射。 在520和550納米之間的λ3的部分,在EGFP信號逐漸減小,從EYFP發射的貢獻達到最大值在約530納米。 同樣,從MKO發射貢獻變成在帶540和550納米之間更顯著。 因此,在550到560納米波段,從熒光蛋白的相對貢獻是約10,25,和65%分別為EGFP,EYFP,和MKO。

熒光蛋白LAMBDA堆棧

排放貢獻來自EGFP和EYFP在最後的波段(560〜640納米)成為削弱來自人民聖戰者組織占主導地位的排放。 在審查中,波段在拉姆達棧是由最短和最長波長的發光蛋白,EGFP和人民聖戰者組織,分別占主導地位的特征排放貢獻(480到500納米之間590到640納米之間)的極端。 在lambda棧(500至590納米)的中心的波長帶包含代表來自三個熒光蛋白的一些貢獻的熒光發射。 如下麵將要討論的那樣,該混合發射信號的整個拉姆達堆棧的波長帶的分布可以從每個探針使用的參考發射光譜圖清楚地分離出單個的熒光蛋白質的貢獻是線性非混合。



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