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徠卡顯微鏡的新型光學結算方法允許整個組織的深層成像

2014-03-13  發布者:admin 

 圖像整體無腦切片? 無需重建研究神經回路? 在不破壞細胞結構進行分子分型? 了解大腦分子的分辨率和全球範圍內一直麵臨著挑戰。

小說CLARITY方法,由Deisseroth實驗室,斯坦福大學,美國開發,推動深部組織的成像大步前進的障礙。通過使老鼠大腦光學透明,同時保留了原生的分子結構,它現在很容易可以調查亞細胞結構,神經網絡和生物分子甚至整個完整的器官的配合物。

1:三維澄清的小鼠大腦的渲染(Chung等人2013)。
 

腦成像方法至今

迄今為止,大腦的映射可能隻在有限的方式。 由於光散射的組織,常規的深部組織成像由多光子顯微鏡被限製為約1mm的組織深度。 調查位於市中心大腦結構和蜂窩網絡時,樣品必須切片,研究了小卷。 單個神經元的預測,需要遵循跨多個切片樣本。這是精心設計的。 新的工具正在不斷開發:自動切片方法減少繁瑣的工作,盡量減少組織損傷,以及新穎的軟件便於分析和重建。 然而,重建可能不總是可能的或足夠的神經元回路的詳細分析。 使用有機溶劑的新的光學信息交換方法降低光散射和圖象更深的組織。 但這些方法離開脂質雙層完好無損,那麽他們仍然充當擴散屏障。 光與大分子的整裝染色方法的普及率仍然有限。

如何實現大腦清晰

CLARITY( 縮寫為清除脂質交換丙烯酰胺雜交剛性成像/免疫染色/原位雜交,組織相容水凝膠 )是簡單,因為它是輝煌的。 完整的組織被轉化為水凝膠組織的混合體。 類似於石化或僵化,組織的物理結構保持完好,並能防止崩解。 光散射脂質被去除,而蛋白質和核酸被保留,因為它們被共價連接到所述水凝膠的網格。

在第一步驟中,所述組織是注入的丙烯酰胺/雙丙烯酰胺,甲醛和一個熱敏啟動器,在4℃(圖2)。 甲醛交聯的組織並共價連接的單體的水凝膠的蛋白質和核酸。 脂類和生物分子缺乏官能團不結合,因此,可以被刪除。 隻有8%的蛋白質是通過此方法失去了(相對於25〜40%與傳統的定影和增溶)。 聚合是通過升高溫度至37℃。觸發 組織現在是一個水凝膠混合。 網格支持組織結構及其納米孔允許大分子進入。(本文來源:徠卡顯微鏡的新型光學結算方法允許整個組織的深層成像

脂雙層是由電泳組織清算係統(ETC)除去。 在一個特製的電泳室,樣品被放置在一個離子型去汙劑(4%SDS,十二烷基硫酸鈉)和一個施加電場。 高電荷離子的SDS膠束去除脂類積極。 ETC具有上述標準的有機溶兩大優勢:

  1. 它不解渴熒光像許多有機溶劑。
  2. 去除脂類的快。 洗滌劑的被動擴散將需要長達幾個月徹底去除脂肪。

通過安裝澄清大腦中像甘油或FocusClear一個折射率指定的解決方案®的完整的大腦變得完全透明,並準備進行成像(圖2B)。

2:淨度方法的描述:步驟1:組織是在4℃下注入丙烯酰胺/雙丙烯酰胺,甲醛和一個熱敏啟動器 步驟2:甲醛交聯的組織並共價連接的單體的水凝膠的蛋白質和核酸。 脂雙層是由電泳組織清算係統(ETC)除去。

 

整個成像的大腦

所有傳統的激光掃描顯微鏡技術是適合成像的淨度處理的組織,因為每個激發和發射波長可以穿透深入到組織中。

成像深度主要受限於物鏡的工作距離。 3.6毫米的客觀需要兩個大腦掃描:第一背側半,然後腹側。 遠距離的物鏡,使圖像在一氣嗬成的整體器官。 在神經科學學會2013年會上,徠卡呈現最新的目標發展:一個特殊的CLARITY目標與機動修正衣領設計為全器官成像的最大成像深度,並與將在2014年成為可用的最高分辨率。

成像技術

一般原則

優點

限製

單光子共聚焦顯微鏡

通過共焦激光共聚焦針孔去除失焦的光​​實現

  • 適合於多色成像熒光標記範圍廣泛
  • 用失焦的激發光全組織的光漂白
  • 性能依賴於樣本的分散

雙光子顯微鏡

通過激勵的大約兩倍的波長的兩個光子 - 和一半的能量 - 必要單光子激發。 無針孔必需的。

  • 漂白限製在焦平麵上。
  • 高效的檢測與非退探測器。
  • 通過紅外激發光的散射減少增加深度。
  • 不是所有的熒光標記適當
  • 所需的脈衝紅外激光器

表1:適用於CLARITY成像技術。

新的可能性的世界

是什麽讓CLARITY如此令人興奮的是,你可以調查任何你想要在一個單一的大腦。 蛋白質複合物,基因表達分析,神經回路 - 你不必來決定你想看到什麽。 看著這一切,一前一後。

納米多孔水凝膠網狀透氣是大分子,並允許探頭的快速擴散。 抗體染色容易,即使是在多輪。 混合的穩定框架允許抗體被淘汰用SDS。 相反,使用有機溶劑的常規方法洗脫,隨後染色的熒光是不滅的。 即使在連續3輪染色和去染色,沒有損失圖像質量(圖3和視頻)。

因此能夠遵循通過大腦軸突突起長距離。 顯示配對前和突觸後蛋白的共定位甚至允許單個突觸的調查。 並采用經典的熒光顯微鏡後,該組織仍然適用電子顯微鏡觀察細胞結構更加緊密。

該方法不限於新鮮的腦組織。 它也成功地用於長期固定的人屍檢腦組織或斑馬魚胚胎,開啟了新的可能性,研究神經係統疾病,或胚胎發育。

淨度給出了其結構和分子信息,並添加到大規模的完整的生物係統的理解。 總之,清晰度革命性的基礎研究。

 

 

圖3:小鼠海馬顯示EYFP表達神經元(綠色),小清蛋白陽性神經元(紅色)和GFAP(藍色)(Chung等人2013年)的三維視圖。

 



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