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徠卡顯微鏡共焦光學截麵厚度

2014-03-16  發布者:admin 

 共聚焦顯微鏡被用來光學切片同等厚的樣品。 最直接的問題是:1.什麽是“同等厚的樣品”和,2. 有多厚實際上是一種光學部分? 這兩個問題是相關的,即厚的樣品是assumedly比光學切片厚至少大約10倍。

在生物樣品可具有任意厚度為10米(整個動物)至10納米(ULTRACUT準備用於電子顯微鏡)。 如共焦顯微術是一種入射光線的方法,所述樣品本身的尺寸可以是幾個厘米或更多,但穿透深度的表麵下取決於材料的不透明度和物鏡的自由工作距離。 這就限製了樣本量(Z方向)的考慮到幾毫米在最。

對於光學切片的決定因素是衍射極限軸向焦點尺寸。 根據不同的參數,在真共焦掃描顯微鏡的光學切片厚度達到降低到約 0.5微米。 厚的樣品相對於0.5微米的切片,然後在5μm以上。 一個非常典型的數字為用於標準的共聚焦應用(如組織切片),樣本為50微米。

 

三維點擴散函數(PSF)和半最大值全寬度(FWHM)

定義在真正的共焦掃描係統(TCS)的光學部分的厚度和測量。的全寬度半最大值(FWHM)被用作參數來描述切片性能。以確定FWHM,的xz更新部分被記錄和顯示在點擴散函數(PSF)的中心強度分布。中的強度分布的峰值的50%的值之間的距離是半峰全寬。
1:全寬度半最大值在z方向上的強度分布(FWHM)被用作光學切片性能的量度。 點擴散函數 - 通過一個足夠小的乳膠珠產生的 - 記錄通過收集力度的xz個人資料部分。 中的衍射圖案的中心強度分布被顯示(在此為紅色)和50%值之間在Z的距離測量值(綠色指示燈)。

這是一種由光學係統產生的點(點)的圖像被稱為“點擴展函數”(PSF)。 點擴散函數描述了從一個維數少斑中的光發端三個維度的分布。 該衍射圖案的芯具有一個橢球的形狀,並控製光學分辨率。 的徑向尺寸規則的橫向分辨率,軸向尺寸規則的焦點深度,因此,平滑性能。

共聚焦切片,目標是傳輸PSF,它定義了光學部分的唯一的內芯。 由於事實上,針孔直徑控製多少光從芯外麵被發送。 光學部分,是在衍射圖案的大小的範圍是如此明顯不鋒利的像麵包片,但其特征在於由一個同等持平斜率。 連接上的強度分布的兩側的50%強度在Z的距離被稱為“半峰全寬”(FWHM),並按照慣例這被用作光學切片的厚度的測量。光學切片性能通常通過集中通過表麵鏡計量模型的無限薄的結構在Z。 這個方法是(同等)方便和用於檢查共聚焦顯微鏡係統的性能。 或者,更實際地,Z切片性能是衡量fluorochromated乳膠珠(參見圖1)。 熒光珠允許表現在非相幹的條件來衡量,這是真正的熒光成像,因而適合在生物醫學科學共聚焦絕大多數應用。 在反射光模式(鏡像)的衍射極限的光學部分是顯著稀釋劑相比,在熒光模式的部分。 這是重要的是要記住,如果從比較文學的數字。

 

參數控製的光學切片厚度

在理想條件下,最薄的部分可以實現隻通過光衍射依賴限製。 最明顯的是波長,它控製的PSF的大小成比例:波長越短,越薄切片。 AG亚游集团可以假定激發光進行限製(而不是發射的)的波長,如將沒有被照空間外發射。 第二個參數是物鏡(數值孔徑,NA)的孔徑:較高的NA(收集的信息更寬的角度),越薄的光學部分。 此外,樣品的折射率影響軸向分辨率並且因此切片性能。 切片的大小DZ對這些參數的依賴關係是由公式圖2中給出。(本文來源:徠卡顯微鏡共焦光學截麵厚度

第三個參數是針孔直徑在檢測路徑,被假定為零對於上麵給出的公式。 因此,這個公式給出誰也無法預料的熒光成像的最佳價值 - 隻是理論上的興趣,當然:直徑零針孔不會產生明亮的影像!

光學部厚度(FWHM)在一個真正的共聚焦掃描係統作為波長和數值孔徑的情況下熒光的函數。
 2:衍射極限的光學切片最小厚度從熒光樣品。 針孔直徑被假定為零。 半峰全寬(FWHM)在一個真正的共聚焦掃描係統。
 

光學截麵厚度影響

數值孔徑NA對切片厚度的顯著(1/square)的影響。 在每平方英尺的徑向延伸線性依賴於NA。 因此,對於低數值孔徑的透鏡,滌綸短纖核心變得非常長形和切片很厚。 因此,大多數應用程序都使用浸沒透鏡NA> 1,其中xy和z維度的比例接近2個大致的一個因素。 作為一個經驗法則,具有高數值孔徑透鏡的Z部分大約是兩倍的XY分辨率。

理論上的考慮有助於估計光學係統的性能。 在現實中,這兩種儀器和樣品引入從所計算的數字偏差。 該儀器必須以獲得最佳性能調整和精心操作。 和樣品本身就是分辨率的敵人,尤其是如果它涉及到更深層次的成像。 因此格外小心,必須采取折射率匹配,正確的和恒定的溫度和適當的蓋玻片的選擇。 該理論將得到一個經驗法則,但樣品和設置可能會引入顯著偏差 - 經常無法回避的,因為生物樣品比晶體更複雜( - 或真空)。

 



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