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尼康顯微鏡體視斜照明

2014-03-18  發布者:admin 

 使用傳統的傳輸(diascopic)明照明技術在立體顯微鏡觀察標本時,幾乎是透明的,無色的可能幾乎不可見。 這是因為光一秒標本細節衍射是四分之一波長的相位穿過樣品直射光時,都被重新組合在中間像平麵,一個經典的現象,嚴重降低了在明的圖像對比度。

但是,如果光照被引導,使得它來源於一個單一的方位角和從傾斜的角度照射到試樣,在試樣的細節可以與比當光被允許直接通過樣品的特性來傳遞更大的對比度和視覺清晰度顯示沿所述顯微鏡的光軸。 相位和折射率梯度在試樣偏轉的光線通過衍射,反射,折射和,因此,隻有零階(未衍射)和衍射光的一個或兩個邊帶可以重組在圖像平麵上。 這產生了具有區域顯示陰影和高光浮雕狀圖案樣本,很像是用微分幹涉對比(DIC)技術在複合顯微鏡觀察。(本文來源:尼康顯微鏡體視斜照明

示於圖1是一個現代化的立體顯微鏡照明支架(尼康斜相幹對比度(OCC)diascopic模型),其物鏡是通過從軸向明高度傾斜離軸光線的渲染可見的透明標本的過渡機製,以照亮標本在計劃中的極為相似暗場。 支架包含了整個體視顯微鏡物鏡放大倍數(一般0.5倍至2倍)和數值孔徑(0.07〜0.21)範圍內的兩個高,低數值孔徑的聚光使利用率。 斜光通過滑動隔膜該遮蔽光束的中心,以產生部分相幹光源,這是斜向投射到試樣,產生高對比度的圖像來實現。膜片的位置由可用於調整照明的傾角的旋轉旋鈕來控製。

標本被放置在尼康OCC透射底座的玻璃階段和可照明無論是在明場,暗場,或者不同程度的偏斜照明的,通過旋轉光圈控製旋鈕。 一係列在偏斜照明的連續級別捕獲的數字圖像示於圖2為一個半透明Nemathelminth( 鉤蟲, 犬鉤蟲 )標本。 正如圖2是顯而易見的(一),未染色鉤蟲是半透明的,而且非常小細節是根據明軸向照明透露。 然而,當滑動隔膜旋轉入光路,提高度偏斜照明,可以實現(圖2(b)所示,圖2(c)和圖2(d)),與對應的緊密合作,以暗視野照明的最極端位置從一個單一的方位角。 在標本的對比可能與此照明立場的變化是最顯著的比較圖2描繪(a)和圖2(c),其中產於明和高度傾斜的連貫對比,分別。

之一的尼康斜立體顯微鏡照明支架的主要的設計標準是使增強圖像的對比度,例如可能與光闌實現,同時維持高聚光器的數值孔徑匹配的能力,通過複消色差的物鏡顯示的。 具有並行或共同的主要物鏡(CMO)設計的許多立體顯微鏡耦合到照明看台,配備光闌,無論是內置或作為附件提供。 為了增加景深,光圈孔徑通常的尺寸減小,這也有助於提高在透射照明圖像的對比度。 遺憾的是,減小可變光闌的大小還使得該圖象形成光線更加連貫,並通過減小物鏡的工作數值孔徑損害了顯微鏡的分辨能力。

斜相幹對比度的照明係統結合了通過降低聚光鏡孔徑光闌大小得到的相幹增強偏斜照明的效果,並產生具有相似的差分化合物顯微鏡產生的幹涉對比度的圖像的外觀在立體顯微鏡圖像。代替使用一個光圈孔徑光闌,傾斜相幹對比係統采用一個擋板,它作為一個滑動隔膜 。 線性隔膜機製表現為虹膜會如果放置在相同的位置,但該物鏡保留了大部分它的分辨能力。 這可以實現,因為該照明錐的數值孔徑減小,但是,該物鏡是沒有的。

照明通路,表征尼康斜立體顯微鏡係統被示出在圖3中,其中也給出了光通路的正常的明(diascopic)的條件。 聚光透鏡係統聚焦在燈絲的像投影到定位在相對於兩燈和試樣的光學軸成45度角的鏡子。 滑動隔膜是一擋板,可以在整個反射鏡的表麵被翻譯以阻擋光線將通常直接穿過樣品,確保隻有斜光被用來照明樣品的細節。 聚光透鏡定位在所述反射鏡通過使擋板的鋒利邊緣聚焦在物鏡的後焦平麵保持光的相幹。 物鏡的後方瞳孔將僅部分地填充有輕,因為由滑動擋板的位置(在充當可變光闌)測定。

與該係統中,物鏡的整個數值孔徑被保持。 之一的尼康傾斜係統(超過其他偏斜照明技術)的優點是易於由一個單一的調節旋鈕,它控製所述滑動擋板的位置的裝置,明視野,偏斜,和暗場照明之間進行轉換的。 與擋板試樣的外觀移離鏡等同於見於正常明場照明。 與擋板移動到所述反射鏡的頂部,圖像將類似於暗場,並在這兩個極端之間,真偏斜照明條件而異。 傾角的程度容易地調整以適應樣品和所期望的細節的類型。

斜光在許多方麵隻是將暗場技術相似,而不是從所有的方向以傾斜角度被點燃試樣,光隻從一個單一方位投影。 各種照明場景都被用來觀察標本的立體斜向提供定向照明(一個例子是在圖4)。 簡單diascopic堿通常配備有傾斜反射鏡,可以進行調整,以提供一定程度的偏斜照明,但光不容易控製,並且不提供的視圖中的均勻場。 更複雜的顯微鏡台(或堿基)有額外的控製的可能性,包括傾斜反射鏡並非限於單個軸和滑動,可以進行插入和從光路取出的反射鏡組件。 某些模型使用一個或多個滑動擋板來限製照明幾何形狀,並確保隻有斜光照射試樣。

任何這些技術可以提供可以接受的良好的效果上各種各樣的標本,但大多數需要一個顯著程度操縱涉及的照明通路,這往往是難以定量分析或再現。 涉及藝術多於科學,實現了在立體顯微鏡斜照明的業績高度依賴於顯微鏡的技能,經驗和耐心。 大量的照明方案已經製定,這進一步複雜圍繞這一技術提高標本的對比問題。

通過該斜光增強細節中另有幾乎看不見,無色標本的機構最好是由考慮了偏斜照明技術的理解為它是常用於傳統的複合顯微鏡說明。 直射光從台下聚光器中的一個方位從單一的一側照射標本。 斜光通常是由放置一個狹縫或扇區停止下透鏡和聚光器的孔徑光闌的下方,通過光闌的窄開口,隻允許斜光穿過以照射樣品來實現。 斜照明的效果是通過樣品的光通過零階移位到物鏡孔徑的外圍。 零級的一側的移位使得一個或多個額外的高次衍射光(邊帶),以被包括在物鏡的後焦點平麵,並有助於圖像形成。 在許多情況下,其結果是在增加的光學分辨率,因為第零和一些更高的訂單都有助於形成圖像。 此外,該技術還產生具有陰影,高浮雕的功能,使該試樣的偽三維外觀的圖像。

時相比,暗場技術,其中樣品是從所有方位照射高度傾斜的光,不對稱的斜光產生的圖像,其字符高度依賴於照明的入射角度。 由斜光產生的圖像是不對稱在於邊緣躺在垂直於入射照明光的方向是由可見光檢測,而那些平麵平行(或接近)於該方向都沒有。 這個概念是對兩個試樣在不同的方向相對於入射光傾斜照明的角度,如圖5所示。 如圖試樣5(a)和圖5(b)由從鋁酸鑭,即通常使用的底物的高溫超導陶瓷外延薄膜沉積的鈣鈦礦型的薄單晶晶片得到相同viewfields。 結對在這些晶體妨礙匯合的薄膜形成,並且可以具有對得到的膜的性能產生有害的影響。 在圖5中提出的數字圖像(a)示出由孿晶疇時,晶體的取向與雙軸線平行於斜入射光線的縱向生成的偽浮雕。 與此相反,當晶體(和雙)軸被旋轉90度,因此,它是垂直於入射光線(圖5(b))時,孿晶疇變得顯而易見。 這代表了對下斜照明觀測到的肌理效果試樣取向限製壯觀的顯示。

觀察半透明山羊毛纖維在幾個方位角度斜射照明時類似,但不顯著,結果獲得的。 當杆狀頭發縷的長軸方向平行於入射斜光(圖5(c))中,在中心部分和毛纖維的邊緣結構細節被揭示。 這個細節不存在時,毛發纖維的取向垂直於照射軸(圖5(d)),和一個顯著差異是在兩個方向之間的角度的纖維的表觀厚度變化。 纖維取向平行於入射照明似乎比那些取向垂直於光源厚得多。 因此,顯而易見的是,在偏斜照明技術不能可靠地用於產生從用這種​​方法收集的圖像忠實的測量數據。

通過斜照明技術,得到表觀立體效果並不代表實際的試樣的幾何形狀或形貌,並且不應該被用來進行試樣尺寸的測量。 在斜光圖像的真值是在折射率或樣品,使形態和內部結構布置也可以更清楚地理解範圍內的其他光路的差異揭示的轉換。 該技術可應用於各種顯示幾乎不可見的或透明的明場照明的材料,不能被染色或以其他化學或熱處理,以提高對比度。 研究活的有機體,並如在體外受精 ,玻璃或丙烯酸纖維,化學晶體,以及其他未染色的材料的方法可以通過一個容易控製的偏斜照明係統的利用率變得容易。



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