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徠卡顯微鏡布氏錐蟲的冷凍置換

2014-03-19  發布者:admin 

 生物標本的超微結構研究化學固定是一個相對緩慢和選擇的過程,因此工件的一個共同的來源。 凍結,另一方麵,是身體修複的生物標本的全部和無延遲的好方法;冰晶大到足以取代細胞物質和破壞結構的形成,會是這樣,但是,一個主要的問題。 因此,生物樣本必須被冷凍或在阻止水分子的重排成為晶體,並導致amorphously固化(玻璃化)水的速度或以這樣的方式所形成的晶體是小到足以符合的分辨率觀察法。 對於非常薄的樣品,這可以相對容易地實現通過浸入到合適的冷卻劑。 但是,熱的差的傳導從試樣的芯的外圍上施加樣本,可以通過這種方法在環境條件下被凍結,即使有一個無限的冷卻速度在表麵的尺寸限製。

以抵消破壞性的冰晶,即使在像大細胞或組織的片較厚樣品的形成,高壓可以使用:這降低水的凝固點,從而減少了需要進行劃線,以充分保持標本或者在臨界溫度範圍玻璃化(理想情況下)或高壓冰晶形成於約10納米更小。 此外,在高壓(〜200兆帕/ 2,000 bar)的不同晶型的冰為準這似乎是破壞性較小。 這一原則在高壓下被用於冷凍(HPF),因為停泊和裏勒介紹了它在1968年。 如今,商用儀器使用的壓縮機和氣動這一複雜的係統,以產生高的,這是冷卻試樣之前立即施加的壓力。

2009年,一月Leunissen和洪易提出了不同的冷凍技術采用同樣的原則,以防止冰晶的形成:而不是使用外部產生的壓力,他們使用的壓力建立起來的樣品由內冰晶形成的一個部分一個密封的金屬管,以防止結晶在相同體積的另一部分。 示出“自增壓快速冷凍”和凍結取代的古細菌,酵母細胞,和秀麗隱杆線蟲,它們可以證明,這種方法可以作為一種替代HPF對於可以在用於冷凍的小銅管被容納標本。

1(左圖)和圖2(右):SPF冷凍Typanosoma布氏後冷凍置換,包埋,超薄切片後和染色概述圖像。 注意質膜的優異的保存和細胞質中。脂滴被看作是細胞內的電子致密的球體。 周圍的細胞,鞭毛的橫截麵可以觀察到(→)。

 

這些最初的實驗中使用手動浸入的製冷劑,與相關的有限的控製權凍結參數。 管內保存完好的標本出現並排損壞的。 為了提高可重複性和產量,徠卡顯微係統公司開發了EM SPF與Leunissen,儀器自動化自我加壓快速冷凍,這成為市售在2011年的合作。 相比原來的做法,這種儀器是利用U形管,而不是直的人凍結,以提供功能不同的區域,分開保存完好,損壞標本:在一個區域的冰形成,供應增壓,而在第二區的試樣仍處於液態的環境和在高壓下提供適當的結構保護了基礎。

下麵的報表顯示實現了與EM SPF-凍結和布氏錐蟲的寄生蟲致病的非洲昏睡病的隨後的冷凍替代的結果。 構成該技術是一個挑戰,這個有機體稱為是出了名的難以維護以及為少數族裔被選定作為一個模型係統。 雖然這裏介紹的協議可以提供一個起始點,不同樣本將需要額外的實驗以確定用於裝載樣品放入試管中,冷凍培養基的組成,並在用於浸漬速度和深度的儀器設定最佳條件。

3:顯示布氏錐蟲的鞭毛基部有絲分裂的開始高倍看法。 皮質微管(c)和軸絲微管(a)中明顯的切線部分。

 

材料和方法

布氏錐蟲培養在懸浮液中以300g離心5分鍾。 除去上清液後,將100μl的沉澱再懸浮於1體積在DDH 2 O的20%BSA的 將懸浮液注入用20微升的移液管與切尖,直到它被完全填充,置換所有氣泡15.8毫米U型管。 該填充管,然後轉移至2毫升塑料管和離心弧下來與擺動出轉子(!)3分鍾在300克 Leica EM SPF冷凍用的浸漬速度25毫米/秒,沒有浸沒延遲,浸沒深度6.7毫米執行。(本文來源:徠卡顯微鏡布氏錐蟲的冷凍置換

冷凍後,將管切成LN 2下2毫米段。 這些片段被轉移到冷凍替代媒體在-140℃下,含1%的OsO 4和0.1%醋酸鈾在無水丙酮。冷凍置換,進行中的Leica EM AFS2用溫度程序如下:

  1. -140°C
  2. 升溫至-90℃,增量為25°C /小時
  3. -90℃下50小時
  4. 升溫至-54℃,增量為2℃/ h的
  5. -54℃下8小時
  6. 升溫至-24℃,增量為5℃/ h的
  7. -24℃下15小時
  8. 升溫至0℃,增量為48°C /小時
  9. 0℃下進行2.5小時

樣品在0℃下洗滌3次,每次10分鍾,用無水丙酮 對樣品進行滲透在瓊脂100樹脂(中等硬度),2:1,1:1,1:2,純樹脂用丙酮超過4天的過程中混合。 樹脂的聚合在60℃下24小時。

樣品修整用玻璃刀切片和70納米用金剛石刀。 在此之前,在80 kV的透射電子顯微鏡,切片進行後染色用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛。



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