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徠卡顯微鏡怎麽脫鈣?

2014-03-25  發布者:admin 

 脫鈣描述的技術中用於除去從骨或其它組織鈣化礦物,使優質的石蠟切片,可以製備將保留所有必需的微觀元素。 脫鈣進行後標本已被徹底固定和前常規處理石蠟。 在本文中骨的基本結構進行說明,並在技術選擇用於製備章節中所述。 對於脫鈣和成功地監測該過程的程序進行了討論,並提供了一​​些流行的選擇試劑的選擇。

介紹

有一些當組織學家是必需的,以產生從骨或其它鈣化標本切片可用的選項。 在選擇技術和加工方法必須考慮到調查正在開展的類型。 例如,如果骨代謝病已在調查中,必須從骨樣分化礦化骨,或者如果形態學測量是必需的,它可能有必要通過產生的“非脫鈣”骨部分,以保持和展示的礦物質含量。 作為礦化骨是這樣的硬質材料也有提供由它產生的部分的技術範圍有限。 固定後,它可以直接鋸成薄晶片,然後利用研磨磨料的表麵,以產生薄的“接地”部分(參見圖1)。 另外,也可以通過與丙烯酸或環氧樹脂的聚合時,具有同等的礦化骨的硬度滲入他們準備骨標本。 然後,您可以從他們身上直接使用重型切片機(如徠卡SM2500)和碳化鎢或金剛石刀具(見圖2)的滲透標本或部分產生接地部分。 礦化鬆質骨的冰凍切片是另一種可能性。

圖1:密質骨的未染色的地麵部分。 許多骨單位(哈弗係統)被橫向切割。 該骨單位由骨(lamelle)的周邊包含血管的中央哈佛氏管同心層。 內lamelle是空白(空格)通常含有骨細胞。在幹燥的地麵部分,如這一點,他們會顯示為黑色結構,由於顆粒磨料和包含在其中的空氣。 
圖2:鬆質骨(馮·科薩)的非脫鈣部分。 骨固定在福爾馬林中,並進行處理和嵌入在環氧樹脂用於切片。 鈣化骨是黑色的,因為是骨髓的部件類骨質的骨小梁的表麵上的邊緣被染成藍色。 需要注意的是,盡管聚合的樹脂的支持下,在這種情況下,基質鈣化已經準備的一段期間破裂。
 

更常見的骨和其他鈣化標本脫鈣(軟化水)以下的固定,並用標準方法產生的石蠟切片進行處理。 脫鈣切片用於骨髓的檢查及腫瘤,感染或用於其它目的的診斷。 試樣可在髂脊環鑽或骨片在操作(如股骨頭)除去或從截肢標本解剖的表格。 精細的細節X光片通常用來協助適當骨標本進行處理的選擇。 除了 ​​在骨,其他組織可能經曆與變性過程如壞死(營養不良性鈣化)相關聯的鈣化或它可能發生在血管壁或在腎,肺或其他地方(轉移性鈣化)。 如果鈣化區域中組織標本是巨大的,可能無法獲得體麵部分而不先脫鈣標本。 另一種可能性,是采用“表麵脫鈣”的石蠟塊,以便在那裏不被預期的,當試樣加工鈣的存在下,獲得的部分。

脫鈣程序比較簡單,在組織學技術的標準文本被廣泛地討論。如果高品質的結果不過是要得到,有些點是值得重視的。

骨的結構

骨骼是由含有1型膠原纖維鈣化基質包圍細胞(骨)的。 在基體中的鈣是在羥基磷灰石結晶形式的[Ca 10(PO 4)6(OH)2]這是纖維狀元件之間沉積。 這些晶體脫鈣的過程中,如果正確地執行,葉凝聚力組織致密纖維結締組織的物理特性中被溶解掉了。

有兩種類型的成熟骨的。 皮質或密質骨形成長骨和頭骨的扁骨的主要部分的軸和具有基於所謂的骨單位圓柱形結構(圖3)的結構的非常致密的結構。 鬆質骨,骨小梁或骨鬆質有一個更加細致的安排,由薄薄的隔板(小梁)連接骨板之間找到了骨髓。 它位於脊椎和長骨的骨骺(圖4)。 既緊湊和鬆質骨發育中的層或lamelle,其中膠原纖維在結構上定向,並顯示根據偏振光顯微鏡的特征的圖像(參見圖5)。 

圖3:從長骨用甲酸(H&E)最佳脫鈣的橫截麵。許多骨單位與外圍水泥線被示出。 以及染骨細胞的細胞核都存在,表明脫鈣終點是不超標。 
圖4:鬆質骨的長骨(H&E)的一個骨骺部分脫鈣(粉紅色)和透明軟骨(藍色)。 骨的骨小梁細膩保存完好的是骨髓和脂肪細胞相關的精細結構。 色斑的嗜堿性/嗜酸性平衡良好的維護指示甲酸脫鈣是最佳的。 
圖5:密質骨的長骨(H&E)的軸上的脫鈣部分。本節是在偏振光下拍攝以展示同心lamelle形成骨單位。 雙折射是由於膠原纖維在骨基質的連續層之間的不同的方位。
 

仔細考慮接收到的用於處理任何骨樣品的性質是很重要的,因為皮質和骨鬆質的相對量是很重要的,並會確定所需的脫鈣和處理的時間。 例如,髂脊環鑽標本由皮質骨的邊緣覆蓋的鬆質骨的圓柱體。 皮質骨將是最後脫鈣過程中放棄其鈣鹽除非它是完全脫鈣難度將會經曆獲得體麵的部分。

骨的固定

為了保護骨細胞和纖維元件所造成的作為脫鈣劑的酸的損害,這是特別重要的,以徹底解決這些標本之前脫鈣。 脫鈣期間較差固定的標本成為浸漬和染色之後不佳。 這是非常明顯的含骨髓領域。 因此,通常的做法是對實驗室固定時間為骨骼標本脫鈣開始前延長 。 它提供隨時為固定液穿透骨頭是很重要的,所以皮膚和軟組織應該從大樣本,如果可行的去除。 骨標本應盡快以提高固定和固定劑的適當量提供鋸成薄片。 高質量的細齒鋸應該用來製備骨片。 粗鋸可引起相當大的機械損壞,並迫使骨碎片進入存在於試樣中的軟組織(參見圖6)。

福爾馬林緩衝液是用於骨令人滿意的固定液但其中一些實驗室將使用替代品,如1的鋅福爾馬林的混合物,B5,甲醛乙醇(Davidson的固定劑),或布安骨髓的保存是很重要的。

圖6:環鑽標本中骨碎片已在籌備(箭頭)被強製進入骨髓的空間。 這是沾上馮·科薩的方法來證明鈣的未脫鈣樹脂部分。
 

脫鈣代理 - 概述

主要有三種類型的脫鈣代理:

  • 那些基於強無機酸
  • 那些基於弱有機酸
  • 那些組成的螯合劑 。

為了方便大多數實驗室選擇從現有的許多專有試劑。 這些產品的潛在用戶應谘詢相關的MSDS,以確定活性成分存在,如果它沒有明確提供的技術資料說明。

脫鈣代理 - 強酸

強酸如鹽酸或硝酸的濃度高達10%是最快速的動作,但如果使用過多的時間會迅速引起核染色的損失,並且可以浸軟組織中。 重要的是,適當的終點試驗用於減少標本對這些藥物的暴露。 一般來說專有decalcifiers自稱是迅速行動即根據強酸,最常用的鹽酸,並應謹慎使用,注重提供的說明書,如果效果不錯,來獲得。 例如Surgipath的Decalcifier II®是迅速的行動,並含有鹽酸。 圖7展示了用無機酸decalcifier超出適當端點延長治療的後果。

表1列出了一些比較常見的無機酸為基礎的decalcifiers的。 histotechnology的標準教科書應征詢一個更全麵的列表。

表1:礦物酸decalcifiers 

Decalcifier

公式

評論

硝酸

5%在蒸餾水中

迅速行動,超過終點會損害染色。

Perenyi的流體 (1882)

10%的硝酸40毫升

0.5%鉻酸30毫升

無水酒精30毫升

傳統decalcifier的decalcifies比硝酸水溶液更慢。 在行動相當迅速,超過了終點會損害染色。

鹽酸

在蒸餾水中的5-10%的

福爾馬林應該從標本放置在HCl避免雙 - 氯甲基醚(一種致癌物質)的形成前要洗淨。 迅速行動,超過終點會損害染色。

馮埃布的解決方案

飽和氯化鈉的溶液。 50毫升

蒸餾水42毫升

鹽酸8毫升

迅速行動,超過終點會損害染色。

圖7:脫鈣鬆質骨(H&E)的一個部分。 對該樣品進行脫鈣用鹽酸decalcifier為過多的時間,而無需使用一個適當的端點檢測。 雖然組織要素是凝聚力的染色非常差,顯示具有較強的,低分化曙紅起來完全沒有核染色。
 

脫鈣代理 - 弱酸

弱酸,例如甲酸很受歡迎,被廣泛用於脫鈣。 甲酸可以用作簡單的10%水溶液,或與福爾馬林或用緩衝。 雖然它比強酸劑慢它是在動作更加溫和,不太可能幹擾核染色。 1,7基於甲酸的專有decalcifier的一個例子是Surgipath的Decalcifier予®。 它還含有甲醛,並聲稱修複以及脫鈣和溫柔的動作。 其它酸如三氯乙酸(TCA)也被使用。 苦味酸,如一些固定劑的一個組分具有弱脫鈣特性。 

表2:弱酸decalcifiers 

Decalcifier

公式

評論

甲酸

在蒸餾水中的10%的

一個簡單有效的decalcifier。

埃文斯和Krajian

甲酸25毫升

檸檬酸納10g

蒸餾水75毫升

一個有效的甲酸decalcifier緩衝檸檬酸。

克裏斯騰森

甲酸18毫升

甲酸鈉3.5克

蒸餾水82毫升

一個有效的甲酸decalcifier緩衝甲酸

古丁和斯圖爾特

甲酸5 - 25毫升

40%的甲醛5毫升

蒸餾水75毫升

甲酸decalcifier添加了福爾馬林,聲稱固​​定和脫鈣。

脫鈣劑 - 螯合劑

通過從磷灰石晶體的表麵捕獲的鈣離子,慢慢地減少其大小,螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA),工作。因為這個過程是十分緩慢的,但很溫和(周可能取決於樣品的大小被要求),該試劑不適合於緊急標本,但更適合於研究應用中的質量非常高的形態是必需的或特定分子的元素必須是保存諸如IHC,FISH或PCR技術。 這是用在大約14%的濃度作為中和的溶液。在其中將EDTA脫鈣率是pH依賴性的。 它通常用於在pH值7.0。 它可以更迅速地在pH為10,但有些組織元素可以在堿性pH下被損壞。

 

表3:螯合劑

Decalcifier

公式

評論

中性EDTA

乙二胺四乙酸二鈉鹽250克

蒸餾水1750毫升

加入氫氧化鈉使pH值至7.0(約25克將需​​要)。

徒緩慢而引起組織損傷小。 傳統的汙漬基本上不受影響。

影響脫鈣率的因素

濃度。 
活性劑的濃度將影響在其中鈣被去除的速率。 發表製劑脫鈣溶液在速度和組織損傷的程度之間的平衡。它必須記住,活性劑的濃度將被耗盡,因為它結合了鈣,所以它是明智的,使用大容量decalcifier和在脫鈣過程中更新了好幾遍。

溫度。 
溫度升高會加快脫鈣率反而會增加組織損傷率等都必須非常謹慎地使用。

激越。 
輕輕搖動可能增加的速度咯。

流體的訪問。 
與固定新鮮decalcifier應可隨時到試樣的所有表麵。 這將增強擴散和滲透到標本,並促進解決方案,電離和去除鈣。

其它技術用於增加脫鈣的效率

用EDTA使用超聲已被成功地用於加快環鑽標本脫鈣用於後續的分子分析。 在這個過程中的溫度必須小心地控製。 微波治療已被用於與鹽酸decalcifiers但升高的溫度可能會損壞形態和染色造成假象。離子交換樹脂已被納入一些脫鈣協議。 它們被加入到容器保持decalcifier和占用的離子鈣維持酸的有效性。 如果酸decalcifiers中使用適當的數量及定期更換使用這些樹脂的可能是不必要的。電解脫鈣,其中骨被放置在酸decalcifier並連接到通過其電流施加用電極是一個還沒有得到廣泛的技術接受,因為造成熱損傷試樣的潛力。

確定終點脫鈣

如果高品質的結果是要得到以確定在其中所有的鈣已經被去除的點是很重要的,因為,從此時起,組織損傷似乎發生的速度越來越快。 過度脫鈣,特別是與強酸decalcifiers,敗壞嗜堿性元素如細胞核的染色和在某些情況下可導致較軟的組織元素的浸漬。 在另一方麵標本是不完全脫鈣可能很難或不可能一節。

最好的方法,特別是具有大的標本如股骨頭,是對X-射線的試樣。 一個好的品質的X射線會清楚地揭示微小殘餘的鈣沉積,並允許進一步的治療,如果必要的。 它是用於以下的大型試樣如股骨頭脫鈣的過程(參見圖8)的極好方法。 一個簡單的化學測試時可以有些酸decalcifiers被使用(尤其是甲酸)被應用。 草酸銨溶液加入到脫鈣的最終變化,已用氫氧化銨中的樣品。 1如果鈣存在草酸鈣沉澱會形成表明脫鈣可能是不完整的,並在脫鈣較長的時間是必需的。 當然這個測試是最好在比較近decalcifier的變化(暴露於組織為比如,僅一小時)。 物理測試需要操縱,彎曲進行探測或修整試樣的“感覺”剩餘鈣化區域。 雖然這種方法可能是成功經驗的手中它通常被認為是不可靠的。 機械損傷可發生彎曲或探測和鈣的小額存款很容易被錯過時。 7通過仔細權衡標本漂洗和印跡也被描述後,確定端點的方法。 這可能是一種有效的方法對大樣本。(本文來源:徠卡顯微鏡怎麽脫鈣?

 

如果您認為脫鈣終點靠近,你想慢下來的過程,以避免過度脫鈣和隨之而來的組織損傷,如可能出現這種情況時,您的實驗室在周末是沒人住,標本可以從decalcifier被刪除,漂洗並放回福爾馬林(如果正在使用鹽酸重要)。 脫鈣可以被恢複時,方便。另一種方法是冷藏的樣品在其decalcifier放慢進程4˚C。 1

圖8:一種X射線係列繼股骨頭脫鈣與甲酸/檸檬酸decalcifier的過程。 X線片均采用惠普Faxitron生產®和允許精確地遵循過程和終點,以得到正確的識別。 
圖9:腓骨的脫鈣石蠟切片(H&E)。 注試件的尺寸。 使用化學端點測試再加工使用擴展的時間表石蠟有人脫鈣與甲酸劑。 13 Y /,男性持續他的右腓骨的病理性骨折跌倒後。 X線片顯示為(R)腓骨中間軸的骨性膨大。 病理診斷為骨囊腫病理性骨折。 本節準備在病理學武力學院(美國)在1983年的骨實驗室。
 

治療下列脫鈣和前處理

各種方法用於中和殘餘酸decalcifier處理之前已經公布,包括在自來水充分洗滌或堿性溶液中的應用。 通常很短,有效洗滌自來水中,應足以為任何剩餘的酸處理過程中會被去除。它以除去大部分的decalcifier的,以避免汙染的處理劑和用酸的處理器是非常重要的。

選擇一個合適的時間表脫鈣骨或其他組織脫鈣

一旦礦物已被刪除的標準處理進度表可以被使用。 它必須牢記的是,盡管完全脫鈣,骨,尤其是密質骨,將包含需要徹底的處理密集的地區。 這是更好地使用時間表,太長不是太短。 您的選擇將取決於樣品的性質和大小。 真空中滲蠟的應用程序應該提高成品塊的質量。

表麵脫鈣

這是與鈣的小意外存款可在石蠟塊中遇到的處理(參見圖10)的方法。 一般而言,這是修剪塊切片揭露了鈣被發現的標本後。 重要的是在這一階段,以盡量避免廣泛地破壞塊的表麵上。 後的組織已經暴露塊可以從切片除去並麵朝下放置在酸decalcifier為15 - 60分鍾。 這種表麵處理將使decalcifier穿透小的距離成塊,並溶解鈣。 該塊可以再在清水中徹底衝洗,以除去殘留的酸,冷凍和切片。 塊的仔細調整將被要求,因為decalcifier會滲透非常小的距離成塊,允許采取隻有幾部分組成。

圖10:從在意料之外的鈣沉積遇到肉芽腫標本(藍色)A節。 如果表麵脫鈣已應用於該塊質量較好的部分本來準備。
 

 

結論

脫鈣是一個簡單的過程,但要取得成功,需要:

  • 標本仔細初步評估
  • 徹底固定
  • 合理的厚度為固定和處理芯片的製備
  • 合適的decalcifier有足夠量的選擇,定期更換
  • 仔細確定端點
  • 使用合適的時間表徹底的處理。


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