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尼康顯微鏡共振掃描激光共聚焦顯微鏡教程

2014-04-13  發布者:admin 

 為了獲得往往需要通過活細胞成像的速度更快的時間尺度圖像,激光掃描共聚焦顯微鏡必須重新設計,以結合了先進的掃描方案,使光束是光柵掃描以更高的速度穿過標本。 為了克服傳統的共聚焦顯微鏡固有的速度慢,一些製造商已經推出了搭載了能夠采集圖像以每秒或更高的30幀的共振掃描鏡儀器。

 

本教程由初始化顯示共振掃描儀像素時鍾激光束疊加在拉伸倫奇光柵(長黑線)的餘弦格局。下方的掃描圖案是通過光柵和掃描過程中所產生的像素時鍾計數傳送的光的強度。 該圖的左手側示出了正向掃描,而在右手側示出了在反向掃描。 注意,本教程的速度得到了大幅為了證明在共振掃描所發生的各種事件減少。 作為掃描的進行,典型的標本中示出的圖像掃描窗口。 水平掃描鏡的角度也被指示為是從相對於所述倫奇光柵的像素時鍾激光的反射光束的位置。 為了操作的教程,請單擊掃描圖片按鈕啟用手動更改到X掃描Y掃描滑塊。

由於非線性諧振掃描器速度,熒光樣品被掃描在中央區域中的最高速度,該速度逐漸減小的掃描到達邊緣。 作為一個結果,當從一個諧振掃描器產生的圖像數據流的獲取與一個圖像采集卡主頻為一個恒定的像素率(假定光束掃描線)時,圖像出現拉伸的邊緣。 此外,激光的激發強度(大於在邊緣處)的不均勻分布產生的,因為增加的暴露於激光的過多的光漂白(和潛在的光毒性)在掃描區域的邊緣。 用於補償掃描非線性的最簡單的辦法是限製掃描範圍的那部分的振蕩周期,其中該檢流計的速度幾乎是線性的,這發生在跨越約70%的總的掃描寬度的一個區域。 不幸的是,這種解決方案減少的時間發射的信號可以被收集的量,增加掃描周轉時間之前信號可以被再次收集,並且不阻止在光漂白落在被記錄的區域以外的樣品的區域。光漂白的效果可以但是最小化,通過引入一個可調節孔,以限製暴露於光照樣品的區域使用檢流計振蕩的線性部分時。

誘導的非線性諧振振鏡掃描圖像失真是幸運的可預測的和可使用軟件或硬件的解決方案被校正。 不論所涉及到產生圖像的校正方案的,最有效的掃描策略包括在檢流計鏡的正向和反向掃描采集數據。 前向掃描過程中記錄的數據是簡單的,但是由於該反向掃描反轉,其中像素被記錄在方向上的事實,圖像數據必須使用專門的讀 - 寫緩衝器或軟件被倒置。 在實踐中,圖像被聚集在普通寬度的兩倍(實際上,1024像素的最終圖像512×512像素大小)和一半的正常高度(256像素)。 在諧振電反射鏡的每個正向X軸掃描結束時,提供給線性(y)的電流計的垂直鋸齒波信號是由1行和反向(x)的掃描開始遞增。 在這種方式下,垂直掃描順利的為256個周期,直到足夠的數據供一個圖像被獲取。

共振掃描儀時鍾問題

軟件和硬件時鍾的共振掃描共聚焦顯微鏡解決方案依賴於明知位置數據的高頻諧振電流鏡。於7.9千赫茲器件,該反射鏡可以在圍繞中心軸(總共24度的旋轉),每個方向旋轉約12度。鏡子的角位置(θ)和相位或速度(φ)的關係可以根據振蕩周期的狀態進行預測。 在一個振蕩周期的開始(鏡位置等於正負12度,參見圖1)的反射鏡是固定的速度等於零。 作為反射鏡擺動朝向中點,角速度隨著相位的餘弦函數和達到最大時的反射鏡的角度為零。 繼續,反射鏡會減慢再在接近正向掃描的結束,直到它到達一個速度等於零,因為它瞬間反轉方向。 在角速度相同的變化被觀察為在相反的方向上的反射鏡的旋轉。 應當考慮與諧振電流計的另一個因素是,這些設備是高Q值的振蕩器和不能有效地同步到一個外部頻率,由於在相位和時,即使最輕微的漂移的自然振頻率和外部之間發生振幅大的響應變化驅動源。 因此,諧振電流計本身應被用來作為主振蕩器,而所有其它部件的定時是同步的。

對於諧振掃描共聚焦顯微鏡的基於軟件的時鍾方案涉及的算法,其能夠使用基於反射鏡的可預測的運動的查找表像素數據線性化。 作為一個實例,一種流行的算法首先確定一個相位不變的鏡子和幀接收器,然後定位到最終圖像的中心像素。 該算法運行周圍對稱,其中反射鏡的位置是已知的具有高精確度的中心平麵。 圖像是通過檢查一個水平掃描線在它們被輸送到幀抓取器一次處理。 像素數據被存儲為從掃描儀在最終的圖像寬度的兩倍和一半的最終身高接收。 在這個過程的第一步涉及從水平掃描行的第二半反相數據點,隨後交錯的數據線之間的反碼數據的第一圖像的一半(圖1(b))。 因為該圖像的中點可能不肯定地知道,由於收集數據,觸發采集的水平同步信號和開始之間的時差,它往往是必要的軟件由幾個像素來抵消反相掃描線。 在這種情況下,掃描線的右邊緣,然後用作用於圖像的參考點。 序列中的下一個步驟是應用一個校正因子為每個像素或相位位置相對於中心像素。 該象素,然後重新定位到最終圖像(圖1(c))的正確位置。 在理想情況下,利用先進的高速計算機,輸入的數據可以在飛行中進行分析和記錄實時硬盤。

在諧振電流計的水平掃描期間,定時寄存器光電二極管的激光的散射的倫奇光柵可以被電子地變換為具有可變頻率的像素時鍾脈衝。 這些光脈衝將更加頻繁的時間時,檢流計鏡處於其振蕩周期的中央部分,但由於反射鏡到達掃描結束和反轉方向就會慢下來。 其中所述光電二極管檢測器的要求是處理可變脈衝頻率(在帶寬方麵),它必須足夠大,以檢測整個掃描線的能力。 該檢測器被連接到一個跨導放大器,轉換光電二極管的電流脈衝轉換成一個放大的電壓,然後將其饋送到一個加倍每行的像素數的倍頻電路。 光電二極管和相關的電子器件提供256個脈衝,每行和倍頻電路將這個輸出到512個脈衝,每行是由一個幀抓取器獲得並用於構建圖像。

龍基光柵像素時鍾

示於圖2是基本概念的使用倫奇耦合到一個光電二極管檢測器光柵作為一個變量像素時鍾後麵的圖示。 為清楚起見,在圖2所示的光柵(一)僅包含8疊加有來自諧振電流計隨時間變化的餘弦波運動的一個完整的周期等於寬度的間隔(紅色曲線; 125微秒)。 實際光柵具有256線的間距,並且由於該像素時鍾激光實際上折回單行(垂直於不透明線)跨越在操作光柵表麵(圖2(b))的事實更為緊湊的線性尺寸。 作為光束進入和離開倫奇的清晰區域光柵,是由光電二極管檢測到的上升和下降中的步驟與檢流計的運動(圖2(c))的透射光強度。 由光電二極管檢測到的光強度的每個過渡(在這種情況下,從暗到亮),用於生成像素時鍾(圖2(d)),通過在顯微鏡觸發圖像捕獲。 雖然在圖2(d)示出的時鍾脈衝的非均勻間隔的時間(從約70到160毫微秒),但是,它們分別對應於圖像空間相等的間隔。

為了獲得象素取樣以相等的空間間隔(而不是在時間上相等增量),從主顯微鏡成像係統,光電倍增管的信號通過可變增益放大器的常規和偏移量,並且然後由一個模擬 - 數字轉換器進行數字化觸發通過從倫奇光柵脈衝產生的像素時鍾。 然而,有一半的圖像信息的原因在於,在諧振電流計掃在兩個方向上的事實相反。 為了構建一個圖像之前,以糾正這種雙向掃描神器,數字像素輸出被首先轉移到任何一個先入先出(FIFO)或後進先出(LIFO),緩衝取決於是否從左至右或從右到左被收購像素。 由此,檢流計鏡的水平掃描期間,即在產生的第一掃掠(62.5微秒的時間段)的一半所獲取的圖像的像素被饋送到FIFO緩衝器,而在反向掃描期間所獲得的像素被饋送到後進先出緩衝區。 FIFO緩衝器被讀出和複位到零在每個水平行采集的開始,而後進先出緩衝器中存儲輸入的數據,並隨後讀出期間向下計數,以確保在反向掃描期間所獲得的像素被反轉。



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