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奧林巴斯顯微鏡共聚焦顯微鏡的非相幹光源

2014-07-03  發布者:admin 

 傳統照明係統在現代視場顯微鏡利用透射光的鹵鎢源和熒光激發的短弧燈。各種激光器已在采用作為光源的視場觀察幾個調查員,在顯微鏡,共聚焦顯微鏡的出現大大增加使用激光。這種討論評論的優點和局限性的非相幹 (或非激光) 光源在共聚焦顯微鏡,作為共焦照明的光源和視場顯微鏡共聚焦顯微鏡在次要來源。最初的兩個問題常常出現時的共聚焦顯微鏡的照明係統被認為是,和這些特定儀器光源的選擇有直接的影響。

時選擇係統組件,它是共同的問題是否可以在點掃描共聚焦顯微鏡中使用弧燈。雖然第一次共聚焦顯微鏡,建於 20 世紀 50 年代 (和 Marvin Minsky 1988 回憶錄中討論),采用鋯弧在原型階段掃描工具,短弧燈的光芒是太低,不能在現代點掃描共聚焦顯微鏡中有用。光輝考慮到源,其角發射的配置文件和光輸出的大小。低發散、 甚至謙虛的激光從高輻射通量和小光斑大小,不能通過光束整形光學應用於電弧放電燈源。在圖 1 中介紹的亮度圖的等離子體球從汞 (HBO) 和 (XBO) 氙弧光放電燈。請注意兩個來源的磁通密度的變化。

通常提出的第二個問題是適合用於紡紗磁盤共聚焦顯微鏡下,弧光放電燈,此應用程序是可能的雖然與局限性。再次,限製問題是此源類型的光輝。由於旋轉磁盤共聚焦顯微鏡需要直徑大的、 非常準直的、 統一的梁,同時照亮許多小孔,弧光放電燈有潛力成為適當的來源。受雇於當今紡紗磁盤文書 (通常 1-2%) 的尼普科夫磁盤的低傳輸需要相當大的輸入的功率。一些旋轉磁盤係統利用弧燈照亮 Nipkow 磁盤有相對較大的光圈,並出現了新的設計,增加光照強度。

從橫河廣泛使用的旋轉磁盤掃描程序是利用激光光線由單模光纖耦合到掃描頭。此外,安裝在第二個磁盤上微透鏡陣列與對齊在掃描儀中,增加勵磁光收集關於針孔五倍相比,利用單個磁盤的設備。在掃描過程中的損失頭光學、 波長選擇過濾器和磁盤結果在激發光輸出到後方孔徑的隻是大約 5%的在結束了光纖測量的目的。後方孔徑所需的足夠的信噪比在大多數生物應用程序最小輻照度是物鏡的大約 40 微瓦每平方厘米,雖然可能利用達 120 微瓦每平方厘米。因此,約 5 毫瓦強度是需在光纖光纖輸出。這種光的輸出時在一些短弧燈的能力範圍內,他們都通過多模光纖或液體光導耦合,如下所述。

非相幹光源的特點

弧燈發射波長

在過去,最經常用於波長熒光激發了譜線產生的汞弧 (365、 405、 436、 546 和 579 納米),如圖 2 中給出。很多熒光團因此選擇,使用,因為他們這些激烈的線條,興奮和顯微鏡物鏡被設計給同一波長最優修正。如可用激光波長往往不匹配汞發射譜線,利用激光共聚焦顯微鏡顯微鏡技術人員有時被被迫放棄使用熟悉熒光染料或激發他們在低於最佳波長。圖 2 中所示是一個典型的 100 瓦特汞 (HBO 100) 和 75 瓦特 (XBO 75) 氙弧光放電燈的光譜輻照度概況作為波長的函數。汞燈展品在紫外和可見光區域,幾個峰值,而氙弧燈提出了幾乎連續的光譜非常小高峰 467 納米和近紅外區域的幾個山峰。

汞和氙弧燈譜

超級壓力氙弧光放電燈是經常需要時使用寬的激發波長範圍。它的輸出模擬太陽光,因為它提供了激烈寬帶照明沒有突出的譜線,在紫外光或可見光波長區域 (圖 2)。壓力擴大譜線匹配吸收譜的幾種熒光染料,從而導致更有效的激勵比從窄激光發射線能量相等。加寬的光譜線的可用性也允許同時激活的不同發射波長,包括那些在紫外線的幾種熒光染料。

一致性

非激光光被區別於激光燈由其程度低得多的一致性。非相幹光和相幹光正在限製理論構造。在視場顯微鏡,很少關注的除了當考慮衍射和幹涉效應的照明光的相幹度。在實際意義上,光被認為是非相幹時沒有散斑效應是目前和相幹的時候都。光源,事實上,展覽空間相幹源的角大小的關係和時間相幹性,其波長的帶寬有關。鎢燈絲燈具有相對較低的空間相幹性由於射極大。弧燈擁有更高的一致性,除非大麵積的等離子體 (見圖 1) 用來作為源。

一般情況下,具有低相幹照明期望明視場和反射光學顯微鏡模式下,雖然是必需的階段和幹擾模式的光具有較高的一致性。熒光的過程涉及到足夠數量的激發和發射照明光的相幹性是通常並不重要,和從標本發出的光是基本上非相幹之間的步驟。

如果照明光的相幹性得太高,圖像開發造成的從任何的光學表麵,包括透鏡、 反射鏡、 灰塵 windows 和,尤其是蓋板玻璃反射相幹波波前的幹涉條紋。這種複雜幹擾模式可以顯示為已定義的戒指,但更常見的是,它顯示為高對比度的顆粒散斑,疊加後的圖像,遮蔽的詳細信息。此外,當試樣是透明的有多層的顯微組織,散斑點成為更複雜的人物。廣譜燈照明具有低的時間相幹性,和散斑平均。在大多數情況下,與低相幹照明是常規和共聚焦顯微鏡更可取。另一方麵,通過調整科勒照明係統,以減少源的有效大小,非激光光源還可以提供較高的一致性級別所需的幹涉顯微鏡。

散斑效應是光明的如果在某一特定點周圍的散射中心內從光的幹擾是建設性與那從背景,和黑暗的如果破壞性幹擾發生。明顯的大小的散射中心和個別散斑與相關光學分辨率的限製 (或數值孔徑)。在非相幹光照明,散斑具有不同波長部分取消以產生一個較低的對比度模式之間重疊。由於散斑結果從幹擾現象,任何的光學係統或標本的移動會導致在複雜變化的散斑圖的時間。

光輝

光輝是光通量密度每單位固體可視角度衡量。它表示在瓦每平方厘米每球麵度 (W/cm ^2/sr),並考慮到從來源、 其大小和角度分布的光通量輻射通量。光輝的來源的距離無關,因為采樣的麵積增加的比例。光度法等效措施是卑鄙的或經常表示在單位坎德拉每平方米的平均亮度 (cd/m ^2)。弧燈主要是弧的因為小相比燈燈絲的大小是弧的更加容光煥發比鎢燈絲燈泡瓦數的幾個數量級。鎢燈絲燈泡可以有的細絲狀,允許更有效的利用的光收集係統,和細絲經常彎曲成磁盤或寬而平的樂隊來匹配輸入的光收集光學孔徑。弧燈從一個小的環麵周圍 (見圖 1) 的兩個電極之間的軸產生光。光收集係統需要的光源投射到試樣不僅實現均勻照明的試樣平麵。

非相幹光源的光學顯微鏡
輻射通量
(毫瓦)
光通量
(流明)
光譜輻照度
(毫瓦每平方公尺/納米)
源大小
(以毫米為單位的高度 × 寬度)
HBO 100 瓦 3200 2200 30 (350-700 nm) 0.25 × 0.25
XBO 75 瓦 1460 1000 7 (350-700 nm) 0.25 × 0.50
鎢 100 瓦 4000 2800 < 1 (350-700 nm) 4.2 × 2.3
LED
(UV、 365 nm)
100 0.1 2.5 0.25 × 0.25
LED
(紫羅蘭色,400 毫微米)
250 3.9 6 0.9 × 0.9
LED
(藍色,450 毫微米)
150 116 4.5 0.9 × 0.9
LED
(綠色,520 nm)
10 15.9 0.25 0.25 × 0.25
表 1

表 1 比較常用的光源為視場光學顯微鏡HBO 100 (100 瓦特高壓汞弧光放電燈) 具有最高的光輝 (和平均亮度) 的常用任何的燈具瓦數,由於它非常小的源的大小。顯微鏡技術人員,為內容的光輸出 (光譜輻照度)、 光譜是一個重要的考慮因素時比較各種來源。輻射通量是在所有波長的光輸出的積分並不提供關於其光譜分布的信息。光度法的單位,如平均亮度,在使用時,這一點尤其明顯。因為光度為單位進行加權根據人類的眼睛,輸出中的紫外線或紅外線的光譜敏感性有一個非常小的加權相比,這個綠色的光。輻射通量或光通量的多色和單色的來源 (如激光器和發光二極管) 之間的比較不是輸出的有意義的如果隻有有限的光譜部分的多色源是輸出的將用於。

隻有 47%的 HBO 100 盞燈的輻射輸出介於 320 和 700 納米的波長。大部分能量集中在著名的譜線在 366 毫微米 (大約總數的 10.7%) 436 納米 (12.6%),546 納米 (7.1%) 和 579 納米 (7.9%)。可用輸出從 XBO 75 (75 瓦特氙弧燈),雖然相對統一在 320 到 700 納米的範圍,構成了隻有 24.5%的總額,與大部分落入的用處不在紅外波長的能量 (約 73%的輸出是在波長長於 700 納米) 光譜區域。

XBO 75 (氙) 燈有光譜輻照度的大約 7 毫瓦每米平方每納米 (mW/m ^2/nm ^1) (見圖 2) 的 400 和 700 納米之間。常規的 F/1 的鏡子反射器球形收集器燈箱已收集效率的 12.5%,因此提供約 0.85 毫瓦每納米可用光譜輻照度。因此,如果采用理想 20 納米帶通濾波器,交付的光通量在 20 納米樂隊將 17 毫瓦。如果使用集合鏡子是橢圓的而不是球,它可以捕獲來自四麵八方的弧燈源,從而收集更大立體角內的光的總發射的光。65%的總所發出的光可以通過這樣的係統,收集和輻射通量成大光圈 (大於 5 毫米) 增加達 7 倍相比普通的鏡子反射器球形收集器。不幸的是,預計的射線束擁有黑暗中央點相應的金屬結束了那盞燈,限製這盞燈在中使用類型係統的光源讓液體光導 (進一步討論如下) 人耦合到顯微鏡

穩定性

通過加熱的燈絲到一個更高的溫度,可以提高亮度白熾燈源中的,但這也使金屬崇高的更迅速,變暗的玻璃信封和導致燈絲燒壞。在石英鹵素燈鹵素氣體通過與蒸發鎢形成鎢鹵素化合物,然後分解當他們罷工對熱絲的第一反應中斷這一進程。這兩個過程結合起來,有效地返回鎢燈絲,和從而允許它運作,運作在較高的溫度而變暗燈的信封,不合理的燈絲壽命。當由穩壓的電源供電,在恒定的燈一致信封透明度結果輸出級別,這是足夠穩定,可用於光度測量。

一般情況下,弧燈是比白熾燈更不穩定,因為氣體等離子體是不穩定和受影響的由磁場和由電極的侵蝕。強度的氙弧可深深地和迅速地調製在時間內保持電極冷卻,正如在攝影電子閃光裝置情況。或者,可以通過定期的磁場施加由轉子的永久磁鐵或由一個小的交變電流上主要直接勵磁電流疊加可穩定等離子弧的位置。環繞的 HBO 100 弧部分加熱線圈的另外允許電流通過燈可在很寬的範圍內穩定輸出強度的同時。

發光二極管

發光二極管 (Led) 組成非相幹光源的特點,是有別於弧或鎢燈絲燈泡獨特的範疇。發光二極管產生連續光有效地從包裹中充當一個鏡頭清晰環氧樹脂穹頂的簡單雙元件半導體二極管 (見圖 3)。包括連接在芯片中的兩個半導體地區之一就由負電荷 (n地區),和其他由正電荷 (p區)。當足夠的電壓對電機引線時,當前創建如電子進入跨交界處從np區域負電的電子在哪裏與正電荷相結合。每個組合的收費是可能釋放電磁能量以光子的形式量子的能量水平降低。發射光子的能量是半導體材料的特性,因此,不同的顏色通過在芯片的半導體組成的變化。

光子發光二極管的p-n結通常基於第三組和第五工作組的元素,如砷化镓、 磷化砷化镓和磷化镓的混合物。小心控製的這些化合物,並納入鋁和銦,以及摻雜碲和鎂,此外的其他人的相對比例使製造商和研究人員能夠生產二極管發出紅、 橙、 黃色或綠色光 (見表 2)。這些排放量的帶寬通常是與沒有重要組成部分的紅外或紫外波長 12 和 40 納米之間。最近已允許使用的矽碳化物和氮化镓藍光發射二極管來介紹,並結合幾種顏色不同的組合提供了機製,產生白光。

如圖 3 所示,光從側麵發光二極管半導體芯片的出現,和反映,期待的加入了一個電極 (負極) 的末日到了一杯同時頂部的芯片的臉與金接合線到第二電極 (陽極) 相連。典型的二極管半導體芯片的措施大約 0.25 毫米-廣場和環氧樹脂的身體範圍從 2 到直徑約 10 毫米。最常用的一種發光二極管燈的身體是圓的但它們可能是矩形、 方形或三角形。由二極管反射杯組合發出的光錐的角度可以通過改變環氧樹脂透鏡的形狀,反光杯,和大小和半導體二極管和環氧樹脂透鏡的鼻子之間的距離的幾何改變。清晰環氧樹脂鏡片產生的最高的光輝時它們的輸出僅限於大約 15 度角。

發光二極管的顏色變化
顏色名稱 波長
(納米)
半導體
組成
紅外 880 半導體/砷化镓
超紅 660 半導體/半導體
超級紅 633 鋁镓銦磷
超級橙色 612 鋁镓銦磷
橙色 605 Gaasp 問世/差距
黃色 585 Gaasp 問世/差距
白熾燈泡白 4500 K (CT) 碳化矽氮化銦镓 /
淡白色 6500 K (CT) 碳化矽氮化銦镓 /
冷靜的白色 8000 K (CT) 碳化矽氮化銦镓 /
純綠色 555 差距/差距
超級藍 470 GaN/SiC
藍紫色 430 GaN/SiC
紫外線 395 碳化矽氮化銦镓 /
表 2

雖然已有過去的努力采用發光二極管作為光源的顯微鏡,他們由於早期的設備的低輻射輸出失敗。以前專利的設計,顯微鏡的照明采用大量的分組,以建立一個統一模式的照明的 Led。這種方法產生更高的輻射通量,但未能解決的低的光芒,從這種大型的、 分布式的源的結果。目前天 Led 是足夠明亮功能單獨作為一種有效的單色光照射熒光或透射光鏡觀察。雖然其光譜輻照度仍低於從 HBO (汞) 100 弧燈,譜峰,它接近 XBO (氙燈) 75 可見光譜中的燈。

發光二極管是比弧光放電燈把電力轉換成可見光,實現的達 100 流明每瓦特相比 22 流明每瓦特為 HBO 100 源的產出效率更高。指示燈堅固、 耐用,並可以常常最後 100000 小時在使用中或長於 HBO 100 約 500 倍。綠色指示燈可能具有轉換效率高達 74%。紫色和藍色 Led 光輸出 250 和 150 毫瓦現商業上可用。發光二極管輸出可能調製的高頻率 (10 兆赫MHz) 和它們的輸出亮度可能會受限製可使用的電流,消除機械百葉窗和中性密度濾鏡在顯微鏡的應用需要的特點。

指示燈從根本上單色的排放國,並且高亮度、 單色燈是最廣泛使用的設備當前這一代。有兩種主要方法產生白色光從設備都是從根本上單色的。一種方法基於三種不同的二極管顏色在一個信封裏或在單個 LED,輸出將顯示白色 ; 這種比例在不同的材料相結合另一種技術是利用紫羅蘭色或紫外發光二極管為激發熒光粉發出白色的光 (如圖 4 所示) 提供能量。

收集和中繼試樣的光

共聚焦顯微鏡的所有掃描機製雇用一個照明方法,即填充後方孔徑的物鏡。可用的光從光源耦合對標本是在非激光案例中,某種程度上更多地參與自源,例如弧燈輻射到一個球體,而不是生產平行光束。因此,反射器是圓弧的需要到直接的光從"背麵"走向標本。不需要的波長,如紅外線和紫外線,可以獲準通過兩色鏡 (紅外發射器是記為"冷鏡"和"熱鏡"紫外線發射器),並被吸收在燈具外殼。由冷鏡的散熱減少了開源運動的機械和光學組件熱膨脹引起的。必須適當地固定鏡頭附近熱的來源,以便允許熱膨脹。

柯勒照明是源的最常見的光學照明方案中透射和反射光鏡因為它有助於均勻照亮圖像字段從空間上複雜的源由成像隻到焦平麵的聚光鏡 (或在 epi 照明的物鏡後方焦平麵) 上的一部分。光照射在試樣為偶數,雖然這種光不可能到達,從所有可能的角度與平等的分配。字段孔徑 (位於有效地在一個中間圖像平麵中) 被映像到限製的區域,而不會影響的角度的光線照明照亮的標本。對於高度非均勻的來源,擴壓器可以用於進一步提高均勻性在焦平麵上。柯勒照明不是效率最高的係統,因為它不會使用全表麵的源或全角度分布的所發出的光。

柯勒照明係統的一個主要功能是確保均勻照明,控製其一致性 ;然而,它是可能實現使用一種光導的均勻照明。加擾的光,有效地降低其空間或時間的一致性,也被通過光導的應用。使用最廣泛的和實際耦合方法的一種光源到顯微鏡下,同時也減少了一致性,是以將光線聚焦的靈活的單模式光纖或液體光導 (圖 5) 長度。熱運動中的液體光導不斷改變光學路徑和光線散射,以便有效地消除了空間和時間的一致性。

在撓性單模式光纖包層的反射的情況下不斷改變,因為光纖彎曲略,生產在時間和空間有效均勻,強度有退出梁。據報振動頻率達 100 千赫,纖維的技術能有效地光以及置亂。光的相位被炒由於不同的路徑長度的光波通過纖維,雖然保存下來的高輻射率和單色性。退出梁由"高帽"強度的配置文件,而不是高斯光束分布的激光燈特點被描述。

為了避免可能的熱損傷到光的擾碼器,紅外輻射,以及其他不需要的發射波長應刪除之前他們輸入的纖維或光指南。理想情況下,隻有波長圖像形成的關鍵應該離開的光源。而不是依賴寬帶反射鏡,冰冷的鏡子和帶通幹涉濾光片應采用選擇傳送到孔徑磁盤的光波長,以容許不必要的熱量來逃避。

一個關鍵的問題是進入光纖耦合源燈的輸出的效率。大多數纖維有數值孔徑 0.2 至 0.55,之間,此值應與源集合光學匹配。幾個製造商提供的燈室設計的實施與液體光導在其中滿足此條件。在橢圓反射器、 冷的鏡子和光學匹配的 3 到 5 毫米直徑液體光導 75 瓦特氙弧的組合可以提供超過 2 毫瓦每納米的光輸出 (見圖 5)。光纖端變得的有效光源的顯微鏡燈弧,從而減少在光輝相比,電弧本身的大小無關。然而,當物鏡是光圈的均勻照明的使用大口徑,在磁盤掃描共焦儀器情況一樣,擴展的源是光圈的不損於性能。唯一的要求是準直透鏡的直徑足夠大,以有效地收集輸出從光導和投射到磁盤掃描程序。

旋轉磁盤共聚焦顯微鏡光預算
相幹源
(488 納米氬離子激光器)
在單模光纖輸出的輻射通量 9 毫瓦
物鏡孔徑輻照度 120 微瓦每平方厘米
非相幹源
(XBO 75 燈,5 毫米的液體導光,
和 20 納米帶通濾波器)
在液體光導輸出輻射通量 28.5 毫瓦
物鏡孔徑輻照度 36 微瓦每平方厘米
表 3

表 3 總結了經驗豐富的與非相幹和相幹照明橫河紡紗磁盤共聚焦儀的典型結果。在這個特定的配置中,相幹光照明係統包括通過聲光可調諧濾光器 (AOTF) 耦合多線激光對單模式光纖。這種光纖的輸出是 0.3 的數值孔徑,擴大到一個均勻的光束直徑 14.5 毫米並隨後形高斯光束。通過一個路徑,允許引進外部濾波器滑塊或輪的波長選擇鏡像反映此擴的束。通過引入一個鏡子和波長選擇性的過濾,在篩選器滑塊位置,就有可能從耦合到 XBO 75 燈安裝在橢圓反射器液體光導介紹的擴大和準直的輸出。要產生 20 毫米直徑光束的光強均勻,用平凸透鏡準直光纖的輸出。橫河共聚焦顯微鏡的標準紅-綠-藍 (RGB) 二向色鏡允許三個波段,每個 20 納米的帶寬,將被傳送。表 3 比較了到後方孔徑的勵磁藍色光光譜區域 (488 納米激光線和 470 490-納米弧燈的輸出) 這兩個源的物鏡的光通量。光通量值清楚地表明非相幹源可以為此應用程序提供足夠的能量。

充分利用旋轉磁盤共聚焦顯微鏡中的多色源需要廣泛的波長選擇性過濾器和兩色鏡。雖然篩選器隨時可用,橫河儀器采用兩色鏡子是不尋常的設計,以及有限的可用性。目前,缺乏更大範圍的適合兩色鏡可防止電弧源在此設備中充分利用。

審議的當前設備的光照屬性指示發光二極管還會適合此旋轉磁盤應用程序中。耦合單 LED 到多模光纖或液體光導是一個簡單的問題,和隨時可以通過定位 LED 在後方孔徑的廉價低倍率物鏡 (如 10 x 平場消色差) 對光夫婦到纖維。多數 LEDs 有輸出帶寬的 20-40 納米,所以至少一半的光輸出會通過二向色鏡的 20 納米帶寬。基於前麵所討論的橫河掃描儀中的光損失測量,約 1-2 毫瓦必須達到旋轉磁盤,以實現所需的 40 微瓦每平方厘米在物鏡後方光圈。因此,10 毫瓦單色輸出發光二極管可能就足夠了。然而,如果多色 LED 光源是必要的目前一天白色發光二極管缺乏的輸出功率和均勻的光譜輻射亮度所需。

結論

非相幹光照明來源很少使用在紡紗磁盤共聚焦顯微鏡,雖然最共焦儀器配備弧燈視場視覺觀測的標本。審查的短弧燈的特點說明了適當旋轉磁盤共聚焦顯微鏡可以有效地使用。此外,它很可能發光二極管將提供廉價、 壽命長、 穩定、 高效、 照明的視場和磁盤掃描共聚焦顯微鏡。



滬公網安備 31011202003519號