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奧林巴斯顯微鏡共聚焦的熒光團

2014-07-06  發布者:admin 

 生物激光掃描共聚焦顯微鏡技術嚴重依賴熒光作為一種成像方式,主要是由於高度的敏感性提供的技術,結合的能力為專門物鏡結構成分和化學固定,以及生活的細胞和組織的動態過程。很多熒光探針都被圍繞著設計與生物大分子 (例如,蛋白質或核酸) 綁定或本地化具體結構在區域內,如細胞骨架、 線粒體、 高爾基體、 內質網、 和核合成芳香族有機化學品。其他探測器采用動態過程和本地化環境變量,包括無機金屬離子、 ph 值、 活性氧物種和膜電位的濃度進行監測。熒光染料也是有用的監測細胞的完整性 (活與死和細胞凋亡的)、 內吞、 胞吐作用、 細胞膜的流動性、 蛋白販運、 信號轉導、 和酶的活性。此外,熒光探針在分子遺傳學領域的遺傳映射和染色體分析中被廣泛應用。

合成熒光的曆史回超過一個世紀到 19 世紀後期,當許多現代組織學的基石染料都是開發探頭的日期。其中副玫瑰苯胺、 甲基紫、 孔雀石綠、 番紅 O 染色、 亞甲藍和無數的偶氮 (氮) 染料,如俾斯麥布朗。雖然這些染料高度有色和能夠吸收可見光的選定的樂隊,多數隻是弱熒光,不會有用的幾十年後會發展的熒光顯微鏡。然而,幾個合成染料類合成在此期間,基於氧雜蒽、 吖啶雜環係統,被證明是高度熒光和為現代合成熒光探針的發展提供了基礎。其中最值得注意早期熒光染料被取代的沢、 熒光素和羅丹明 B 和 biaminated 吖啶衍生物,吖啶橙。

熒光染料作為重要汙漬細菌、 原生動物和錐蟲,二十世紀早期介紹了熒光顯微鏡,但沒有看到直到 20 世紀 20 年代時熒光顯微鏡最初是用來研究染料結合固定的組織和活細胞中廣泛使用。然而,直到 1940 年代初陳偉業 Coons 開發技術用於標記抗體與熒光染料,因此生育領域的免疫熒光。過去的 60 年裏,免疫學和分子生物學的研究進展已產生廣泛的二次抗體和提供有針對性的在特定區域內高分子配合物的熒光探針的分子設計的洞察。

熒光探針技術和細胞生物學被大大的綠色熒光蛋白 (GFP) 的發現改變了從水母和發展的突變譜的變種,有非侵入性熒光多色的調查的蛋白質亞細胞定位開門後,分子間相互作用,和販賣使用活細胞培養。更最近,熒光半導體納米量子點的發展提供了一條新途徑的研究共聚焦和視場熒光顯微鏡。盡管過去幾十年期間所作的熒光染料合成了許多進步,但還有很少有力的證據有關的分子設計規則發展新的熒光染料,特別是匹配到可用的共聚焦激光激發波長的吸收譜。其結果是,熒光共聚焦顯微鏡中發現普遍使用的數量是已發現的許多數以千計的有限的子集。

熒光團的重要特征

熒光團被編目,並根據其吸收光譜和熒光光譜的特性,包括譜線輪廓,所述波長的最大吸收和發射和發射光的熒光強度。最有用的定量參數表征吸收譜之一就是摩爾消光係數 (用希臘符號ε表示,見圖相,是直接衡量一個分子的吸收光的能力。消光係數是有用的吸光度單位轉換的摩爾濃度,單位為,由測量 (通常最大值、 吸收物種特征) 參考波長處的吸光度為已定義的光學路徑長度的摩爾濃度。熒光染料或熒光量子產率代表熒光發射效率的定量指標的到的光子吸收的數量的光子數之比來表示。換言之,量子產率表示給定的興奮熒光色素會產生排放 (熒光) 光子的概率。量子產量通常範圍內的值為 0 和 1 之間,和熒光分子一般都采用作為探針顯微鏡有量子產率從非常低 (0.05 或更少) 到幾乎統一。一般情況下,高量子產率是可取的大多數成像應用程序。給定的熒光量子產率的變化,有時到大型的極端氣候,環境因素,如金屬離子的濃度、 ph 值、 和溶劑極性。

在大多數情況下,光子吸收的摩爾消光係數是定量地測量和表示特定波長的光,而量子效率是評估的總集成的光子發射超過整個的熒光譜帶 (見圖 2(b)))。而不是傳統的弧光放電燈與最短範圍 (10-20 納米) 帶通幹涉濾光片在視場熒光顯微術中使用,用於在掃描共聚焦顯微鏡熒光激發的激光係統限製到特定的激光譜線,其中應包括隻有幾個納米的勵磁。然而,對於這兩種技術,熒光發射譜由類似的帶通或 longpass 篩選器,可以覆蓋幾十到幾百納米的控製。低於飽和的程度,熒光強度成正比的摩爾消光係數乘積和量子產率的熒光,一種關係,可以用來判斷排放作為一個功能的勵磁 wavelength(s) 的成效。這些參數顯示大約 20-fold 的範圍中常用的共聚焦顯微鏡的調查與量子產率從 0.05 到 1.0,流行熒光分子的變異和消光係數的範圍從 1 萬到 25 萬 (摩爾每升)。一般情況下,吸收譜的熒光基團是遠少依賴環境條件比熒光發射特性 (光譜波長配置文件和量子產率)。

熒光共聚焦應用程序選擇必須表現出的亮度水平和信號足夠的儀器,獲得沒有遭受過度漂白工件和低信號信噪比的圖像數據的持久性。在熒光顯微鏡視場,勵磁照度水平很容易受控製的中性密度濾鏡和強度可以減少 (耦合期較長發射信號收集的),避免飽和,並削減不可逆損失的熒光。激勵條件在共聚焦顯微鏡中的然而,是更嚴重的是,幾個數量級,熒光特性及效率的顯微鏡光學係統所施加的限製成為決定勵磁率和排放收集戰略的主導因素。

激光與電弧放電光譜線
在視場和共聚焦顯微鏡觀察
紫外線 紫羅蘭色 藍色 綠色 黃色 橙色 紅色 近紅外
氬離子 351、 364 - 457、 477、 488 514 - - - -
Diode - 405、 440 - - - - 635、 640 650、 685
DPSS 355 430、 442 457、 473 532 561 593 638 660、 671
He-Cd 322、 354 442 - - - - - -
Kr-Ar - - 488 - 568 - 647 676
氪離子 - - - - - - 647 676、 752
氦-氖 - - - 543 594 612 633 -
汞弧 365 405、 436 - 546 579 - - -
氙弧 - - 467 - - - - -
金屬鹵化物 365 435 495 520、 545 575 - 625 685
表 1

由於受雇來激發熒光共聚焦顯微鏡在狹窄和波長限製激光譜線 (見表 1),熒光發射強度可以嚴重地限製由於窮人交疊的激發波長熒光基團吸收帶。此外,共聚焦針孔孔徑,這是獲得光學切片在高信號信噪比的關鍵,是負責 25 到 50%損失的碳排放強度,無論多少的努力上的微調和顯微鏡光學係統的對齊方式。光電倍增管在共聚焦顯微鏡,是最常用的檢測器,但是遭受隨波長 (尤其是在紅色和紅外的區域),導致進一步的信號的波長依賴性損失跨發射譜函數的量子效率。集體,共聚焦顯微鏡的光損失可以導致減少的強度超過 50 倍的視場熒光文書中,一般觀察到的水平。它應該從前麵說的熒光選擇是的共聚焦顯微鏡,最關鍵的方麵之一,器樂效率必須認真考慮,以及,以生產高質量的圖像清晰。

在共聚焦顯微鏡、 熒光分子與在高功率密度的激光聚焦的光束照射增加排放強度達到點的染料飽和,其參數聽寫的激發的態壽命的一個條件。在興奮狀態下,熒光團都無法吸收另一個入射光子,直到他們發出一個低能量的光子通過熒光過程。當的熒光激發率超過排放衰減率時,分子變得飽和和地麵狀態人口有所下降。結果,在大多數的穿越,試樣的激光能量不減,並不有助於熒光激發。因此,平衡熒光飽和與激光光強水平是實現最佳的信號對噪聲比共聚焦實驗中至關重要的條件。

數百人,用許多染料具有吸收最大值與常見的激光譜線密切關聯運行的共聚焦顯微鏡熒光探針當前可用的數量。特別是激光線和吸收最大的特異性探針之間的精確匹配並不總是可能的但接近最大值的行的激勵效率是通常足以產生水平可以很容易檢測到的熒光發射。例如,在圖 3 中吸收譜的兩個常見探頭說明,以及最高效率的激光激發線。綠色光譜是熒光素異硫氰酸酯 (FITC),具有吸收最大值為 495 納米吸水剖麵。在使用氬離子激光的 488 納米 FITC 熒光激發產生約 87%的發射效率。相反,當使用 477 納米或 514-納米氬離子激光線激發 FITC,發射效率降到僅 58%或 28%,分別。顯然,488 納米氬離子 (或氬氪) 激光線是這熒光激發的最有效源。

在圖 3 中的紅色譜是 Alexa 氟 546,bi 磺化脂環氧雜蒽 (羅丹明) 衍生物與最大消光係數在 556 納米,這專為在的光漂白熒光實驗中水平顯著降低顯示增加的量子效率設計吸水剖麵。Alexa 氟 546 效率最高的激光激發光譜線是黃色 568 納米線從氪氬混合的氣體離子激光器,其產生排放大約 84%的效率。下一個最接近激光譜線,543-納米線從綠色氦-氖激光和 594 納米線的黃色氦-氖激光,分別激發 Alexa 氟 546 效率為 43%和 4%。請注意 488 納米氬離子激光譜線激發 Alexa 氟 546,大約 7%的效率,可以關注當同時進行雙重標記實驗與 FITC 和 Alexa 氟 546 的一個因素。

歸結,通過精心選擇的物鏡、 探測器孔徑尺寸,兩色和屏障的篩選器,以及維持在精確對齊的光學火車可以優化熒光發射集合。在大多數情況下,低放大倍數高數值孔徑的物鏡應該為要求最苛刻的選擇成像條件因為光收集強度增加作為第四權力的數值孔徑,但隻會降低放大倍數的平方。然而,最重要的局限在共聚焦顯微鏡的光收集效率出現的熒光團本身的物理性能所施加的限製。作為前麵討論的熒光探針發展受限於特定的分子特性負責生產最佳的熒光特征,知識缺乏和設計規則不夠,應理解為為指導,以更有效率的熒光團的發展很有幫助。在發展中新的熒光探針能夠令人滿意,在共聚焦顯微鏡中目前的成功是性能的通過利用經驗數據和分子的結構從現有染料,其中很多第一次合成了一百多年前的性能推斷出的假設取得的進展的證明。

傳統的熒光染料

共聚焦顯微鏡熒光探針的選擇必須處理儀器來激發和檢測熒光發射波長區域由激光係統和探測器提供的特定的功能。盡管當前激光共聚焦顯微鏡中使用 (見表 1) 產生離散線在紫外、 可見、 和光譜的近紅外部分,這些譜線的位置並不總是符合流行的熒光團的吸收最大值。事實上,它是不必要的激光譜線完全吻合熒光波長的最大吸收,但熒光發射的強度由熒光消光係數在激發光波長 (如上所述)。最受歡迎激光共聚焦顯微鏡是風冷的氬和氪氬離子激光器、 新的藍色二極管激光器和各種各樣的氦-氖係統。總的來說,這些激光器都能夠提供勵磁十到十二特定波長 400 和 650 納米之間。

很多的古典的熒光探針已成功地利用多年來在視場熒光,包括熒光素異硫氰酸酯 (見圖 1 (a),圖 2 和圖 3),麗絲羅丹明和德克薩斯紅色 (圖 1 (c) 所示的結構 ; 光譜圖 2 中的),也是在共聚焦顯微鏡中有用。熒光素是設計過,最受歡迎的熒光染料之一,並享有在免疫熒光標記中的廣泛應用。這呫噸染料具有吸收最大值在 495 納米 (見圖 2 (a) 和圖 3),正好與 488 納米 (藍色) 譜線產生的氬離子和氪氬激光器以及 436 和 467 的主線中的汞和氙弧光放電燈 (分別) 很好。此外,熒光量子產率是很高,這種染料在物理和化學特性方麵的特點已收集了大量的信息。消極的一麵,熒光素的熒光發射強度嚴重影響環境因素 (如 ph 值)、 和相對廣泛的發射譜與那些其他熒光團在雙重和三重貼標實驗中經常重疊。

四甲基羅丹明 (TMR) 和異硫氰酸酯衍生物 (TRITC圖 4(b)) 經常在多個標簽調查在視場顯微鏡由於其有效的激勵采用汞弧光放電燈 546 納米光譜線。由 543 納米線從氦-氖激光,但不是由 514 或 568 納米線從氬離子和氪氬激光熒光染料,其中有大量排放物與熒光素光譜重疊,可以非常有效地激發。使用基於氪激光係統,麗絲羅丹明時最高,在 575 納米吸收和熒光素及其光譜分離此熒光色素類中更好的選擇。羅丹明衍生物的熒光發射強度也不一樣依賴於嚴格環境條件的熒光素。

吖啶染料,在十九世紀,首次分離出的一些有用作為熒光探針在共聚焦顯微鏡中。最廣泛的應用,吖啶橙,包括基本吖啶核與二甲胺基取代基位於三核環係統的 3 和 6 位置 (如圖) 所示。在生理 ph 值範圍內,分子是在氮雜環類質子化和存在主要作為在溶液中的陽離子種類。吖啶橙強烈綁定到 DNA 之間連續堿基對,吖啶核的插層和展覽與最大波長為 530 納米綠色熒光。探頭也強烈結合 RNA 或單鏈 DNA,但有一段較長波長熒光最大 (約 640 納米 ; 紅色) 當綁定到這些大分子。在活細胞中吖啶橙擴散到細胞膜上 (即為質子化常數),積累了在溶酶體和其他酸性的囊泡。類似於大多數 acridines 和相關多環氮雜環化合物,吖啶橙有比較廣泛的吸收譜,使探針,用於與幾個從氬離子激光的波長。

另一種流行的傳統探頭在共聚焦顯微鏡中有用的是 phenanthridine 導數,碘化丙啶,首次合成作為抗錐蟲效果的代理和密切相關的溴化乙錠 (圖有賴於。碘化丙啶與 DNA 結合的方式類似於 (通過插層) acridines 生產中心在 617 納米的橘紅色熒光。正電的熒光也有高親和力的雙鏈 RNA。丙啶在 536 納米,吸收最大值,可以激發 488 納米或 514-納米光譜線氬離子 (或氪氬) 的激光或從綠色氦-氖激光 543 納米線。染料每每是複染劑在雙過程中突出顯示細胞核或標記的多個胞內結構的三倍。環境因素可以影響熒光光譜的丙啶,尤其是當染料使用與安裝媒體包含甘油。結構相似的溴化乙錠,其中還將綁定到 DNA 通過插層,產生更多的背景染色,因此不像丙啶一樣有效。

DNA 和染色質也可以用外部綁定到雙螺旋結構的染料染色。在此類別中最受歡迎的熒光染料是 4'、 6-脒-2-苯基吲哚 (DAPI; 見圖 1 和圖 2) 和指定的數字 33258、 33342 和 34580 雙苯甲亞胺Hoechst染料。這些探頭是相當水溶性和外部綁定到在富堿基對集群的雙鏈 DNA 小溝與急劇增加中熒光強度。這兩種染料類可以由 351 納米光譜線的高功率的氬離子激光器或 354 納米線從氦鎘激光刺激。類似於 acridines 和 phenanthridines,這些熒光探針作為核複染劑在多色熒光標記協議中使用是最受歡迎的選擇。生動的藍色熒光發射產生巨大反差時耦合到綠色、 黃色和紅色探頭在相鄰的細胞結構。

Alexa 氟染料

現代熒光技術的巨大進步的例子是由分子探針介紹的 Alexa 氟染料 (Alexa 氟是分子探針的注冊的商標)。這些磺化羅丹明衍生物更強烈熒光發射比光譜類似展覽更高的量子產率進行了探討,和有幾個其他改進的功能,包括增強的光穩定性,吸收譜與普通激光線條、 ph 值不敏感和水溶解度的高度匹配。事實上,Alexa 氟染料的光漂白的抗性是如此富有戲劇性即使受到高強度激光源的照射,熒光強度仍保持穩定,在 antifade 試劑沒有相對較長時間。此功能使可溶性 Alexa 氟探頭很容易利用活細胞和組織的部分調查,以及傳統的固定製劑中的水。

Alexa 氟染料,可在範圍廣泛的熒光激發和發射波長極大值,從紫外線和深藍色到近紅外區域。個別染料的字母數字名稱與特定激勵激光相關聯或弧光放電燈譜線探針針對的。例如,Alexa 氟 488 (如 5(c)) 專供勵磁的藍 488 納米線的氬或氪氬離子激光器,而 Alexa 氟 568 568-納米光譜線的氪氬激光與相匹配的圖所示。Alexa 氟染料的幾個專門設計用於勵磁要麽藍色二極管激光 (405 納米 ; 見 Alexa 螢石 405 化學結構中圖 5(a)),黃色/橙色氦-氖激光 (594 納米) 或紅色的氦-氖激光 (633 納米)。與傳統的汞弧光放電燈中的可見 (Alexa 氟 546) 或紫外線 (Alexa 氟 350,與高功率的氬離子激光器 ; 也有用其他 Alexa 氟染料用於勵磁圖 5(b)) 和固態紅色二極管激光器 (Alexa 氟 680)。由於大量的可用的激發和發射波長在 Alexa 氟係列中的,多個標記實驗往往可以完全與這些染料進行。

Alexa 氟染料市麵上作為活性中間體的馬來酰亞胺、 琥珀酰亞胺酯、 酰肼、 形式,以及編寫細胞骨架探針 (共軛對鬼筆,G-肌動蛋白和兔骨骼肌肌肌動蛋白) 和凝集素、 糊精、 鏈黴親和、 抗生物素蛋白、 生物胞素,和種類繁多的二級抗體複合物。在後一種形式中,Alexa 螢石熒光團為免疫細胞化學、 神經科學和細胞生物學調查提供了一個廣泛的調色板的工具。家庭的探針也已擴展到一係列的染料具有重疊的熒光發射極大值針對複雜的共聚焦顯微鏡檢測係統的光譜成像技術和線性混合像元分解能力。例如,Alexa 氟 488、 Alexa 氟 500 和 Alexa 氟 514 看上去很相似的顏色與明亮的綠色熒光,但擁有不同排放的配置文件。此外,三種熒光染料可以很興奮與氬離子激光 488 或 514-納米光譜線,並很容易被發現與傳統的熒光素篩選器組合。在多光譜 (x-y-λ; 稱為lambda 堆棧) 共聚焦成像實驗,光分離軟件可以被用來區分之間的相似的信號。重疊的發射譜的 Alexa 氟 488、 500 和 514 都被隔離在單獨的通道,並且區分使用偽彩色技術,當三個熒光團同時結合三重標簽調查中。

菁染料

菁染料、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy7,和他們的衍生物,最受歡迎的家庭都基於部分飽和吲哚氮雜環核與兩個芳香單位正在通過不同碳數的聚烯烴橋連接。這些探頭展覽熒光激發和發射性能的配置文件類似於許多傳統的染料,熒光素和四甲基羅丹明,但與強化的水溶解度、 光穩定性和更高的量子的收益率。菁染料的大部分都是更多比他們傳統的同行,渲染其熒光發射強度不太敏感的 ph 值和有機安裝媒體環境穩定。方式類似於 Alexa Fluors,Cy 係列的合成染料激發波長的普通激光和弧光放電來源,專門用於調整和傳統的篩選器組合,可檢測熒光發射。

由大量的分銷商銷售,菁染料是現成的作為活性染料或熒光團耦合到種類繁多的二級抗體、 糊精、 鏈黴親和卵白抗生物素蛋白。菁染料一般有更廣泛的吸收譜區域比 Alexa 氟家庭,使他們稍微更加多才多藝的共聚焦顯微鏡激光激發源的選擇的成員。例如,使用氬離子激光 547 納米光譜線,Cy2 兩次是一樣有效的熒光發射作為 Alexa 氟 488。以類似的方式,514 納米氬離子激光線激發 Cy3 具有很高的效率比 Alexa 氟 546,光譜相似的探針。菁染料的排放概況相若的光譜寬度 Alexa 氟係列。

包括在菁染料係列是長波長 Cy5 金融衍生品,都興奮的在紅色區域 (650 納米) 和遠紅光 (680 納米) 波長發出。Cy5 熒光效率很高非常興奮 647-納米光譜線的氪氬激光、 633 納米線的紅色氦-氖激光或紅色二極管激光器,提供了在激光選擇的多功能性的 650 納米線。因為從傳統熒光激發的紫外光和藍光照明顯著移除,發射譜線輪廓,Cy5 是經常利用作為第三個熒光體在三重標簽試驗。然而,類似於其他探針與熒光發射遠紅光光譜區域,Cy5 並不是對人眼可見隻可以以電子方式檢測到 (使用一個專門的 CCD 攝像係統或光電倍增管)。因此,探頭很少使用常規視場熒光實驗中。

環境的熒光探針

熒光團旨在探討活細胞的內部環境廣泛審查了大量的調查人員,並製定了幾百個監視這種作為本地化濃度的堿金屬和堿土金屬、 重金屬 (聘用生化酶的輔助因子)、 無機離子、 硫醇和硫化物,亞硝酸鹽,以及 ph 值、 溶劑的極性和膜電位的影響。原來,在這個舞台上實驗的重點的波長和強度的吸收光譜和發射光譜展出由後綁定鈣離子熒光測量細胞內的磁通密度的變化。這些探頭綁定到物鏡離子具有高度的特異性產生的測量的響應,通常被稱為光譜敏感的指標由光比信號分析的應用程序監視協會平衡離子和它的宿主之間確定離子濃度的變化。這種技術從派生的濃度值大體上是獨立的器樂變化和探針濃度波動由於光漂白、 荷載參數和單元格保留。在過去的幾年中,一些新的代理商已綁定特定離子或具有可測量的特征響應其他的環境條件。

鈣是一種代謝的重要離子在細胞對許多形式的外部刺激的反應中發揮著至關重要的作用。因為鈣離子濃度的瞬態波動通常涉及細胞進行響應時,熒光團必須設計測量不僅本地化的濃度在種族隔離的隔離艙,但還應編製數量方麵的變化,當磁通密度波整個細胞質的進展情況。許多合成的分子設計用於測量鈣的水平基於非熒光螯合劑EGTABAPTA,其中已使用多年,封存在緩衝溶液中的鈣離子。兩個最常見的鈣探針是比率指標 fura 2 和印-1,但這些熒光不在共聚焦顯微鏡中特別有用。染料的紫外線激發和綁定鈣時表現出的勵磁或發射譜與形成的等色點的轉變。然而,與紫外成像、 有限的標本穿透深度和紫外激光器的費用相關的光學像差有限這些探頭在共聚焦顯微鏡中的效用。

回應在可見範圍內鈣離子通量的熒光團,不幸的是,並不是比率指標不陳列後具有約束力,雖然他們做進行增加或減少的熒光強度 (典型的 fura 2 和印 1) 波長漂移。最好的例子是一複雜的氧雜蒽衍生物,經曆在 525 納米 (綠色) 的熒光發射急劇增加時所 488 納米光譜線的氬離子或氬氪激光激發熒光-3。等色點不是目前要保證濃度波動上的沒有的因為它是無法確定的光譜變化是否由於複雜地層或與熒光 3 和類似的熒光團的濃度變化。

為了克服缺少波長的變化 (和等色點) 的可見光探針與相關的問題,這些染料的幾個常常利用共聚焦顯微鏡中鈣測量相結合。Fura 紅色的一種多核的咪唑和苯並呋喃雜環化合物,展品在 650 納米熒光減少鈣在綁定時。當熒光 3 和 fura 紅色的混合物興奮在 488 納米,衡量熒光的發射極大值處,可以得到對鈣離子通量的比例式響應 (525 和 650 納米,分別) 的兩個探頭。因為熒光 3 的發射強度的增加而單調,同時 fura 紅色的同時減小,等色點當時獲得的染料濃度恒定在被調查 (如圖 7 所示) 的局部區域內。使用這些探測器在一起的另一個好處是衡量標準 FITC/德克薩斯紅色幹擾濾波器結合熒光強度波動的能力。

以類似的方式使用類似熒光團進行定量測量的鈣、 鎂、 鈉、 鉀、 鋅、 等以外的離子。最受歡迎的探頭,用於鎂,mag fura 2 (結構上類似於 fura 紅色),之一也興奮的紫外範圍內和提出同樣的問題在共聚焦顯微鏡觀察了作為 fura 2 和印-1。熒光團興奮在可見光區域正成為可供在不同濃度在細胞基質中存在的很多單價和二價陽離子的分析。幾個合成有機探針也已的簡單和複雜的陰離子濃度監測。

重要的熒光顯示器的細胞內 ph 值包括稱為或熒光素衍生物, BCECF,pyranine,芘衍生物,另一種取代氧雜蒽稱為羧基竊用 1。因為很多常見的熒光團是敏感的周圍介質的 ph 值,通常歸因於生物相互作用的熒光強度變化實際上可能發生質子化。在生理 ph 值的範圍 (pH 6.8-7.4),如上文所述的探針是雙波長比例式測量非常有用,並且僅在染料的加載參數不同。鈣離子濃度和 ph 值的同時測量往往可以通過結合 pH 指示劑,如竊用-1,與鈣離子指標 (例如,fura-2)。其他探測器已經為 ph 值測量在亞細胞的艙室,如溶酶體,如下所述。

細胞器探針

熒光團針對特定的細胞內細胞器,如線粒體、 溶酶體、 高爾基體,內質網,可用於監測各種生物進程中用共聚焦顯微鏡的活細胞。一般情況下,細胞器探針由附加到特定於目標的基團,協助本地化通過共價、 靜電、 疏水性或類似類型的債券熒光熒光色素原子核組成。很多設計選擇細胞器的熒光探針能夠滲透或封存在細胞膜內 (和因此,都是有用的在活細胞中),同時必須安裝其他使用單克隆抗體與傳統的免疫細胞化學技術。在活細胞中細胞器探針是有用的調查運輸、 呼吸、 有絲分裂、 細胞凋亡、 蛋白質的降解、 酸性的隔間和膜現象。細胞通透熒光應用包括核函數、 細胞骨架結構、 細胞器檢測探頭,用於膜完整性。在許多情況下,有帶滲透探頭貼上標簽的活細胞隨後可以固定和額外熒光多色貼標實驗中用複染。

線粒體探頭之間的最有用的熒光團調查細胞呼吸作用是,都經常和其他染料調查采用的多個標簽。傳統探頭、 羅丹明 123 和 tetramethylrosamine,是迅速丟失時細胞固定的很大程度上已經取代了由更新的、 更具體的熒光分子探針由開發。這些包括最受歡迎的 MitoTracker (見圖 8(b)) 和 MitoFluor 係列的結構多樣性氧雜蒽、 苯並噁唑、 吲哚、 苯並咪唑雜環化合物在各種各樣的激發和發射譜線輪廓中可用。其作用機理為每個在這個係列中,從共價鍵附著到氧化呼吸線粒體膜內探頭各不相同。

MitoTracker 染料細胞固定在甲醛後很好保留,並且可以經常承受親脂性 permeabilizing 代理。相比之下,MitoFluor 探頭被專為積極呼吸細胞和不適合固定和染的程序。另一個受歡迎的線粒體探頭,題為 JC-1,作為非常有用的膜電位和在多個固定細胞染色實驗中的一個指標。這種碳菁染料展品在低濃度時,綠色熒光,但可以進行分子內的協會積極線粒體內產生排放轉向 (紅色) 波長較長。發射波長的改變是有用在確定活動到非活動在活細胞中的線粒體的比率。

一般情況下,弱的基本胺,能夠通過膜調查生物合成和在溶酶體中的發病機製是理想的人選。傳統的溶酶體探針包括非特定吩嗪和吖啶衍生物中性紅、 吖啶橙,積累後被質子化酸性囊泡。熒光標記的乳膠顆粒和大分子,如葡聚糖,可也累積在溶酶體中通過內吞作用的各種實驗。然而,調查共聚焦顯微鏡的溶酶體屬性最有用的工具都是由分子探針開發的 LysoTracker 和 LysoSensor 的染料。這些結構多樣性的代理包含調節運輸的染料進入的短期和長期的研究活細胞的溶酶體的氮雜環和脂肪族基團。LysoTracker 探頭,可用在各種激發和發射波長,具有高選擇性,為酸性的細胞器,有能力的標記細胞在納摩爾濃度。染料的幾個保留得很好後修複和細胞的通透。與之相反,LysoSensor 熒光團 (圖 8(a)) 設計為研究活細胞中溶酶體功能的動態方麵。熒光強度明顯增加後質子化,使這些染料 ph 值指標作為有用的 LysoSensor 係列。各種各樣的高爾基體特異性單克隆抗體也已在免疫細胞化學檢測方法中使用。

蛋白質和脂類進行排序和處理在高爾基器具,通常沾有神經酰胺和鞘脂的熒光衍生品。這些代理商是高度親脂性,,因此作為標記為脂質運輸和活細胞代謝的研究很有用。最有用的高爾基體熒光分子的幾個包含由分子探針開發複雜雜環BODIPY原子核。當耦合到鞘脂,BODIPY 熒光是高度選擇性和展覽一個容忍的是遠遠優於許多其他染料的光漂白。此外,發射譜是依賴於濃度 (轉移從綠色到紅色的在更高的濃度),使探頭對定位和確定積累大量的脂類的細胞內結構有用。活細胞在試驗期間,脂質熒光探針可以進行新陳代謝的衍生品,可以綁定到其他亞細胞的功能,可以經常使實驗數據的分析變得複雜的一個因素。

內質網熒光分析的最受歡迎的傳統探針分別是碳菁和氧雜蒽染料、 DiOC(6) 和幾個羅丹明衍生物。這些染料必須謹慎使用,然而,因為他們也可以積累在線粒體、 高爾基體和其他細胞內的親脂性區域。更新、 更多的基質,幾家製造商已經為選擇性染色內質網的探頭。尤其是,噁唑家庭成員的 Dapoxyl 產生的分子探針 (見圖 8(c)) 是優秀代理商為選擇性標記在活細胞中內質網的單獨或與其他染料的組合。這些探頭與甲醛、 固定後保留,但可能會丟失與 permeabilizing 洗滌劑。另一個有用的探測器是蛋白質的 Brefeldin A,stereochemically 複雜的真菌代謝產物,作為抑製劑從內質網販運。最後,類似於其他細胞器,單克隆抗體已經開發了這一目標固定細胞的免疫細胞化學調查中內質網。

量子點

納米級晶體的純化半導體量子點被稱為正在作為潛在的有用的熒光標簽代理為生活和固定細胞在傳統視場和激光掃描共聚焦熒光顯微鏡。最近引進的技術使純化極小的半導體晶體塗層與親水性聚合物外殼和共軛對抗體或其他生物活性肽和碳水化合物為在很多古典的免疫細胞化學技術協議中的應用。這些探頭對有機染料、 熒光蛋白,包括長期耐光性、 高熒光強度級別和多種色彩與排放的所有配置文件的單波長激發有顯著的好處。

量子點產生的方式類似於著名的半導體發光二極管照明,但是由吸收一個光子,而不是一種電刺激激活。被吸收的光子與具有較低能量的光子的並發排放創建一個快速重組的電子-空穴對。用於生產生物量子點迄今為止發現的最有用半導體是硒化鎘 (CdSe),一種材料的發射光子的能量是納米晶體顆粒的物理大小的函數。因此,有大小的差異僅在於十分之納米量子點發出不同波長的光,與發光更短的波長,尺寸較小,反之亦然。

不像典型的有機熒光或熒光蛋白,顯示的高度定義的譜線輪廓,量子點具有穩步增加與減少波長的吸收譜。相比之下,熒光發射強度也限於是依賴於圓點的大小,而是獨立的激發波長最大波長對稱的高峰。結果,相同的發射配置文件觀察無論是否對量子點興奮在 300、 400、 500 或者 600 納米,但熒光強度大大增加了在較短的激發波長。例如,發出橙色區域 (605 納米) 典型的量子點共軛的消光係數是約高 5 倍當半導體在 400 600 納米與興奮。最大值的一半為典型的量子點共軛的全寬度是大約 30 納米,和,譜線輪廓不偏向於更長的波長 (具有較高的強度"尾巴"),是這種情況與大多數有機熒光染料。窄排放配置文件可使幾個量子點複合物,同時觀察到與最低限度的流血,通過。

生物學上的應用,為鎘硒化物晶體的相對一致的人口都布滿周圍的半導體殼組成的硫化鋅提高光學性能。下一步的核心材料被塗有聚合物薄膜和其他配體,降低疏水性,提高共軛大分子的附件效率。最終的產品是範圍的大小從 10 到 15 納米,大約有近大蛋白生物活性粒子。量子點複合物作為共同的生物緩衝區中膠體懸浮液增溶,並可能納入現有的標簽協議代替經典染色試劑 (如有機熒光染料標記的二次抗體)。

在共聚焦顯微鏡,量子點感到激動與不同程度的效率產生的常見的激光係統,譜線的大部分包括氬離子、 氦鎘、 氬、 氪和綠色的氦-氖。特別是有效地令人興奮的量子點在紫外線和紫羅蘭色區域是新藍色二極管和二極管泵浦的固體激光器具有突出的譜線在 442 納米及以下。405 納米的藍二極管激光是經濟激勵源,是非常有效的使用與量子點由於其高的消光係數在這種波長。使用這些熒光共聚焦顯微鏡中的另一個優點是在相同的標本,以單激發波長,製作這些探頭多個標記實驗優秀候選人刺激多個量子點尺寸 (和光譜的顏色) 的能力。

量子點複合物的特殊光穩定性研究是優勢的很大在共聚焦顯微鏡時正在收集光學切片。與有機熒光團的情況下,不同的是位於遠離的焦平麵標記的結構不要在重複的光柵掃描標本的過程中遭受過度漂白,產量更準確的三維體積模型。量子點複合物在視場熒光顯微鏡,可供使用的是許多顯微鏡上的標準設備的常規優化染料的篩選器組合。代以伴隨著大多數過濾器集合,從而優化燈能量可以被利用來激發的量子點的帶通濾波器 shortpass 濾波器可以進一步加強激勵。幾個自定義熒光篩選器廠家提供專門設計用於與量子點複合物的組合。

熒光蛋白

過去的幾年中,發現和發展的自然發生熒光蛋白和突變的衍生品有迅速先進向中心舞台的活的有機體中的細胞內過程的廣泛調查。這些生物探針,為科學家提供可視化、 監視和跟蹤單個分子與高的空間和時間分辨率,在穩定狀態和動力學實驗中的能力。各種各樣的海洋生物已經 25 個以上的熒光蛋白的來源和其類似物,手臂向調查人員提供單、 雙和多光譜熒光分析的非侵入性生物探針平衡調色板。熒光蛋白在上麵描述的傳統有機和新的半導體探測器的優勢之一是他們對更廣泛的各種生物事件和信號的反應。再加上在亞細胞的車廂內,極低或缺席的鮮紅斑痣的毒性和廣泛的兼容性與組織和完整的生物熒光探針的具體物鏡的能力,這些生物大分子提供活細胞成像中令人振奮的新邊疆。

本係列的第一位被發現的綠色熒光蛋白 (GFP),從北大西洋水母,水母維多利亞,分離和發現,表現出高度的熒光沒有額外的底物或輔酶的援助。在本機的綠色熒光蛋白,熒光基團是絲氨酸、 酪氨酸和氧分子的激活,但不需要額外的輔助因子或酶的甘氨酸三肽衍生物。其後的調查發現綠色熒光蛋白基因可能在其他的生物體,包括哺乳動物,產量顯示沒有不良的生物學效應的全功能類似物表示。事實上,熒光蛋白可以被融合到幾乎任何使用重組互補 DNA 克隆技術,並由此產生在適應標準組織培養方法論的細胞係中表達的融合蛋白基因產物的活細胞中的蛋白質。沒有的細胞特異性激活輔助因子需要呈現熒光蛋白作為廣義探針比其他生物大分子,如藻膽蛋白,需要插入輔助色素成分產生熒光有用得多。

綠色熒光蛋白與誘變實驗產生了一大批的變形與改進折疊和表達特點,其中有消除野生型的二聚化的工件和微調的吸收光譜和熒光光譜的屬性。其中一個最早的變種,稱為增強型綠色熒光蛋白 (EGFP),包含密碼子換人 (通常稱為S65T突變),緩解的溫度敏感性,增加的 GFP 在哺乳動物細胞中的表達效率。長時間段的最小光漂白,與綠色熒光蛋白融合蛋白可以觀察到,在低光照強度。增強型綠色熒光蛋白融合產品都是以最佳方式興奮,氬和氪氬離子激光共聚焦顯微鏡在 488 納米光譜線。這提供了一個極好的生物探針和儀器組合檢查胞內蛋白通路和細胞器和細胞骨架結構的動態變化。

額外的突變研究發現了綠色熒光蛋白變異,橫跨整個可見光譜區,表現出各種吸收和排放特性,使研究人員開發出同時觀測兩個或更多不同熒光蛋白在一個單一的有機體中的探針組合 (見圖 10 中的譜配置文件)。早期的調查產生的藍色熒光蛋白 (BFP) 和藍綠色熒光蛋白 (CFP) 突變體從轉移吸收和發射譜線輪廓的野生型 GFP 低波長區域的簡單氨基酸替換。使用與綠色熒光蛋白的組合,這些衍生品都是有用的共振能量轉移 (煩惱) 實驗和其他依賴於多色熒光成像技術的調查。藍色熒光蛋白可以與 354 納米線從一種大功率氬激光器,有效地興奮時的更多有用的青色導數非常興奮,紫色和藍色激光線,包括 405 納米的藍二極管、 442 納米氦鎘的譜線和從標準的氬離子激光 457 納米線的數目。

GFP 晶體結構分析到紅移的吸收和發射譜的基礎上,設計了另一種流行的熒光蛋白衍生物,黃色的熒光蛋白 (YFP)。黃色熒光蛋白以最佳方式非常興奮,氬離子激光、 514-納米光譜線和提供更強烈的輻射比增強型綠色熒光蛋白,但對低 pH 和高鹵素離子濃度更敏感。增強型黃色熒光蛋白衍生物 (EYFP) 是有用的 514 氬離子激光線,但也可以激發效率相對較高的 488 納米線從氬和氪氬激光器。這些衍生產品已被廣泛應用於蛋白質-蛋白質的熒光蛋白的煩惱與 CFP,結合調查和此外,已經被證明可以涉及多蛋白質販賣人口的研究。

企圖轉移到波長在光譜的橙色和紅色區域的吸收光譜和發射光譜的水母維多利亞熒光蛋白會見了小小的成功。但是,從其他海洋物種的熒光蛋白有啟用擴展的可用光譜區域內的紅色波長範圍之內的調查人員。紅色熒光熒光蛋白和其衍生物,原本分離的海葵Discosoma 芨,是目前最受歡迎的類似物為 575 650-納米區域的熒光分析。另一種蛋白, HcRedHeteractis 皺紫色銀蓮花,也是調查更長的波長在可見光譜的有希望的候選人。新研製的活化熒光蛋白,包括光激活綠色熒光蛋白 (GFP PA)、和點燃熒光蛋白 1 (KFP1),表現出明顯的改善在綠色熒光蛋白 (達幾數萬倍) 熒光強度的刺激下紫激光照明。這些探頭應證明有用在熒光共聚焦研究中涉及的特定物鏡區域選擇性照射和擴散型流動的隨後的動力學分析和融合蛋白的分室居住時間。

淬火和光漂白

淬火和光漂白的後果是遭受了幾乎所有形式的熒光顯微鏡和結果在有效地減少廢氣排放的水平。這些工件應在設計和執行熒光調查時主要考慮。這兩種現象是不同的淬火通常是可逆的而不是光漂白。淬火產生誘導非輻射鬆弛 (沒有光子發射) 的激發的態電子對地麵狀態,這可能是分子內或在大自然中分子間的競爭進程有多種。非輻射躍遷通路與熒光鬆弛競爭,因為他們通常極大地降低,或在某些情況下,完全消除廢氣排放。最猝滅過程采取行動,減少的激發的態壽命和受影響的熒光量子產率。

淬火的一個常見示例被觀察與激發的態熒光基團與在解決方案中,從而導致失能的熒光基團和返回到地麵狀態的另一種 (非熒光) 分子的碰撞。在大多數情況下,分子的既不是化學方式改變的碰撞的淬火工藝。簡單的元素和化合物的種類繁多的行為作為碰撞猝滅劑,包括氧氣、 鹵素、 胺和許多缺電子有機分子。碰撞淬火可以揭示本地化猝滅劑分子或基團,其中通過擴散或構象改變,可能會碰撞與熒光基團在激發的態壽命期間的存在。碰撞淬火的機製包括電子轉移、 自旋-軌道耦合和係統間穿越到激發三重態的狀態。經常與碰撞猝滅交替利用其他條款都是內部的轉換和動態猝滅。

第二個類型的猝滅機理,稱為靜態複雜淬火,而產生的非熒光配合物熒光的猝滅劑之間形成,有助於限製通過減少人口的活躍,易激動的分子吸收。這種效果熒光物種形成一個可逆的複雜的猝滅劑分子在地麵狀態下,並不依賴於擴散或分子碰撞時發生。在靜態猝滅,而不會改變的激發的態壽命減少熒光發射。熒光體在興奮狀態也可以通過在接近的接近度與受體分子的激發的態能量可以被轉移往的非輻射時的偶極共振能量轉移機理淬火。在某些情況下,淬火可以通過非分子機製,如對入射光的吸收的物種 (包括發色團本身) 的衰減。

與淬火、漂白(也被稱為衰落) 熒光永久失去的能力由於光子誘導化學損傷和共價修飾的熒光時發生。後從激發的單線態過渡到激發三線態,熒光團可能會與另一種分子產生不可逆的共價修飾進行交互。三重態是單線態狀態,從而使激發的分子更長的時間,讓與環境中的組件發生化學反應相對較長的壽命。激發和發射周期發生的特定的熒光光漂白前的平均次數是取決於分子的結構和當地的環境。一些熒光快速漂白後發射僅有幾個光子,更健壯的其他可以進行數千或甚至數以百萬計的周期漂白前的同時。

圖 11 中是漂白 (漸弱) 觀察到一係列的數字圖像捕獲不同時間點乘以沾文化印度麂鹿皮成纖維細胞中的一個典型例子。在原子核上沾滿 DAPI (藍色熒光),而線粒體和肌動蛋白細胞骨架上沾滿 MitoTracker 紅色 (紅色熒光) 和 Alexa 氟鬼筆導數 (Alexa 氟 488 ; 綠色熒光),分別。在兩分鍾的時間間隔使用熒光篩選器相結合,利用帶寬調整,以激發三個熒光團同時也錄製聯合的發射信號的同時采取了時間點。請注意所有三個熒光強度相對較高在圖 11 (a),但 DAPI (藍色) 強度開始下降迅速在兩分鍾內和在六分鍾幾乎完全消失。線粒體和肌動蛋白的汙點是更耐光漂白,但強度的兩滴定時序列 (10 分鍾),當然。

一類重要的光漂白事件是鮮紅斑痣,意思它們涉及的熒光光與氧的結合與互動。熒光團和氧氣分子之間的反應永久破壞熒光和產量化學可以修改其他分子在活細胞中的自由基單線態氧。由於事件的鮮紅斑痣光漂白的量是分子氧濃度和熒光基團,氧分子和其它細胞組分之間的近端距離的函數。通過限製到照明熒光團的暴露時間或降低的激發能量,可以減少光漂白。然而,這些技術也減少可衡量的熒光信號。在許多情況下,熒光團或細胞懸浮液的解決方案可以去氧,但這是不可行的活體細胞和組織。也許對抗光漂白的最好保護是限製接觸的熒光素強光照條件下 (使用中性密度濾鏡) 加上商業上可用的 antifade 試劑,可以添加到安裝的解決方案或細胞培養基中明智地使用。

在某些情況下,光漂白效果也可以用於獲取特定信息,否則不可能獲得。例如,在熒光恢複後漂白 (FRAP) 實驗中,在目標區域內的熒光團故意是與過量的照射漂白。作為新的熒光分子擴散到漂白區域的標本 (恢複),熒光發射強度被監測以確定目標熒光基團的側向擴散率。以這種方式,可以確定平移的熒光標記分子流動性內非常小 (2 到 5 微米) 區域的單個單元格或一條活的組織。

結論

雖然都是有利的共聚焦顯微鏡的熒光團的子集發展迅速,已多年在視場應用中有用的傳統探頭的很多人仍然是小實用程序時由固定波長的激光譜線的約束。許多人圍在紫外區激發的熒光團使用的限製將被淘汰與先進目標旨在減少像差耦合到逐步推行低成本、 高功率二極管激光係統的譜線在這些更短波長的介紹。405 納米的藍二極管激光是更昂貴的離子和基於惰性氣體的紫外激光器,一個相當便宜的替代和正在迅速成為最共聚焦顯微鏡係統可用。氦-氖激光的光譜線在黃色和橙色區域已呈現一些熒光團有用了以前隻限於視場的應用程序。此外,正在采用新的二極管泵浦固體激光器發射波長的紫外線、 紫羅蘭色,和藍色區域。

繼續取得進展熒光設計、 雙激光掃描、 多光譜成像和旋轉磁盤應用程序也將在未來幾年中重要。排放交叉譜重疊,與許多合成的探針和熒光蛋白在多色調查,效益顯著從譜分析法和反褶積的 lambda 堆棧中發生的現象持續存在的問題。相結合,這些進展,將會大大提高收集和分析從活細胞成像中的複雜熒光實驗獲得的數據。



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