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新聞資訊

奧林巴斯顯微鏡熒光蛋白的顏色調色板

2014-07-09  發布者:admin 

 已在過去幾年,特征熒光發射譜線,跨越幾乎整個可見光譜範圍廣泛的熒光蛋白基因變異。在原始的水母蛋白廣泛誘變努力造成新的熒光探針,顏色從藍色到黃色範圍和是最廣泛使用的體內的一些記者的分子生物學研究。長波長的熒光蛋白,發光的橙色和紅色的光譜區域,已從海洋海葵Discosoma 芨和礁珊瑚屬於珊瑚蟲綱。仍已開采其他物種產生類似蛋白質有青色、 綠色、 黃色、 橙色、 紅色和遠紅光的熒光發射。正在進行開發研究努力提高亮度和穩定性的熒光蛋白,從而提高他們的整體效用。

基本在範圍廣泛的迄今為止發現的熒光蛋白質譜差異的理解是熒光的結構性調查的立體化學性質和熒光性能及其周圍環境的影響。除了水母蛋白質,似乎紅移的熒光蛋白的熒光分子變異程度高。甚至通過紅色熒光熒光配置,稱為的平麵獨聯體,似乎是在發出橙色和紅色區域的大多數蛋白質的主要結構,有至少兩個額外的圖案、平麵反式非平麵反式,這被闡明通過 x 射線衍射研究。平麵反式母題在紅色熒光蛋白 eqFP611,Entacmaea quadricolor,其中顯示了一個最大的斯托克斯從分離轉移和紅移的發射波長配置文件任何自然發生的珊瑚蟲熒光蛋白的發現。相比之下,非平麵反式構象是種從Montipora efflorescens Rtms5非熒光色素蛋白的特性。新的 mFruit 蛋白,如下文所述的幾個特征明顯偏離嚴格平麵幾何的不尋常的生色團體係結構。

近幾年的基本起源和操縱的熒光蛋白發光顏色出現了大量的指導的圖案。最重要的考慮似乎是的 p 軌道共軛內發色團,它很大程度上決定了一般譜類 (如青色、 綠色、 黃色或紅色) 所載的物理範圍。此外,當地的環境變量,如帶電的氨基酸殘基、 氫接合網絡和疏水相互作用蛋白基質內的位置有能力生產藍色或紅色光譜位移在吸收和發射極大值的多達 20 毫微米。作為進一步研究複雜特性的熒光蛋白生色團出產量與多肽骨架的結構-功能關係有關的線索,基因工程更微妙的顏色變形和擴大的有用的蛋白質光譜範圍的任務將無疑成為更容易。

圖 1 所示是各種熒光蛋白融合標簽特定亞艙室的本地化。增強型藍色熒光蛋白 (接骨) 嵌合體和靶向序列從亞基八人細胞色素 c 氧化酶組蛋白的定位於線粒體 (圖 1(a)) 體外培養的人體細胞,同時類似融合了 mCerulean (藍綠色的熒光蛋白) 和人類β-肌動蛋白突出了絲狀肌動蛋白細胞骨架網絡 (圖 1(b)) 在非洲綠猴成纖維細胞中。經典和最常用的熒光標簽,增強型綠色熒光蛋白 (EGFP) 構成一個類似的細胞骨架網絡時與alpha配對-微管蛋白 (圖 1(c)) 和黃色變種 (EYFP) 可以融合在 N-末端 81 氨基酸的人類β-1,4-轉移進行本地化了黃色綠色熒光標記到高爾基 (圖執行。粘著斑成為熒光與望月的 mKusabira 橙色熒光蛋白 (人民聖戰者組織圖 1(e)) 和紐蛋白在狐狸肺成纖維細胞與單體紅色熒光蛋白 mCherry 凸顯的核和濃縮的染色體融合到組蛋白 H2B (圖 1(f)) 在人宮頸癌細胞。

藍色熒光蛋白

 

熒光蛋白發光的可見光的光譜 (大約 440 到 470 納米) 的藍色區域第一次得到的定點突變努力針對酪氨酸氨基酸殘基中 GFP 生色團 66 位置 (見圖 2)。這個殘留到組氨酸 (Y66H) 轉換產生藍色熒光蛋白的 (BFP),展品廣泛吸收波段在中心 380 納米和排放量最高,在 448 納米的紫外線。原蛋白表現出隻有大約 15 到 20%的父 GFP 亮度值低的量子產率和所需額外的二次突變增加其折疊的效率和表達水平。隨後進行的調查和幾個額外的突變導致了一個增強的 BFP 版本,是增強綠色變種一樣明亮,仍隻有 25%,並將許多其他熒光蛋白顯示有限的光穩定性比較。

在 1990 年代中期到後期發展藍色熒光蛋白的主要動機是創建配對熒光共振能量轉移 (煩惱) 實驗和多色標簽都甚感興趣。因為 BFP 的光譜特性 (熒光發射配置文件) 是很容易區分綠色熒光蛋白,這種蛋白質組合是第一次用於多色成像之一。藍色熒光蛋白也有的被納入第一基因編碼傳感器和增強綠色熒光蛋白變體,通過聯動兩種熒光蛋白質通過幹預蛋白酶敏感的間隔的演示 FRET 的區別。BFP 廣泛排放峰值的重疊與激發光譜的紅移的綠色熒光蛋白變異產量 4.1,一個合理的值,測量 FRET 斯特距離很大程度上。藍色熒光蛋白也伴隨著幾種綠色熒光蛋白衍生物入旨在監視轉錄因子的二聚化,鈣和細胞凋亡的生物傳感器。

除了有限的亮度水平和快速漂白,藍色熒光蛋白也患有的事實他們一定會興奮與紫外線的照射,是光毒性對哺乳動物細胞中,即使在有限的劑量。此外,在這個光譜區域工作經常受到自體熒光和細胞和組織,以及光散射的高吸收水平。顯微鏡經營在紫外線也需要專門的光源、 光學和更複雜的成像的篩選器組合。所有上麵列出的原因,尋求更有效的藍色熒光蛋白的隻有所追尋的幾個研究組。調查使用定位和周圍發色團的非天然氨基酸的突變導致了幾個藍移"人造的"熒光蛋白變異,可能會發現在幾個生物和光物理應用程序的實用程序。

圖 2 中所示是對於顏色的變體綠色熒光蛋白的生色團結構。在所有情況下,成熟的發色團的第一步是一係列的搬遷位置 65 氨基酸的羧基碳,使它是在接近的接近度對氨基氮的甘氨酸殘留在位置 67 (Gly67) 的多肽骨幹的扭轉調整。酰胺態氮的甘氨酸,其次是脫水的這個碳原子的親核進攻結果唑啉-5-酮雜環體係的形成。芳香族氨基酸 (位置 66) 碳鍵分子氧氧化延伸的咪唑啉環係統,包括芳香取代基的電子共軛時發生熒光。在以下各節中更詳細地討論了青色、 綠色和黃色的熒光蛋白變異生色團。

藍綠色熒光蛋白

第一次發射在藍綠色青色譜區 (CFP; 從大約 470 至 500 毫微米) 聯合王國熒光蛋白時發現了同時與 BFP 轉換酪氨酸殘留在 GFP 生色團為色氨酸 (Y66W) 的誘變研究。這種單一的突變產生了一個發色團,具有非常廣泛的熒光發射的譜線,輪廓中心在 485 納米在 436 納米顯示吸收最大值。後續的改進,包括F64L成熟改進和S65T (綠色熒光蛋白節中討論),導致更大的亮度和光穩定性生產的增強版本 (; 見圖 2)。然而,即使這些修改未能增加後超出 40%的綠色熒光蛋白所顯示的亮度水平。多色成像提供額外的色相後的最有前途方麵最初是作為生物傳感器 FRET 的夥伴的黃色熒光蛋白質,視場和使用藍色紫羅蘭色過濾器集合或 457 納米光譜線的氬離子激光共聚焦顯微鏡實用的潛力。更大的光穩定性相比接骨也定位後作為更多有用的蛋白質的延時成像在本地化和動力學的研究。

到目前為止最為成功的應用使用後已利用了這種變體被加上黃色熒光蛋白 (YFP) 和衍生工具來生成 FRET 傳感器能夠監測廣泛的細胞內的過程 (見圖 3) 的能力。雖然使用後 EYFP 對進行了 FRET 調查的主機,但實驗結果亦經常有問題由於限製到一個小的動態範圍測量熒光性能的限製。在大多數的這些生物傳感器在 FRET 分析中,除了少數例外陳列 10 到 30%的典型總體比例的變化。這種較低的對比度與現代數碼顯微鏡可以接近 10%的低成像強度信號的噪聲水平的困難。這些生物傳感器進一步變得複雜時具有如在膜中存在的那些緊二維空間限製的約束,形成二聚體的潛力。為了克服與二聚體相關聯的工件,疏水性殘留在二聚體界麵替換為正電氨基酸在後和 EYFP 產生真正單體的變種 (mCFP 和 mYFP),而達到更高水平的 FRET 實驗效率。臨界突變是性能的賴氨酸對丙氨酸在位置 206 (A206K),可以適用於幾乎任何水母維多利亞變為了生成真實的單體能力的優越在應用程序中定位,別發愁和蛋白質動力學等取代。

盡管在 CFP 的改進主機和實驗用這種變體的大型數據庫,繼續的調查產生了額外有用的熒光蛋白質中的青色的光譜類。之間的改進青色熒光蛋白質最近被介紹了,CyPet 和增強的青色變體稱為蔚藍顯示最有發展前景作為融合標簽,FRET 傳感器和多色成像 (見圖 1、 3 和 11)。蔚藍的熒光探針 (天藍色的顏色命名) 是合理地設計通過定點突變增強型藍綠色熒光蛋白,產量較高的消光係數、 改進的量子產率和具有單個指數組件 (在生存期衰減測量的煩惱中有用) 熒光壽命衰減。蔚藍是至少 2 倍亮度比增強型藍綠色熒光蛋白,已經被證實可以顯著提高對比度,以及信號對噪聲比黃色發光的熒光蛋白質,例如金星(下麵討論),再加上在 FRET 調查中。除了旨在提高折疊和亮度的定點突變,對預蔚藍的變種進一步增加的摩爾消光係數,進行了隨機突變和優化的蛋白質已被"monomerized"來提高其效用的融合。豐富的天藍色所提供的優勢特征呈現這種蛋白質的最有用的萬能青色導數。

藍綠色熒光蛋白變體被稱為CyPet (的首字母縮寫: Cy熒光P水相的電子能量轉運) 推導了通過定量的和獨特的戰略,利用熒光激活細胞分選加強的青色和黃色搭配的煩惱。請注意,在設計中探針的 FRET 調查,捐助量子產率和承兌人的消光係數,以及的重疊積分這些變量之間的優化是實現提高的效率的最重要參數之一。圖書館的 CFP 和 YFP 的變種被篩選 FRET 效率,為最佳的無性係受到幾個進化周期隨機突變和合成 DNA 改組技術組成。共有 7 個突變導致在生產中的 CyPet 蛋白,特征吸收和發射極大值將出現在定位 435 和 477 納米,分別。CyPet 是關於明亮如 EGFP 和三分之二一樣明亮蔚藍,但表示在攝氏 37 度相對較差的一半。然而,當其流式細胞儀優化合作夥伴,YPet,在 FRET 生物傳感器,搭配這個青色變形陳列是 CFP YFP,顯著提高了對比度,並有可能導致更為敏感檢測細胞內過程、 微妙的六倍以上的動態範圍。CyPet 具有比 mCFP,大大增加了多色成像,其效用,是當前可用的弱二聚體和單體版本的大多數基質青色熒光蛋白質更藍移和較窄的熒光發射峰。

幾種可能有用青色蛋白質被隔離在珊瑚蟲的物種。來自礁珊瑚Anemonia majano, AmCyan1熒光蛋白,現在是商業上可用的 (減),進行了優化與人類密碼子的表達增強哺乳動物細胞係統中。最初命名的amFP486(, Anemonia majanoFP、 熒光蛋白 ;486排放最大) 設計以簡化討論無數珊瑚蟲蛋白質命名計劃,根據這個變形陳列類似的亮度水平,但明顯更好的耐光漂白到比 CFP。AmCyan1 的吸收最大熒光發射峰位於 489 納米時發生在 458 納米。請注意這兩個峰向長波長由轉移 19 和 13 個納米,分別,相對於後。缺點是,類似於大部分的其他礁珊瑚蛋白質,該探頭具有形式四聚體,這會變得更加複雜的企圖雇用這種蛋白作為一個融合標簽或共振生物傳感器的傾向。

首次分離脅和從Acropara石珊瑚物種的同夥,青色發光Midori 伊青色(縮寫為MiCy) 探針最初被設計為單體 Kusabira 橙色 (人民聖戰者組織) 熒光蛋白新 FRET 結合捐助來生成具有高光譜重疊的生物傳感器探頭 (斯特距離的 5.3 ; 見圖 4 ; 人民聖戰者組織在橙熒光蛋白上節中討論)。這種蛋白質功能的最長的吸收和發射波長配置文件 (472 和 495 納米,分別) 任何探測器中的青色的光譜類報道。高摩爾消光係數、 量子產率展出由 MiCy 呈現天藍色,同等亮度的蛋白質譜雖遠更敏感的 ph 值。也類似於蔚藍,MiCy 功能單一指數一生衰變 3.4 納秒,時間常數元件,應該有用 FRET 相結合測量與熒光壽命成像顯微鏡電影)。MiCy 的一個不尋常的特點是它形成了複雜的類似於分離的生物發光海堇的綠色熒光蛋白變體,雷尼利亞胡蘿卜,而不是強製的四聚體中觀察到大多數珊瑚礁物種同源。雖然二聚化主題可能是一些融合蛋白的一個問題,它應該比 MiCy 變成真正的單體的四聚體容易得多。

最近,一個新單體青色熒光蛋白具有優越的亮度,對酸性條件下和光穩定性不敏感推出了為活細胞成像應用的融合夥伴,和作為 FRET 捐助者為黃色和橙色的受體熒光蛋白在生物傳感器中。被稱為mTFP1 (單體藍綠色熒光蛋白 1),備選案文生產從圍繞 tetrameric 青色蛋白, cFP484,源自Clavularia軟珊瑚合成基因庫。顯示紅移譜線輪廓 (激發和發射性能極大值在 462 和 492 納米,分別) 時與其他青色此類成員的光譜相比,mTFP1 有 31 氨基酸替換與野生型四聚體的共。紅移光譜被認為當分類的新顏色為藍綠色,而不是青色。不同於其他成員的青色熒光蛋白組的一般功能位置 66 中發色團的芳香族氨基酸色氨酸,mTFP1 包含古典酪氨酸殘留在這個位置,許多 GFP 衍生品的特點。代以色氨酸酪氨酸減少廣泛的熒光發射譜線寬度從約 60 納米窄並更易於管理的 30 納米,是有用的減少的一個因素流血,通過在多色彩的實驗。MTFP1 高量子產率 (0.85) 作為擁有超過 5.0 時黃色或橙色的熒光蛋白結合斯特距離 FRET 捐助者提供青色衍生物、 mCFP 和 mCerulean,很好的替代。

圖 4 中所示是的吸收和發射譜線,以及 MiCy 和人民聖戰者組織和推薦帶通濾波器的勵磁和 FRET 分析使用兩個探針的熒光發射的聚會。MiCy 發射譜和吸收譜的人民聖戰者組織之間的重疊區域提出了一種帶有灰色填充,同時激發和發射譜流血,通過區域顯示為紅色和藍色填充,分別。應用激勵帶通濾波器以 440 納米 21 納米帶寬為中心的水平降低的人民聖戰者組織,激發和 495 20 納米排放過濾器可以分析的無汙染的信號向承兌人 (人民聖戰者組織) 捐助排放 (MiCy) 熒光。565 20 納米承兌人帶通濾波器包含的最高排放地區的人民聖戰者組織大約 7-10%流血,通過 MiCy 信號。有切對波長為 485 納米 (不說明) 二向色鏡應利用與此篩選器組合。

綠色熒光蛋白

原始的綠色熒光蛋白分離的水母維多利亞(被稱為野生型) 一直是眾多調查的主體,但不是在大多數涉及熒光蛋白質,由於雙峰吸收帶 (395 和 475 納米的山峰),阻礙了相對較低的消光係數和居住在光譜的紫外線部分主要吸收最大值的實際應用中有用。不久 GFP 被證明是有效的標記基因表達後,改變絲氨酸殘基中發色團成蘇氨酸 (S65T) 位置 65 點突變產生的蛋白質具有定義良好的吸水剖麵呈單峰在 484 納米的新版本。這種突變被推薦的最受歡迎的變異型綠色熒光蛋白,稱為增強型綠色熒光蛋白 (EGFP),可以將通常可用的篩選器集設計用於熒光素 (FITC) 成像,是最聰明和最基質的水母維多利亞熒光蛋白質。這些功能提供了增強型綠色熒光蛋白的最受歡迎的探針和最好的選擇之一為大多數單標簽活細胞熒光成像實驗。正如以前討論 EGFP 的藍色熒光蛋白質作為 FRET 受體在早期生物傳感器調查中,再加上,但其後被黃色、 橙色和紅色的變異很大程度上取代。利用綠色熒光蛋白作為一個融合標簽到唯一的缺點是對 ph 值和催化的弱趨勢略有敏感性。

EGFP,除了活細胞成像實驗中目前所利用的幾種其他綠色發光二極管變異 (大約 500 到 525 納米的範圍)。其中最好的這些的光穩定性和亮度可能是翡翠變種,但商業源 (直到最近) 的缺乏限製了它的使用。翡翠包含在綠色熒光蛋白,推薦的S65T突變,但也有提高折疊,表達在 37 攝氏度左右和亮度的四個額外的點突變。雖然翡翠是遠比 EGFP 在折疊和發展在哺乳動物細胞中的熒光更為有效,它有可能會影響定量成像在某些環境中的快速光漂白組件。WtGFP 最有趣衍生物之一是藍寶石,其中包含一個臨界突變的異亮氨酸蘇氨酸市場位置 203 (T203I),廢除在 475 納米的吸收峰。其結果是一種蛋白質吸收最大值在 399 納米與排放在綠色光譜區域 (511 納米),產量大得驚人的斯托克斯位移超過 100 納米。幾個藍寶石變種已提高折疊,包括T 藍寶石(用於渦輪增壓),設有圓形排列的衍生產品,並可被稱為一個探測器,對於改變方向幾何與融合夥伴可能很有用。吸收和發射峰之間重大分裂,藍寶石蛋白質的最大潛力是其配對與橙色和紅色衍生品 (見圖 8) 作為 FRET 捐助者。

種類繁多的額外熒光蛋白質發光的綠色光譜區域已從其他來源,包括不同的水母物種、 橈足類及珊瑚礁分離。最有前途的這些探頭,導出了隨機突變的分離從水母 coerulescens,無色蛋白之一被稱為aceGFP穀氨酸轉化為甘氨酸在 222 (E222G) 的位置與光譜剖麵,剖麵有吸收最大值在 480 納米和發射峰在 505 納米一相對對稱雙轉化為高度熒光的物種野生型 aceGFP 蛋白。AceGFP 高的摩爾消光係數、 量子產率相結合,產生類似於由 EGFP 顯示的亮度水平。作為一種單體在水溶液中存在的表明電泳和凝膠過濾,這種蛋白質是商業上可用從幾個來源 (減和 Evrogen, AcGFP1AceGFP,分別) 人力資源優化密碼子的替代。正確定位的融合產品針對特定的亞細胞組分和細胞器 (如絲狀肌動蛋白、 高爾基體、 細胞核和線粒體 ; 見圖 1) 指示那 aceGFP 是作為標記很有用,可以 FRET 組合新穎有紅色發光蛋白與夥伴關係的潛力。然而,aceGFP 的光穩定性特點仍然是未知的並且有使用這種蛋白質超過更常見的綠色熒光蛋白和翡翠變種沒有明顯優勢。

熒光蛋白屬性
蛋白質
(縮寫)
勵磁
最大值
(nm)
排放
最大值
(nm)
摩爾
滅絕
係數
量子
產量
在體內
結構
相對
亮度
(EGFP 的 %)
GFP (wt) 395/475 509 21,000 0.77 單體 * 48
藍色熒光蛋白
EBFP 383 445 29,000 0.31 單體 * 27
Sapphire 399 511 29,000 0.64 單體 * 55
TT-Sapphire 399 511 44,000 0.60 單體 * 79
藍綠色熒光蛋白
ECFP 439 476 32,500 0.40 單體 * 39
mCFP 433 475 32,500 0.40 單體 39
Cerulean 433 475 43,000 0.62 單體 * 79
CyPet 435 477 35,000 0.51 單體 * 53
AmCyan1 458 489 44,000 0.24 四聚體 31
Midori-Ishi Cyan 472 495 27,300 0.90 二聚體 73
mTFP1 (Teal 462 492 64,000 0.85 單體 162
綠色熒光蛋白
EGFP 484 507 56,000 0.60 單體 * 100
AcGFP 480 505 50,000 0.55 單體 * 82
TurboGFP 482 502 70,000 0.53 單體 * 110
Emerald 487 509 57,500 0.68 單體 * 116
Azami Green 492 505 55,000 0.74 單體 121
ZsGreen 493 505 43,000 0.91 四聚體 117
黃色熒光蛋白
EYFP 514 527 83,400 0.61 單體 * 151
Topaz 514 527 94,500 0.60 單體 * 169
Venus 515 528 92,200 0.57 單體 * 156
mCitrine 516 529 77,000 0.76 單體 174
YPet 517 530 104,000 0.77 單體 * 238
PhiYFP 525 537 124,000 0.39 單體 * 144
ZsYellow1 529 539 20,200 0.42 四聚體 25
mBanana 540 553 6,000 0.70 單體 13
橙色和紅色熒光蛋白
Kusabira Orange 548 559 51,600 0.60 單體 92
mOrange 548 562 71,000 0.69 單體 146
dTomato 554 581 69,000 0.69 二聚體 142
tdTomato (Tandem 554 581 138,000 0.69 單體 283
DsRed 558 583 75,000 0.79 四聚體 176
DsRed2 563 582 43,800 0.55 四聚體 72
DsRed-Express (T1) 555 584 38,000 0.51 四聚體 58
DsRed-Monomer 556 586 35,000 0.10 單體 10
mTangerine 568 585 38,000 0.30 單體 34
mStrawberry 574 596 90,000 0.29 單體 78
AsRed2 576 592 56,200 0.05 四聚體 8
mRFP1 584 607 50,000 0.25 單體 37
JRed 584 610 44,000 0.20 二聚體 26
mCherry 587 610 72,000 0.22 單體 47
HcRed1 588 618 20,000 0.015 二聚體 1
mRaspberry 598 625 86,000 0.15 單體 38
HcRed-Tandem 590 637 160,000 0.04 單體 19
mPlum 590 649 41,000 0.10 單體 12
AQ143 595 655 90,000 0.04 四聚體 11
* 弱二聚體
表 1

在表 1 中給出了是由幾個最受歡迎和最有用的熒光蛋白變體顯示的屬性編輯。與常見的名稱和/或每個熒光蛋白的首字母縮寫,一起列出了峰值吸收和發射波長 (給出納米)、 摩爾消光係數、 量子產率、 相對亮度和體內結構協會。計算的亮度值從的摩爾消光係數、 量子產率,產品出來,除以 EGFP 百分率來計算的表中記錄的值。這個清單從科學和商業文獻資源創建的並不是要全麵,但相反表示熒光蛋白衍生物,在文獻中受到相當重視,可能證明是有價值的研究工作。此外,吸收和熒光發射譜表中列出並說明了在這次審查錄在受控條件下和歸一化的比較和顯示唯一的目的。在實際的熒光顯微鏡調查中,譜線輪廓和波長極大值,可能會受環境的影響,如 ph 值、 離子濃度和溶劑的極性以及本地化的探針濃度的波動發生變化。因此,上市公司的消光係數、 量子產率可能不同於實際觀察到的實驗條件下的。

幾個密切相關的綠色熒光蛋白樣蛋白已分離出各式各樣的橈足類水生甲殼類動物物種。最明亮的這些探頭,最初被稱為ppluGFP2,取得了商業上可用的 (Evrogen) 下CopGFPTurboGFP (增強變量) 的名稱。CopGFP 有效地激發使用氬離子激光或 FITC 藍色勵磁篩選器設置 (吸收最大值在 482 納米) 和產生綠色熒光在同一個亮度值 502 納米大約 30%高於 EGFP 和更大的阻力,對 ph 值的變化。據報單體在稀溶液中,CopGFP 比 EGFP 快得多的成熟,是理想的應用程序作為融合夥伴針對高酸度在亞細胞區域中的表達。這種探頭的局限性包括無法分離出穩定的細胞係和集料在長期的文化的形成。改進的版本,TurboGFP,來自定點和隨機突變,在亮度和極大地降低電阻與酸性環境保留父蛋白與損失輕微的快速成熟動力學。盡管改進折疊動力學和優異的光學性能,這些蛋白的然而,光穩定性數據未見報道,沒有令人信服的證據存在,表明廣泛地研究了原始綠色熒光蛋白衍生物的應用相比,一個顯著的好處。

綠色熒光蛋白也已開采從礁珊瑚和這些有幾個是商業上可用。明亮熒光蛋白稱為考醫學院綠色,軸承隻驚奇地很少 (小於 6%) 序列的同源性為綠色熒光蛋白,是從石珊瑚Galaxeidae分離和已經被證實可以迅速成熟期間在哺乳動物細胞中的表達。同樣,從Zoanthus的原始珊瑚蟲珊瑚礁蛋白質之一由 Matz 報告和工友也變成一種商業產品 (減) 下的ZsGreen探針在 492 和 496 納米吸收最大值和發射峰在 505、 506 納米,分別有,欣然允許可視化和標準激光與篩選器組合在共焦成像和視場顯微鏡。然而,類似於大部分的其他蛋白質分離在珊瑚、 考醫學院綠色和 ZsGreen 兩者都作為四聚體中的自然狀態,明顯會幹擾他們的使用作為融合夥伴和 FRET 捐助或承兌人在生物傳感器中的存在。克服隨機突變與齊聚反應問題,定點努力是成功的在創造一個單體版本的綠色的但這種類型的努力不被舉報 ZsGreen 雖然蛋白質已經重新設計與人類密碼子優化表達式 (導致一個稱為ZsGreen1的變種)。因為缺乏可靠的光穩定性數據,尚不清楚是否要麽這些蛋白質在長期成像實驗中表現將綠色熒光蛋白。

海三色堇,珊瑚蟲的軟珊瑚,是幾個綠色熒光蛋白的特點是,在細節和市麵上現在的來源。海腎胡蘿卜,展品屬性類似於綠色熒光蛋白分離蛋白是最好的特點在此類中的探頭。具有吸收和發射極大值在 485 和 508 納米,分別,除了一種類似對 ph 值、 敏感的海腎蛋白將 EGFP 的理想替代如果不是它是專性的二聚體的事實。除了齊聚反應的問題,海腎兩性可能有用在許多應用中,已經表示出種類繁多的生物,包括細菌、 真菌和哺乳動物細胞。版本與人類密碼子序列是可用來自廠家,是金融衍生品的在其他物種中的表達進行了優化。那裏是普遍缺乏可靠的數據關於消光係數、 量子產率和商業的雷尼利亞蛋白質,光穩定性,所以有效的比較對 EGFP 的亮度和光漂白是不可能。

綠色熒光蛋白和其衍生品的最有用和最流行的活細胞成像應用之一正在後漂白 (FRAP) 設計實驗,以研究細胞內動力學熒光恢複中的一個標記。圖 5 (a) 所示是用綠色熒光蛋白標記的上皮細胞融合到內質網針對本地化到此細胞器網絡熒光探針的序列。感興趣區域的 (紅框) 追溯與聲光可調諧濾光器 (AOTF) 在激光掃描共聚焦顯微鏡,和該地區然後是與高激光功率 photobleached 5 秒鍾 (圖 5(b)),有效淬火所有的熒光。繼續監測的單元格與成像激光 (488 納米氬離子) 在低強度多長的時間段 (幾分鍾到一個小時) 使可視化熒光恢複在 photobleached 地區 (數字披露和 5(d))。情節的熒光強度與時間 (圖 5) 啟用恢複動力學的定量化分析,並提供有關信息的擴散係數和調動這熒光蛋白嵌合體。

黃色熒光蛋白

黃色的熒光蛋白,作為一個光譜的階級,是中最多才多藝的基因編碼探測器尚未開發。測距中發射波長極大值從大約 525 到 555 納米,這些蛋白質實際上居住在短波長區域顯示為綠色,而不是黃色的當在視場熒光顯微鏡中查看。什麽已成為探針相當大家族中的第一個成員是綠色的合理工程後的高分辨率晶體結構熒光蛋白揭示的蘇氨酸殘留物 203 (Thr203) 綠色的位置附近發色團和潛在的能夠改變在替換時的光譜特性。為了誘使 π 軌道疊加和試圖穩定的激發的態偶極矩的發色團介紹了,幾個芳香酯基這脂肪族氨基酸的突變。最成功的突變體被證明是酪氨酸 (T203Y; 稱為突變體10 C、 原始 YFP),導致幾乎 20 納米轉向向長波長的激發和發射光譜。在試圖使亮度以及增加的成熟速度和優化表達式在攝氏 37 度最大化最初建造了幾個 YFP 變形。這些變種,命名為黃玉,之一已服務的融合標簽本地化、 胞內信號轉導,和 FRET 調查。

在努力提高 FRET 生物傳感器的性能,進一步的序列改進導致增強型黃色熒光蛋白 (EYFP),這是一種最明亮和最廣泛利用熒光蛋白的發展。EYFP 到位置 69 代替穀氨酰胺 (Q69K) 從原始的黃色變形構造由賴氨酸的介紹。高亮度水平和熒光發射光譜波長配置文件的 EYFP 結合起來,使這探針熒光顯微鏡、 多色成像實驗的優秀候選雖然成熟較慢,尤其是在細胞器。增強的黃色熒光蛋白也廣泛采用作為能量轉移實驗時搭配增強型藍綠色熒光蛋白受體。然而,所有的原始的黃色熒光蛋白變異存在的一些問題,他們是非常敏感的酸性 pH,失去了大約 50%的 ph 值為 6.5 的熒光。此外,大部分的水母-也已證明在此類中的派生的蛋白質有重大敏感性到氯離子,經過弱的二聚化,比很多的綠色的熒光蛋白質更容易表現出相對較差的表達式,在攝氏 37 度,和 photobleach。幾個調查措施胞漿 ph 值、 氯離子濃度和 FRET 效率已經利用 YFP 的環境敏感性。A206K突變,代以帶電的氨基酸賴氨酸對丙氨酸疏水性二聚體界麵,已應用於 YFP 以生成真實的單體。

YFP 家庭繼續遺傳發展導致發現附近發色團,替代的甲硫氨酸穀氨酰胺在位置 69 (Q69M),一個單一的點突變急劇增加蛋白的酸穩定性並減少氯的敏感性。茶晶點名表揚的黃顏色和耐酸性,這種變體還表示在哺乳動物細胞培養 (特別是當有針對性的對酸性細胞器) 更高的水平,並演示了幾乎兩倍的光穩定性研究許多以前黃色熒光蛋白質。茶晶分別,特點在 516 和 529 納米,最大吸收光譜和熒光光譜發射值,雖然基質不是很亮綠色熒光蛋白,比 75%。FRET 傳感器用茶晶構造表現出更好的性能比姐姐類似物含有 EYFP 和探針一般是多色實驗更好的選擇。雖然茶晶存在作為一個弱的二聚體在溶液中,這種蛋白質可以轉化單體與 A206K 基因突變。

另一種新型的點突變引入水母-派生的 YFP,替代的亮氨酸苯丙氨酸在位置 46 (F46L),產生一個 variant 類型,被評為金星在夜空中最亮的星 (或星球) 的榮譽。這種突變,循環排列的綠色熒光蛋白衍生物的隨機突變實驗中發現了,大大加速了氧化的發色團,熒光蛋白成熟的速率限製步。額外的基因突變,還介紹了增加的酸性環境對金星的耐受性,減少對氯的敏感性。吸收和發射譜峰 (515 和 528 納米,分別) 的金星是轉移的時間更長波長相比 EYFP,單個納米,但保留的亮度水平。不幸的是,金星的光穩定性研究隻是大約 25%的 EYFP,長期成像的一個重大問題實驗。金星已經被證實可以執行以及在細胞內細胞器融合蛋白 ph 值測定方法,定位研究酵母、 在雙分子熒光互補分析中,和著巨大的潛力作為承兌人在 FRET 的生物傳感器。弱二聚金星遺傳轉化為一種單體使用 A206K 突變將進一步擴大此探針在生物調查中的使用。

在同一熒光激活細胞分選帶領到藍綠色熒光蛋白 CyPet 的代的調查,期間進化優化互補 FRET 承兌人,被稱為YPet,也被從金星和 YFP 的變種。YPet 的名字命名其精通 FRET (YFP電子能量轉運),是最亮黃色的熒光蛋白變體尚未開發和演示很好的光穩定性。YPet 所提供的酸性環境抗性優於金星和其他 YFP 衍生品,將提高此探針在生物傳感器組合針對酸性細胞器中的效用。然而,雖然優化的 CyPet YPet 組合應該是發展的新的共振生物傳感器中的首選的起始點,這對該實用程序已不尚未被廣泛在實踐中檢驗。同樣,CyPet 和 YPet 在融合標簽的定位實驗、 雙分子互補分析和其他常規熒光蛋白檢測方法的適用性尚未建立。這兩種蛋白質作為弱二聚體,在溶液中存在,但大概是可以轉換為真正的單體使用曾這麽好與水母的其他變種 A206K 突變。

綠色和黃色的熒光蛋白被轉基因創建啟用融合到氨基酸遠遠脫離正常氨基和羧基總站 (縮寫為的cpGFPcpYFP) 的原始序列的循環排列。保存較好的beta-筒體結構的熒光蛋白,耦合到由這些探頭,表現出複雜的翻譯後修飾生色團成熟模式乍表明主要插入到主多肽骨幹會防止熒光。然而,幾個突變體製定了 (見圖 6),保險絲的原始羧基 (C) 和氨基酸 (N) 總站與短的間隔和創建新的客人蛋白融合的每桶結構內的位置。雖然對標準的熒光蛋白有點改變允許融合的性質和循環置換變形的屬性,這些新的設計提供一個獨特的機會,以生成本地化探頭和生理指標的原始類。

原 EYFP 分子被表示為一幅漫畫,畫在圖 6 (a) 以顯示與羧基和氨基總站表示為紅絲帶的黃桶。一種串聯融合產品的 EYFP 與另一種蛋白 (由一個紋理的球體表示) 圖解圖 6 (b),在和 EYFP 插入一個拆分蛋白域所示圖即可得到。在總站搬遷到的一種蛋白質在原始的總站位置,隨後插入的每桶地區循環置換 EYFP 和減去插入蛋白相同的配置所示數字混亂和 6 (e),分別。在圖 6 中的最後三個漫畫 ((f) (g) 和 (h)) 說明插入的一種融合蛋白在C-總站 (圖 6(f))、 拆分域的CN總站的插入 (圖 6(g)) 和測試版的一個完整的蛋白質域插入-桶骨幹 EYFP (圖 6(h))。在圖 6 中的第一次三個漫畫是標準的熒光蛋白嵌合體,而過去的 5 是隨時可以使用環狀排列的變形構造的可能性。

雖然潛在的其他水母維多利亞水螅蟲種類,黃色和綠色熒光蛋白的新發現是重要的隻有一位候選人浮出水麵為止。隔離的Phialidium水母,一種蛋白質稱為phiYFP據報道,證明非常明亮的黃色熒光 (吸收和發射在 525 和 537 納米,分別),並可用於 N-端融合標簽。PhiYFP 的一個非同尋常的特征是自然發生的蛋白質包含相同的突變位置 64 (亮氨酸),介紹了金星,增加了可折疊的效率。探頭自然也包含在位置 203,另一個網站針對修改本機的綠色熒光蛋白,導致黃色熒光的酪氨酸。這個驚人的發現,自然之間的 phiYFP 結構和轉基因的水母蛋白是相似性的蛋白質工程努力以 GFP 為目標,調整的光譜性質的療效的證明。PhiYFP 蛋白已被優化,隨機突變產生一個單體的版本而不損害的光譜性質。

定點,單體的珊瑚蟲熒光蛋白從Discosoma mRFP1) 的隨機突變會導致在創作中兩個單體珊瑚礁衍生物與光譜特性在水母黃色熒光蛋白質的範圍下降。命名同樣色彩豐富的水果, mHoneydewmBanana這兩個發射熒光黃色的光譜區域。MHoneydew (峰在 487 和 504 納米) 的廣泛吸收帶,使有效的激勵與氬離子激光或標準 FITC 篩選器組合。然而,同樣是廣闊的發射譜 (峰 537 和 562 納米) 尾巴到近紅外,阻礙了這種蛋白質在多色實驗中使用。此外,低消光係數、 量子產率呈現 mHoneydew 單體黃色熒光蛋白幹部的暗成員。MBanana 變量隻是兩次明亮如 mHoneydew,但功能多窄激發光譜和發射光譜 (的峰值 540 和 553 納米,分別)。因為這兩個蛋白表現出相對較差的光穩定性和 mBanana 是高度 pH 敏感,既不可能會發現偉大的事業在成像的實驗。也許這些探頭的最有前途方麵是僅僅的 mHoneydew (一個青色類型Y67W突變體) 存在演示基於色氨酸的生色團的 CFP 可以接受進一步成熟成發光波長較長的物種。

ZsYellow(原稱zFP538) 是一種黃色的熒光蛋白,在Zoanthus期間進行的搜索礁珊瑚為自然發生的綠色熒光蛋白類似物發光熒光在更長的波長區域的珊瑚蟲按鈕息肉被發現。ZsYellow 熒光發射光譜的最獨特的功能之一就是峰值 (538 納米) 幾乎中途發生那些 EGFP 之間 (508 納米) 和紅色熒光 (583 納米),提供了一個機遇探討蛋白質發光熒光在可見光的光譜中的黃色部分。ZsYellow 熒光蛋白生色團功能新穎的三環係統和肽骨幹乳溝由於賴氨酸絲氨酸生色團三肽序列中的第一個氨基酸殘基作為替代。由於獨特的生色團的母題,在 ZsYellow 中觀察到程度是共軛的中間那用 EGFP 和紅色熒光 (一個雙鍵比綠色熒光蛋白,多) 和一個小於紅色熒光,觀察哪些帳戶為定位的發射波長在黃色區域之間。ZsYellow 陳列形式四聚體的明顯的傾向時表示在體內,阻礙了這種蛋白使用作為融合夥伴為定位的調查。此外,ZsYellow 與增強型綠色熒光蛋白 (EGFP 的 25%) 相比減少的亮度水平也限製了這是記者在熒光顯微鏡 (人類的密碼子優化的版本是ZsYellow1作為商業上可用) 中的效用。然而,獨特的發射譜線輪廓的 ZsYellow,應該鼓勵尋找遺傳改變,同時要增加量子產率和消光係數,最終可能會產生高性能單體黃色熒光蛋白努力減輕形式四聚體的傾向。

提出了一種在圖 7 中是一幅拚貼畫的組蛋白 H2B 融合蛋白的證明廣大熒光蛋白顏色調色板的效用。每個嵌合體包含一個選定單體熒光蛋白序列 (mCerulean、 EGFP、 人民聖戰者組織,mCherry 和 mPlum) 融合到人類組蛋白 H2B,分離與中間鏈接器單位包含六個氨基酸組成的氨基酸序列。在圖 7 中的圖像收集,從瞬時轉染人子宮頸癌 (HeLa) 細胞後的表達的融合蛋白好幾天。細胞在不同階段的細胞有絲分裂中捕獲是明顯與所有嵌合體。雖然前期、 中期、 和後期分別描繪在麵板 (b)、 (c) 和 (d),間期是 (a) (水平方向),為所有的蛋白質在麵板中說明。這些融合蛋白是有用的有絲分裂的調查,需要與其他熒光蛋白多色成像。廣泛的有用的熒光蛋白突變體圖 7,涵蓋了整個可見光譜範圍內 (見圖 10),提供了極大的靈活性在成像的合作夥伴的選擇。

橙色的熒光蛋白質

與熒光蛋白質工程中的青色、 綠色和黃色的光譜類的數目相對較大,隻有三個探頭有迄今已開發的頻譜 (從約 555 到 580 納米) 的橙色部分中。即便如此,所有三個現有的橙色熒光蛋白,與被隔絕的珊瑚礁物種,都有可能在各種成像場景非常有用。也許最多才多藝的這些是單體的Kusabira 橙色,最初來自於蘑菇作為四聚體蛋白珊瑚石芝珊瑚黃果(在日語作為Kusabira 以示已知)。Kusabira 橙色是由定點誘變從 cDNA 克隆的珊瑚策劃通過向 N 端添加十個氨基酸。由此產生的蛋白質有吸收最大值在 548 納米 (理想為勵磁與 543 納米激光) 和發出明亮的橙色熒光在 561 毫微米。Kusabira 橙色 (縮寫為人民聖戰者組織) 單體版本是使用類似於所采用的紅色熒光,創建 mRFP1 (紅色熒光蛋白節中討論) 通過引入超過 20 通過定點和隨機誘變突變策略創建的。單體展品到四聚體類似光譜特性和有一個亮度值,類似於綠色熒光蛋白,但對酸性環境稍微更敏感。光穩定性的這個探頭,然而,是最好的任何熒光蛋白在所有的光譜類,使人民聖戰者組織長期成像實驗是最佳選擇。此外,發射譜線輪廓足夠良好分離,青色的熒光蛋白來增加 FRET 效率在生物傳感器納入人民聖戰者組織中, 和探頭是有用的多色調查相結合的青色、 綠色、 黃色和紅色熒光蛋白 (見圖 4)。

MRFP1 衍生物,利器,推導出經過四輪的定向進化屈服在 548 納米吸收和發射橙色熒光在 562 納米探針。利器變是略微亮度比 mKusabira 橙色,但已經低於 10%的光穩定性,因此嚴重損害及其應用實驗,需要重複的成像。然而,利器仍然是橙色的光譜分類中的最亮蛋白質和仍然是一個極好的選擇強度在哪裏比長期光穩定性更重要。此外,當結合綠色發光二極管的 T-藍寶石,利器是一個合適的替代 CFP YFP 蛋白質作為生成長波長傳感器 (圖 8),擔心對,可以加在其他光譜區域為多色調查熒光蛋白質。一種新型的橙色熒光蛋白質分離株Cerianthus管海葵是商業上可用 (商號cOFPStratagene) 和有類似於利器和橙色,mKusabira 的光譜特性,但像其他海葵蛋白質分離到目前為止,存在四聚體的解決方案中。亮度和光穩定性的 cOFP 有不報道這種蛋白質不能與其他橙色的熒光蛋白,直接比較,其效用將進一步限製直到它可以被轉換成一種單體。

在圖 8 中,提出了一種作為 FRET 對藍寶石和利器的熒光蛋白的結合。說明有吸收和發射譜線的兩個探針和推薦帶通過濾器的勵磁和收集 FRET 分析的熒光發射。藍寶石的發射譜和吸收譜的利器之間的重疊區域提出了一種帶有灰色填充,同時激發和發射譜流血,通過區域顯示為紅色和藍色填充,分別。應用激勵帶通濾波器中心在 395 納米 30 納米帶寬減少或有效地消除了的利器,激勵水平和 512/26-納米排放過濾器可以分析的捐助熒光發射 (藍寶石) 無汙染的信號向承兌人 (利器)。寬帶 600 80 納米承兌人篩選收集了大量的信號從低於 10%的利器流血,通過藍寶石熒光。有切對波長為 500 納米 (不說明) 二向色鏡應利用與此篩選器組合。

紅色熒光蛋白

乖巧的紅色發光熒光蛋白尋求長久以來"聖杯"的活細胞成像,主要是由於探針多色成像實驗,以及更長的激發波長產生較少的毒性和可以更為深入的探討生物組織的事實在這個光譜區域的要求。作為附加的便利,在紅色區域的可見光譜中的蛋白質大部分可以成像與常見TRITC德克薩斯州紅視場熒光篩選器設置,以及一樣便宜氦-氖 (543、 561、 594 和 633 納米) 激光共聚焦顯微鏡在。經過五年的不成功的誘變努力在水母綠色熒光蛋白的蛋白質中,第一次真正的突破發生的潛在熒光 chromoproteins 在非生物發光的珊瑚蟲珊瑚物種中發現。到目前為止,廣泛的潛在的有用的紅色熒光蛋白質有報道 (跨 580 到 630 納米的發射波長範圍),其中許多至今仍受到一定程度的強製性的第四紀結構賦予他們的物種的起源。與水母蛋白質,不同的是大多數本機和轉基因的珊瑚礁蛋白變異體成熟非常有效地在 37 攝氏度左右,大概是因為它們各自的原棲息地的不同的水溫度。

第一次的珊瑚蟲衍生熒光蛋白被廣泛調查是從海葵Discosoma 芨派生和最初被稱為drFP583,但現在通常被稱為紅色熒光一旦這種蛋白質已經完全成熟了,紅色熒光的熒光發射譜的特點 583 納米高峰而激勵譜有一個主要的高峰在 558 納米和一名未成年人峰值約 500 納米。幾個問題都是在實踐中與紅色熒光關聯。成熟的紅色熒光熒光慢慢發生和收益通過中間生色團的舞台在哪裏的熒光發射多數被認為是在綠色區域。被稱為綠色狀態,此工件已證明具有挑戰性與其他綠色熒光蛋白的組合多個標記實驗由於光譜重疊。此外,DsRed 是專性的四聚體,以融合蛋白幹擾不良特征構造,常常導致本地化質量不佳,和向窗體大蛋白聚集體在活細胞中的趨勢增加。雖然這些副作用不是重要的當探頭利用隻是作為一名記者的基因表達,DsRed 作為抗原表位標記的效用是嚴重損害。水母家族中已聘請,成功地標記數以百計的融合蛋白的蛋白質,與 DsRed 融合蛋白已經證明遠不那麽成功和常表現出毒性作用。

紅色熒光熒光蛋白的主要問題的幾個已經通過定點和隨機誘變努力克服。第二代版本的紅色熒光,稱為DsRed2,包含一係列的無聲核苷酸替換對應人類密碼子偏好和增加的成熟率的幾個內部序列變異。此外,消除的基本氨基酸殘基 (改為酸性或中性基團) 的肽氨基 DsRed2 總站在融合構建窗體集料減少蛋白質的趨勢。DsRed2 蛋白仍然形成四聚體在解決方案中,但它是更符合綠色熒光蛋白在多個標記實驗中由於增加的成熟率。與第三代的紅色熒光的突變體,還顯示峰值細胞熒光增加的亮度水平,實現了成熟時間進一步減少。紅色熒光發射從DsRed 快遞(從減商業矢量) 可以在表達式中,而大約六個小時為 DsRed2 和 DsRed 11 個小時後小時內觀察。在表達紅色熒光綠色狀態的存在不是明顯,渲染這種熒光蛋白 tetrameric DsRed 變形為多個標記實驗的最佳選擇。因為這些探測器仍預留四聚體,然而,他們有很大程度上被替換與二聚體和單體的版本和現在曆史感興趣的隻是。最近介紹了商業上可用的單體版本的 DsRed (減),但的固有亮度和光穩定性的這種探頭都報道要貧窮。

在圖 9 中所示是三個最常見的生色團結構圖案,展出由珊瑚蟲礁珊瑚的熒光蛋白,包括 DsRed、 ZsYellow 和遠紅光eq611FP (見下文)。紅色熒光生色團是與在本機的綠色熒光蛋白,發現類似的結構,但通過第二個骨幹債券來擴展共軛的 π 電子係統,以包含肽鏈中的位置 (前麵發色團) 65 的苯丙氨酸氨基酸殘基的氧化修改。此外,非同尋常的順式肽鍵的配置通過Phe65Gln66,其中α的位置之間-穀氨酰胺殘留在相同的平麵啉環係統,正好與其餘的生色團 (請注意綠色熒光蛋白的特點在此位置正常反式構型) 碳原子。獨特獨聯體取向的紅色熒光熒光,通過晶體的衍射分析證實了,是由減少空間位阻、 增強的電子離域化和增加的氫鍵鍵合,與鄰近的氨基酸殘基穩定。紅色熒光 (這是不存在的 GFP) 中的這種與眾不同的粘接配置存在暗示異構現象圍繞著這個債券可能在生色團成熟的關鍵一步。

據報綠色熒光發射瞬間發生在 ZsYellow 生色團 (圖 9) 時的酪氨酸α-β碳鍵分子氧氧化延伸的咪唑啉環係統,包括酪氨酸苯基環共軛和其段氧取代基 (類似於 GFP) 的形成。然而,分光鏡調查產生了綠色的物種由沒有前途的路線到一個不完整的熒光基團的產品,而不是真正的中間狀態形成的證據。短命 acylimine 基團的部分入手,形成黃色熒光的成熟序列,由終端氨基酸組Lys66 ,形成了一個新型的部分不飽和的六元呱啶環,同時劈的多肽骨幹 65 和 66 位置之間的攻擊。通過 x 射線衍射結構分析表明新型雜環係統位於與其餘的 ZsYellow 色 (如圖 9 所示),大約平行的平麵上的發現與提高發射波長的延長的共軛機理一致。此外,卵裂的殘留物Phe65Lys66之間的肽骨幹結果殘留 65,終端甲酰胺集團的形成,應該是可供參與氫鍵穩定熒光基團。

大量的額外紅色熒光蛋白顯示相當多的承諾已從礁珊瑚生物分離。第一次被改編為哺乳動物細胞應用之一是HcRed1,這是從Heteractis 皺海葵中分離和現在是商業上可用 (減和 Evrogen)。HcRed1 最初被來自非熒光色蛋白吸收的橙色光通過定點和隨機突變。六個氨基酸替換總共有必要創建一個紅色的熒光物種,成熟,迅速和有效地在攝氏 37 度 (吸收和發射在 588 和 618 納米,分別)。然而,類似於許多其他礁珊瑚蛋白質,產生紅色熒光 HcRed 顯示形成時表示在細菌中的預留四聚體的傾向。額外誘變的努力導致一個更光明的二聚體變形,但蛋白質單體版本尚未發現。為了生成一個物種在創建融合產品為定位研究非常有用的蛋白質,構造了串聯二聚體表達載體的 HcRed (兩個頭-尾相同副本的蛋白)。當融合到一個基因產物本身形成生物聚合物 (如肌動蛋白或微管蛋白),HcRed 串聯二聚體形成分子內締複雜 (模仿一個單體的標記),顯然不會幹擾產生嵌合體的生物活性。然而,因為整體的亮度和光穩定性的這結為姊妹蛋白相結合具有尚未得到改善,它仍然在活細胞顯微術的日常應用程序的次要選擇。

遠紅光的熒光蛋白,被稱為eqFP611 (圖 9),從分離海葵Entacmaea quadricolor ,顯示的最大的斯托克斯轉變和紅移的熒光發射波長配置文件之一 (激發和發射性能極大值在 559 和 611 納米,分別) 的任何自然發生的珊瑚蟲熒光蛋白。EqFP611 的量子產率和消光係數相結合,產量大約一樣明亮綠色熒光蛋白探針。體內熒光成熟過程中,發生在大約 12 個小時,這種蛋白質穿過綠色的中間狀態。然而,成熟以後, 可以檢測隻有一小部分的這個綠色的物種 (少於 1%)。與其他珊瑚蟲的熒光蛋白,eqFP611 有降低的趨勢,oligomerize 在低濃度下通過電泳法和單分子實驗,證明雖然濃度高,蛋白並形成四聚體。定點突變的努力產生了功能二聚體變異體的 eqFP611,和繼續的努力,最後可能會導致單體遠紅熒光蛋白從這一物種。

晶體學的研究表明,eqFP611 形式參展 222 的對稱性,這是類似於觀察到的密切相關的紅色熒光熒光蛋白,也非熒光色蛋白Rtms5的四聚體。然而,在β內-可以折疊,eqFP611 熒光采用獨特的共麵配置在其中Try64苯氧基基團是定位的反式,而不是獨聯體(如紅色熒光 ; 見圖 9) 對咪唑啉環係統。此外,三循環環係統和其取代基,大概隻有有限的流動性裏麵的蛋白,參與眾多氫鍵 (至少九個) 和各種非極性範德華力相互緊密相鄰的水分子和氨基酸殘基。擴展的疏水性蛋氨酸側鏈填充最終也是目前在 DsRed 和 Rtms5 的深口袋,熒光基團和鄰近的脂肪族的聯合的互動和芳香族氨基酸側鏈 (和水分子) 可能有助於闡明背後的不尋常的熒光性質的 eqFP611 蛋白的機理。

兩個額外礁珊瑚紅色熒光蛋白、 AsRed2JRed,商業上可用 (減和 Evrogen),但這些探頭形式 tetrameric 和二聚體的配合物,分別是,和很少使用下麵描述的單體蛋白質。AsRed2 最初作為被分離出來從Anemonia 蘇種色素蛋白,修改通過突變產生一種蛋白質,具有最大值在 576 納米吸收和發射峰在 595 納米與一個很謙虛的量子產量 (0.05)。雖然在哺乳動物細胞中的表達人類密碼子優化了蛋白質,它陳列隻有約 10 %egfp 和光穩定性的亮度水平尚未見報道。通過廣泛誘變的水母種色素蛋白產生了新型的紅色熒光標記 584 和 610 納米,其峰值吸收和發射波長分別導出了二聚體蛋白,JRed。探測器已經被證實可以產生有用的融合標簽,但不適合在原核生物由於折疊問題中的表達。JRed 大約是 25%時照亮在 560 至 580 納米區域,但可以成功地用於長期的成像實驗,當興奮 543 納米激光一樣明亮 EGFP 和展品有限的光穩定性。

真正的單體 DsRed 變種,以及蛋白質在其他珊瑚蟲的物種,從單體建築已被證明是一個困難的任務。33 氨基酸改建 DsRed 序列共需為第一代單體紅色熒光蛋白的創作。然而,這個導數陳列顯著降低的熒光發射的天然蛋白和 photobleaches 相比速度非常快,呈現比類似的單體綠色和黃色的熒光蛋白質更有用。廣泛誘變研究努力,包括新穎的技術,如迭代的體細胞變異,已成功地應用在尋求進一步減少這些潛在有效的生物探針的傾向自關聯,同時也把發射極大值對波長較長的黃色、 橙色、 紅色和遠紅光的熒光蛋白變體。結果一直改進單體的熒光蛋白的功能增加的消光係數、 量子產率和光穩定性,雖然沒有單一的變異然而已被優化,所有的標準。此外,預留 tetrameric 紅色熒光蛋白,可以通過努力來生成真正的單體變形,產生了衍生工具,克服表達問題是更符合生物學功能。

也許在這條戰線上的最壯觀的發展一直引進新的收獲來自單體紅色熒光蛋白 (mRFP1) 的熒光蛋白的通過定點突變靶向的q66 泰拳基本技法Y67生色團殘留物,已證明發揮了關鍵作用,在確定在水母蛋白的光譜特征。由此產生的單體熒光蛋白幹部表現出極大值在從 560 到 610 納米的波長和有在常見的水果,承擔類似於他們各自的熒光發射譜線輪廓的顏色的榮譽被命名。中"果"的潛在有效成員之間熒光蛋白係列,mStrawberry, mCherrytdTomato (串聯二聚體),所有的一切都有熒光發射配置文件在橙色和紅色區域的光譜。這些探測器,tdTomato,在 581 納米有橘紅色排放量最大,是最聰明和最基質在視場照明下。然而,二聚體是兩次單體的分子量。紅色蛋白質、 mCherry 和 mStrawberry (排放的峰值 610 和 596 納米,分別),有大約 50%的亮度級別和 75%的綠色熒光蛋白,但 mCherry 是比 mStrawberry 更多基質,是最佳的探頭選擇,以取代 mRFP1 為長期成像實驗。這些新的蛋白質來填補最紅移的水母熒光蛋白質 (如金星) 和眾多的報道,市麵上的寡聚珊瑚紅色熒光蛋白質之間的差距。雖然幾個這些新的熒光單體蛋白質缺乏的亮度和許多成像實驗必要的光穩定性,他們的存在令人鼓舞的是因為它橫跨整個可見光譜表明明亮,穩定,單體熒光蛋白的偶然性。

遠紅熒光蛋白

進一步延長水果蛋白質譜類通過迭代的超變已經產生了兩個新的熒光蛋白質與排放的 625 和 649 納米波長極大值,代表的第一次真正遠紅光 (從 630 到 700 納米) 轉基因探頭。最有可能有用的探測器在這雙被命名為mPlum,其中有一個相當有限的亮度值 (EGFP 的 10%),但優良的光穩定性。這個單體的探頭應與發光的青色、 綠色、 黃色和橙色區域為多色成像實驗 (見圖 11) 和作為一個生物傳感器綠色和黃色的蛋白質,例如 mEmerald (斯特距離,4.4) 和 mCitrine (斯特距離,5.0) 的夥伴 FRET 熒光蛋白在組合中有用。另一種遠紅熒光蛋白,稱為AQ143,得到了從誘變努力上分離的海葵海葵馬種色素蛋白。AQ143 的激發和發射性能的極大值分別為 595 和 655 納米和亮度是 mPlum 相媲美。不利的方麵,這種蛋白的光穩定性研究尚未見報道,它形成預留四聚體。

多色成像跨越的青色通過遠紅光波長區域的三種熒光蛋白組合介紹了在圖 11 中的熒光篩選器進行了優化。勵磁過濾器針對蔚藍、 人民聖戰者組織和 mPlum 熒光蛋白具有中心波長 425、 508,和 585 納米,分別進行優化。勵磁的所有篩選器的帶寬是 20 納米。針對同一探頭分別有 480、 564,和 675 納米的中心波長與帶寬的 40、 28 和 130 納米,排放過濾器進行優化。人民聖戰者組織激勵篩選器被為了工作繁忙,盡量減少同時激發的 mPlum。流血,通過的天藍色熒光發射入人民聖戰者組織篩選器減少的事實,人民聖戰者組織四次更亮等摩爾濃度和需要更短的曝光時間間隔的圖像捕獲。

結論

熒光蛋白發展主要推力為中心進行微調當前調色板的藍色到黃色熒光蛋白質來自水母維多利亞水母,同時發展單體熒光蛋白質發光的橙色到遠紅光區域的可見光的光譜。這些目標的進展已經取得了很大,它不是不可思議的近紅外發光的熒光蛋白織機在地平線上。在水母變形的最新努力造成新的和改進的單體探針為青色、 綠色和黃色區域,雖然為明亮、 單體,和快速成熟的紅色熒光蛋白的搜索已經產生了有希望的候選人延伸到更長的波長區域的主機。繼續的蛋白質工程的新技術,例如應用程序的非天然氨基酸和環狀排列,再加上現有的熒光蛋白應該進一步擴大顏色調色板。

複雜的相互作用的越來越多的來自海洋物種的種類繁多的熒光蛋白的生物學作用則剛剛開始被理解。光致變化到自催化的生色團,包括活化和實現,可以作為一個高度進化的光保護機製,協助這些有機體在有用耗散的高能陽光,尤其是破壞性的較短的波長,通過吸收和隨後熒光再發射的波長更長的時間和更安全。在許多情況下,這些顯著的熒光蛋白顯示很高的光穩定性和動態光誘導轉化屬性,包括共振能量轉移的施主-受主對 (甚至葉柵) 光譜進行微調。大量的光譜變種已經發現,設有排放配置文件覆蓋整個可見光譜,表明這些蛋白質分子的各種光學和生化性質將生成新的候選主機作為探頭,用於生物調查並確保獨特轉基因熒光蛋白的持續的發展。



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